このプロトコルは、胚移植プロセスに影響を与える関連分子を評価するためのシンプルで効率的な胚移植 in vitro モデルを確立するための方法論を説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
胚の着床は、妊娠を成功させるための最初のステップです。胚着床のための in vitro モデルは、基礎生物学研究、医薬品開発、スクリーニングに不可欠です。この論文では、胚移植のためのシンプルで迅速、かつ高効率な in vitro モデルを紹介します。本プロトコールでは、まずマウス胚盤胞の獲得とヒト子宮内膜腺癌細胞(石川)の移植用調製物を導入し、続いてマウス胚と石川細胞の共培養法を導入します。最後に、このモデルに基づいて、17-β-エストラジオール(E2)とプロゲステロン(P4)のさまざまな濃度が胚の接着率に与える影響を評価する研究を実施しました。私たちの調査結果は、高濃度のE2 が胚の接着を有意に減少させるのに対し、プロゲステロンの添加は接着率を回復させることを明らかにしました。このモデルは、サイトカイン、薬物、着床と子宮内膜の受容性を制御する転写因子など、接着プロセスに関与する分子を評価およびスクリーニングするためのシンプルで迅速なプラットフォームを提供します。
概要
妊娠を成功させるための最初のステップである胚移植は、その生物学的基盤を理解し、不妊症の課題に対処するために重要です。しかし、倫理的な制約により、ヒト臨床胚サンプルの収集には大きな制限があり、妊娠初期におけるヒト胚と子宮内膜との間の複雑な相互作用に関する研究が妨げられています1。これらの複雑なメカニズムを深く理解することは、基礎生物学研究、創薬、およびリプロダクティブヘルスを前進させるために不可欠です。
以前のin vitroモデルでは、単層ヒト子宮内膜上皮細胞(RL95-2)2 をBeWo、JAr、Jeg-33 絨毛がん細胞などの胚性代替細胞と共培養した接着モデルが採用されていました。それにもかかわらず、細胞凝集体が大きいか小さいかによって実験の精度が損なわれる可能性があるため、70〜100μmの範囲のスフェロイドのサイズを選択することは重要でした。特に、各調製物中のスフェロイドのうち、適切なサイズ4の基準を満たしたのはわずか25%であり、胚盤胞の生理学的条件と比較して有意な差が見られました。
さらに、子宮内膜および胚盤胞の3次元(3D)培養システムは、より生理学的に関連性のある環境を提供します5....
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プロトコル
マウスの取り扱いと実験的研究は、Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologiesの動物委員会によって承認されたプロトコルに基づいて行われました。安全手順を確保する:化学物質や生物学的材料を取り扱うときは、常に適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。
1. マウス胚の取得
注:このセクションでは、マウス胚を取得するプロセスについて説明します。成体雌マウス(6-8週齢、ハイブリッドC57BL/6およびDBA/2)は、20-25°C、湿度40-60%の12時間の明るい場所と12時間の暗い標準環境条件下で、餌と水 を自由に提供して維持しました。
- 雌マウスに10IUの妊娠中の牝馬の血清ゴナドトロピン(PMSG)を腹腔内に注射し、次に10IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)を42〜48時間間隔で注射します。.
- 各雌マウスを同等の年齢の雄と交配させ、翌朝膣栓を確認します。
注:膣栓は、精液が膣口で固まった後に形成される淡黄色の坐剤の塊です。 - CO2 吸入により、膣栓で雌マウスを安楽死させます。
- 腹部を開き、女性器を見つけます。鉗子で卵管、卵巣、脂肪パッドを伸ばします。卵管と卵巣をハサミ....
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結果
生殖補助医療の過程では、制御された卵巣過剰刺激(COH)が重要なステップであり、患者のエストロゲンレベルが自然周期と比較して10〜20倍以上大幅に上昇します11。このような状況を踏まえて、高血清エストロゲン濃度が新鮮胚移植時の胚着床に影響を与えるかどうかを尋ねた。この胚着床モデルに基づいて、我々は、胚着床率12に対するE2およびP4の様々な濃度の影響を研究した。飢餓処理後、石川細胞をE2(0、0.1、1、10、100 nM)またはE2とP4の組み合わせ(0-0、100-0、100-10、100-100 nM)と48時間インキュベートした。次いで、細胞をゼラチン被覆した12ウェルプレートに移し、5〜15個の胚盤胞を各ウェルに添加した。各グループは3回複製され、着床率は48時間後に決定されました。
その結果、E2 (10 nM)の生理学的濃度に近いほど、0 nM E2と比較して胚の着.......
