さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン

サマリー

この方法は、ヒトTリンパ球のさまざまな核組織パターンを持つタンパク質分布を評価するための免疫蛍光プロトコルと定量パイプラインを示しています。このプロトコルは、サンプル調製から始まり、フィジーでの半自動分析の実行まで、段階的なガイダンスを提供し、Google Colabノートブックによるデータ処理で終わります。

要約

転写制御などのさまざまな核プロセスは、免疫蛍光法によって識別可能な病巣として知られる個別の構造内で発生します。顕微鏡を用いて多様な細胞条件下でのこれらの病巣の動態を調査することで、細胞の同一性と機能を支配する分子メカニズムに関する貴重な洞察が得られます。しかし、異なる細胞タイプで免疫蛍光アッセイを実施し、これらの病巣の組み立て、拡散、分布の変化を評価するには、多くの課題があります。これらの課題には、サンプル調製の複雑さ、イメージングデータを解析するためのパラメータの決定、大量のデータの管理などが含まれます。さらに、既存のイメージングワークフローは、熟練したユーザー向けに調整されていることが多いため、より広範なオーディエンスへのアクセスが制限されています。

この研究では、さまざまなヒト初代T細胞タイプの核タンパク質を調査するために最適化された免疫蛍光プロトコルを導入し、関心のある任意のタンパク質と細胞タイプに合わせてカスタマイズできます。さらに、タンパク質染色が明確な病巣を形成するか、拡散した核分布を示すかにかかわらず、タンパク質染色を偏りなく定量する方法を提示します。

私たちが提案する方法は、Jythonで開発され、フィジーで実行可能な半自動パイプラインを活用して、細胞染色から分析までの包括的なガイドを提供します。さらに、データ管理を効率化するユーザーフレンドリーなPythonスクリプトを提供し、Google Colabノートブックで公開されています。私たちのアプローチは、さまざまな状況で多様な核組織化パターンを持つタンパク質の非常に有益な免疫蛍光分析を実現する有効性を実証しています。

概要

真核生物のゲノムの組織化は、エピジェネ^{ティックな修飾}1の複数の層によって支配されており、核体または凝縮物²と呼ばれる特殊なコンパートメント内で発生する可能性のあるいくつかの核機能を調整しています。これらの構造内では、転写開始³、RNAプロセシング^4,5,6、DNA修復^7,8、リボソーム生合成^9,10,11、ヘテロクロマチン制御^12,13などのプロセスが進行します。核体の調節は、相分離^{の原理14,15}に導かれて、細胞の要件に対応するために空間的および時間的次元の両方で調整されます。その結果、これらの物体は、機能部品が組み立てられ、分解され、サイズや空間分布が変化する過渡的な工場として機能します。したがって、核タンパク質の特性(体を形成する傾向やさまざまな細胞条件での空間配置など)を顕微鏡で理解することは、その機能的役割に関する貴重な洞察を提供します。蛍光顕微鏡法は、核タンパク質を研究するために広く使用されている方法であり、蛍光抗体を介してそれらを検出したり、蛍光タンパク質レ^{ポーター16,17}で直接標的を発現させたりすることができる。

この文脈では、核体は明るい病巣またはプンクタとして現れ、顕著な程度の球形性を伴い、周囲の環境と容易に区別できる^16,18。STORMやPALMのような超解像技術は、分解能の向上(最大10nm)¹⁹を提供することにより、特定の凝縮物²⁰の構造と組成のより正確な特性評価を可能にする。しかし、その利用可能性は、設備費やデータ分析に必要な専門スキルによって制限されています。したがって、共焦点顕微鏡は、分解能と幅広い使用との間の良好なバランスにより、依然として人気があります。このような人気は、焦点が合っていない光を本質的に除去することで、正確なセグメンテーションのための広範な後処理手順の必要性が減少し、研究機関で広く利用可能になり、効果的な取得時間、および一般的に効率的なサンプル調製によって促進されます。しかし、免疫蛍光アッセイを用いて多様な細胞条件でタンパク質の分布、アセンブリ、または拡散を正確に測定することは、多くの既存の方法がさまざまな分布パターンを持つタンパク質に適したパラメータを選択するためのガイダンスを欠いているため、課題を提起します²¹。さらに、結果として生じる大量のデータを処理することは、データ分析の経験が限られているユーザーにとっては困難であり、結果の生物学的意義を損なう可能性があります。

