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方法論記事

In Vitroでの胚着床モデルの確立

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DOI:

10.3791/66873

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2024年6月21日

 ,  ,  , 
1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, NHC Key Lab of Reproduction Regulation, Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies (SIBPT), School of Pharmacy, Fudan University, 2Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities

この記事について

サマリー

このプロトコルは、胚移植プロセスに影響を与える関連分子を評価するためのシンプルで効率的な胚移植 in vitro モデルを確立するための方法論を説明しています。

要約

胚の着床は、妊娠を成功させるための最初のステップです。胚着床のための in vitro モデルは、基礎生物学研究、医薬品開発、スクリーニングに不可欠です。この論文では、胚移植のためのシンプルで迅速、かつ高効率な in vitro モデルを紹介します。本プロトコールでは、まずマウス胚盤胞の獲得とヒト子宮内膜腺癌細胞(石川)の移植用調製物を導入し、続いてマウス胚と石川細胞の共培養法を導入します。最後に、このモデルに基づいて、17-β-エストラジオール(E2)とプロゲステロン(P4)のさまざまな濃度が胚の接着率に与える影響を評価する研究を実施しました。私たちの調査結果は、高濃度のE2 が胚の接着を有意に減少させるのに対し、プロゲステロンの添加は接着率を回復させることを明らかにしました。このモデルは、サイトカイン、薬物、着床と子宮内膜の受容性を制御する転写因子など、接着プロセスに関与する分子を評価およびスクリーニングするためのシンプルで迅速なプラットフォームを提供します。

概要

妊娠を成功させるための最初のステップである胚移植は、その生物学的基盤を理解し、不妊症の課題に対処するために重要です。しかし、倫理的な制約により、ヒト臨床胚サンプルの収集には大きな制限があり、妊娠初期におけるヒト胚と子宮内膜との間の複雑な相互作用に関する研究が妨げられています1。これらの複雑なメカニズムを深く理解することは、基礎生物学研究、創薬、およびリプロダクティブヘルスを前進させるために不可欠です。

以前のin vitroモデルでは、単層ヒト子宮内膜上皮細胞(RL95-2)2 をBeWo、JAr、Jeg-33 絨毛がん細胞などの胚性代替細胞と共培養した接着モデルが採用されていました。それにもかかわらず、細胞凝集体が大きいか小さいかによって実験の精度が損なわれる可能性があるため、70〜100μmの範囲のスフェロイドのサイズを選択することは重要でした。特に、各調製物中のスフェロイドのうち、適切なサイズ4の基準を満たしたのはわずか25%であり、胚盤胞の生理学的条件と比較して有意な差が見られました。

さらに、子宮内膜および胚盤胞の3次元(3D)培養システムは、より生理学的に関連性のある環境を提供します5が、高い技術的専門知識、細胞増殖の遅延、高いリソースコストとメンテナンスコスト、標準化の難しさ、および低い再現性6を必要とします。

このプロトコルでは、ほとんどの研究室で開発および利用できる、費用対効果が高く、迅速な胚着床のin vitroモデルを提示します。この方法の全体的な目的は、制御された環境で胚と子宮内膜との間の相互作用を研究するための信頼性と再現性のあるプラットフォームを提供することです。このモデルは、 in vitroでの胚着床の主要なイベントをシミュレートすることにより、動物モデルと臨床環境との間のギャップを埋め、より正確で的を絞った研究を可能にすることを目的としています。

胚代替物と比較して、マウス胚盤胞の使用は、in vivo胚着床プロセスのより生理学的に関連性のある表現を提供します7。また、ヒト子宮内膜腺がん由来の石川細胞株は、腺上皮と子宮内腔1の混合特性を有しており、正常な子宮内膜と同様の酵素、構造タンパク質、機能的ステロイド受容体を発現することが可能になり、胚着床のための生理学的に重要な基質を提供します。共培養システムのシンプルさと迅速性により、ハイスループットスクリーニングと薬物試験が可能になります8,9,10。堅牢で再現性のあるプラットフォームを提供することにより、この方法は、胚の着床とそれが人間の健康に与える影響についての理解を深める機会を提供します。

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プロトコル

マウスの取り扱いと実験的研究は、Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologiesの動物委員会によって承認されたプロトコルに基づいて行われました。安全手順を確保する:化学物質や生物学的材料を取り扱うときは、常に適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。