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ディスカッション
提案された胚移植のためのin vitroモデルのシンプルさと迅速さは、初期段階の薬物スクリーニングやその他の研究アプリケーションに顕著な利点を提供します。簡便なプロトコールと石川細胞株のハイスループットな性質により、特に創薬の初期段階における大規模なスクリーニングの理想的な候補となります。Liang13は、TAGLN2のノックダウンが栄養膜細胞の浸潤能力を低下させることを発見しました。Green14は、インスリン様成長因子がマウス胚-石川細胞系に基づくマウス胚盤胞の接着能力を向上させることを実証した。このモデルは、薬剤候補の迅速な評価を可能にするだけでなく、サイトカインや転写因子など、胚の着床に役割を果たす他の分子の研究も容易にする15,16。生殖生物学における胚着床の重要な意味を考えると、このモデルは、根底にあるメカニズムの理解を深め、新しい治療法を開発するために有望です。
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開示事項
著者は、宣言すべき金銭的またはその他の利益相反はありません。
謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金会(82171603)、上海市衛生委員会基金会(202140341)、上海市科学技術委員会(23JC1403803)、NHCおよび上海Key Labsのイノベーション推進プログラムSIBPT(RC2023-02)の支援を受けて行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 17-β-estradiol | SIGMA | 3301 | 最も強力な哺乳類のエストロゲンホルモン |
| BD ファルコン | BD | 353001 | 細菌学のペトリ皿 35 x 10 mm スタイル w/堅い蓋、結晶グレードのバージンポリスチレン、滅菌 |
| バイオセーフティキャビネット | ESCO | class  BSC | Aseptic Operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc |
| CO2 インキュベーター | Thermo | 8000DH | 胚培養 |
| 培養プレート | Corning | 3506 | 細胞培養 |
| DMEM/F12 | Gibco | 1133032 | DMEM/F12 (1x), 液体 1:1,L-グルタミンと 15 mM HEPES バッファーを含む |
| シ胎児血清 | Gibco | 10099141 | ウシ胎児血清、認定、オーストラリア原産 |
| ラチン | SIGMA | G9391 | B型、粉末、BioReagent、細胞培養に適しています |
| HCG | 南京 Aibei | M2520 | 滅菌試薬、腹腔内注射、50 IU/mL |
| ヒアルロニダーゼ | SIGMA | V900833 | 試薬グレード 粉末 |
| KSOM | Merck | MR-020P-D | (1x)、粉末、フェノールレッドなし、5 x 10 mL |
| L-グルタミン | Gibco | 25030081 | L-グルタミン-200 mM (100x)、液体 |
| M2 | Merck | MR-015-D | EmbryoMax M2 Medium (1x)、液体、フェノールレッド |
| 鉱物油 | シグマ | M8410 | 鉱油は、さまざまな分子生物学のアプリケーションで蒸発と相互汚染を制御するためのカバー層として使用するのに適しています |
| ペニシリン-ストレプトマイシン、液体 | Gibco | 15140122 | 10,000単位ペニシリン(塩基)および10,000単位ストレプトマイシン(塩基)、0.85%生理食塩水PMSGでペニシリンG(ナトリウム塩)とストレプトマイシン硫酸塩を0.85%生理食塩水 |
| PMSG | 京愛北 | M2620 | 滅菌試薬、腹腔内注射、50 IU/mL |
| プロゲステロン | SIGMA | 5341 | 月経周期の後半に黄体から分泌されるステロイドホルモン |
| ビン酸ナトリウム | Gibco | 11360070 | ピルビン酸ナトリウムは、一般的にグルコースに加えて炭素源として細胞培養培地に加えられます |
| 体顕微鏡 | オリンパス | SZX7 | 胚回収と胚発生の観察 |
参考文献
- Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines. Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).
- Li, H. Y., et al. Establishment of an efficient me....
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再版と許可