1. マウス胚の取得

注:このセクションでは、マウス胚を取得するプロセスについて説明します。成体雌マウス(6-8週齢、ハイブリッドC57BL/6およびDBA/2)は、20-25°C、湿度40-60%の12時間の明るい場所と12時間の暗い標準環境条件下で、餌と水 を自由に提供して維持しました。

  1. 雌マウスに10IUの妊娠中の牝馬の血清ゴナドトロピン(PMSG)を腹腔内に注射し、次に10IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)を42〜48時間間隔で注射します。.
  2. 各雌マウスを同等の年齢の雄と交配させ、翌朝膣栓を確認します。
    注:膣栓は、精液が膣口で固まった後に形成される淡黄色の坐剤の塊です。
  3. CO2 吸入により、膣栓で雌マウスを安楽死させます。
  4. 腹部を開き、女性器を見つけます。鉗子で卵管、卵巣、脂肪パッドを伸ばします。卵管と卵巣をハサミで切ります。次に、卵管と子宮を切断します(図1)。
  5. 得られた卵管を、M2培地をあらかじめ充填した35mmのシャーレに移します。
    注:M2培地は、インキュベーター(37°C、5%CO2)で30分間予熱する必要があります。
  6. 卵管の肥大した膨大部に25Gの針で穴を開けて、積雲-接合子複合体を解放またはつまみます(図2)。
  7. 鉗子を使用して、卵丘-接合子複合体を0.5 mg/mLヒアルロニダーゼを含むM2溶液に移し、卵丘細胞が解離するまで数分間インキュベートします(図3)。
  8. 卵移植ピペットを使用して受精卵を採取し、4 mg/mL BSAを含むM2培地で洗浄して、残留ヒアルロニダーゼ、卵丘細胞、および不純物を除去します。

2. マウス胚の in vitro 培養

注:このセクションでは、受精卵から胚盤胞までのマウス胚を in vitro で培養するプロセスについて詳しく説明します。KSOM培養マイクロドロップは、温度とガスの平衡を確保するために、24時間前に調製する必要があります。

  1. 35 mmシャーレの底に、それぞれ容量20 μLのKSOM培地を12個調製します。微小液滴を3〜5mLの鉱油で覆い(図4)、ペトリ皿を5%CO2 のインキュベーターに37°Cで平衡化します。
  2. マウス胚をM2培地からKSOM培地に移し、トランスファーピペットを使用して十分に洗浄します。
    注:このステップには、37°Cの加熱ステージを備えた実体顕微鏡が必要です。インキュベーターの外で胚を取り扱う時間を最小限に抑えます。
  3. 洗浄した胚を調製したKSOM微小液滴に入れ、5%CO2 で37°Cで4日間インキュベートします。
    注:十分な栄養を確保するために、20μLマイクロドロップあたり5〜10個の胚を培養します。
  4. サイズ(100〜130μm)、内部細胞質量(内部細胞塊は、すべて圧縮された多数の細胞で構成されている)、栄養膜細胞の数(栄養外皮は、凝集して詰まった多数の細胞で構成されている)、および増殖の程度(胚盤胞は胚の80〜100%を占める)に応じて、有利な胚盤胞を選択します。

3. 子宮内膜細胞の調製

  1. バイオセーフティキャビネット内で、ピペットを使用して1 mLの2%ゼラチンを吸引し、12ウェル培養プレートに分注します。プレートをゆっくりと回転させて、ゼラチンで底が完全に覆われるようにします。プレートを37°Cのインキュベーターに30分間置きます。その後、余分なゼラチンを吸引し、プレートの底を完全に乾かします。
  2. コーティングプロセスが完了したら、ヒト子宮内膜腺癌細胞(石川)をDMEM/F12( 詳細は材料表 を参照)、1 mMピルビン酸ナトリウム、2 mM L-グルタミン、100 μg/mLストレプトマイシン、および100 IU/mLペニシリンで培養し、ゼラチンコーティングされた12ウェルプレート(2 × 105細胞/ウェル)に播種し、24時間インキュベートします。

4. 胚の付着

  1. 共培養のために前のステップで調製した石川細胞を含む12ウェルプレートの各ウェルに、5〜15個の新鮮な胚盤胞を静かに配置します(図5)。
  2. 48時間のインキュベーション後、胚を顕微鏡で観察し、付着状態を評価します。胚の付着を観察するには、プレートをすばやく3回動かします。付着していない胚は、石川細胞の表面上で浮遊または転がる動きを示します。
  3. 式(1)を使用して胚の着床率を計算します。胚の接着率を使用して、着床効果を表します。
    胚着床率=(付着胚/着床胚の総数)×100%(1)

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結果

生殖補助医療の過程では、制御された卵巣過剰刺激(COH)が重要なステップであり、患者のエストロゲンレベルが自然周期と比較して10〜20倍以上大幅に上昇します11。このような状況を踏まえて、高血清エストロゲン濃度が新鮮胚移植時の胚着床に影響を与えるかどうかを尋ねた。この胚着床モデルに基づいて、我々は、胚着床率12に対するE2およびP4の様々な濃度の影響を研究した。飢餓処理後、石川細胞をE2(0、0.1、1、10、100 nM)またはE2とP4の組み合わせ(0-0、100-0、100-10、100-100 nM)と48時間インキュベートした。次いで、細胞をゼラチン被覆した12ウェルプレートに移し、5〜15個の胚盤胞を各ウェルに添加した。各グループは3回複製され、着床率は48時間後に決定されました。

その結果、E2 (10 nM)の生理学的濃度に近いほど、0 nM E2と比較して胚の着...

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ディスカッション

提案された胚移植のためのin vitroモデルのシンプルさと迅速さは、初期段階の薬物スクリーニングやその他の研究アプリケーションに顕著な利点を提供します。簡便なプロトコールと石川細胞株のハイスループットな性質により、特に創薬の初期段階における大規模なスクリーニングの理想的な候補となります。Liang13は、TAGLN2のノックダウンが栄養膜細胞の浸潤能力を低下させることを発見しました。Green14は、インスリン様成長因子がマウス胚-石川細胞系に基づくマウス胚盤胞の接着能力を向上させることを実証した。このモデルは、薬剤候補の迅速な評価を可能にするだけでなく、サイトカインや転写因子など、胚の着床に役割を果たす他の分子の研究も容易にする15,16。生殖生物学における胚着床の重要な意味を考えると、このモデルは、根底にあるメカニズムの理解を深め、新しい治療法を開発するために有望です。

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開示事項

著者は、宣言すべき金銭的またはその他の利益相反はありません。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金会(82171603)、上海市衛生委員会基金会(202140341)、上海市科学技術委員会(23JC1403803)、NHCおよび上海Key Labsのイノベーション推進プログラムSIBPT(RC2023-02)の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
17-β-estradiolSIGMA3301最も強力な哺乳類のエストロゲンホルモン
BD ファルコンBD353001細菌学のペトリ皿 35 x 10 mm スタイル w/堅い蓋、結晶グレードのバージンポリスチレン、滅菌
バイオセーフティキャビネットESCOclass figure-materials-1BSCAseptic Operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc
CO2 インキュベーターThermo8000DH胚培養
培養プレートCorning3506細胞培養
DMEM/F12Gibco1133032DMEM/F12 (1x), 液体 1:1,L-グルタミンと 15 mM HEPES バッファーを含む
シ胎児血清Gibco10099141ウシ胎児血清、認定、オーストラリア原産
ラチンSIGMAG9391B型、粉末、BioReagent、細胞培養に適しています
HCG南京 AibeiM2520滅菌試薬、腹腔内注射、50 IU/mL
ヒアルロニダーゼ SIGMAV900833試薬グレード 粉末 
KSOMMerckMR-020P-D(1x)、粉末、フェノールレッドなし、5 x 10 mL
L-グルタミンGibco25030081L-グルタミン-200 mM (100x)、液体
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 Medium (1x)、液体、フェノールレッド
鉱物油 シグマM8410鉱油は、さまざまな分子生物学のアプリケーションで蒸発と相互汚染を制御するためのカバー層として使用するのに適しています
ペニシリン-ストレプトマイシン、液体Gibco1514012210,000単位ペニシリン(塩基)および10,000単位ストレプトマイシン(塩基)、0.85%生理食塩水PMSGでペニシリンG(ナトリウム塩)とストレプトマイシン硫酸塩を0.85%生理食塩水
PMSG京愛北M2620滅菌試薬、腹腔内注射、50 IU/mL
プロゲステロンSIGMA5341月経周期の後半に黄体から分泌されるステロイドホルモン
ビン酸ナトリウムGibco11360070ピルビン酸ナトリウムは、一般的にグルコースに加えて炭素源として細胞培養培地に加えられます
体顕微鏡オリンパスSZX7胚回収と胚発生の観察
ウゼで利用 南 ピル 実

参考文献

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