これらの課題に対処するために、免疫蛍光法の調製とデータ解析のための詳細なステップバイステップのプロトコールを導入し、さまざまな組織パターンでタンパク質染色を偏りなく定量する方法を提供することを目指しています(図1)。この半自動パイプラインは、計算解析とイメージング解析の専門知識が限られているユーザー向けに設計されています。これは、2つの確立されたフィジープラグイン、^FindFoci22 と3Dスイート²³の機能を組み合わせたものです。FindFociの正確な病巣識別機能と、3Dスイートが提供する3D空間のオブジェクト識別およびセグメンテーション機能を統合することにより、私たちのアプローチは、取得フィールドごとにチャネルごとに2つのCSVファイルを生成します。これらのファイルには、細胞あたりの病巣数、核重心からの病巣の距離、びまん性タンパク質染色に導入した不均一性係数(IC)など、さまざまなタイプのシグナル分布に適したメトリクスの計算を容易にする補完的な情報が含まれています。さらに、データ外挿は、データ処理スキルが限られているユーザーにとって時間がかかる可能性があることを認識しています。このプロセスを効率化するために、各実験で収集されたすべての測定値を1つのファイルに自動的にコンパイルするPythonスクリプトを提供しています。ユーザーは、プログラミング言語ソフトウェアをインストールしなくても、このスクリプトを実行できます。Google Colabは、ブラウザで直接Pythonスクリプトを記述できるクラウドベースのプラットフォームであるGoogle Colabで実行可能コードを提供しています。これにより、当社の方法は直感的で、すぐに使用できるものとなっています。

私たちは、ブロモドメイン含有タンパク質4(BRD4)とゼステ-12のサプレッサー(SUZ12)の2つの核タンパク質のシグナル分布の変化を分析および定量化する上で、私たちのプロトコルの有効性を実証しています。BRD4は、ポリメラーゼII依存性転写開始^24,25に関連する凝縮物を形成することが知られているメディエーター複合体内の十分に文書化されたコアクチベータータンパク質です。SUZ12は、H3K27me3ヒストン修飾^26,27の沈着を制御する役割を担うポリコーム抑制複合体2(PRC2)のタンパク質成分である。これらのタンパク質は、2つの異なる細胞型内で異なるパターンを示します:静止状態で転写活性の速度が遅い、新たに単離されたヒトCD4⁺ナイーブT細胞と、転写の増加を示す特殊な増殖エフェクター細胞であるin vitro分化T_H1 CD4⁺細胞です²⁸。

プロトコル

研究目的でのヒトサンプルの使用は、Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milan) の倫理委員会によって承認され、すべての被験者からインフォームド コンセントが得られました (承認番号: 708_2020)。このプロトコールは、免疫蛍光法の実行、画像取得、および画像解析の3つの主要なセクションで構成されています。平均して、完了するまでに4営業日かかります(図1)。

1. 免疫蛍光法の調製

注:この免疫蛍光プロトコルは、固定および透過化条件を調整することにより、さまざまな細胞タイプおよびタンパク質ターゲットに対して容易にカスタマイズできます。免疫蛍光染色の調製は、通常、完了までに3日未満で完了し、一次抗体のインキュベーション期間は抗体の品質と標的タンパク質によって異なります(図1)。

1. サンプル調製
   1. 製造元の指示に従って、密度約1.077 g / mLの培地を介した密度勾配遠心分離により、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を単離します(材料表)。
   2. 製造元の指示に従って、磁気ビーズを使用してPBMCからCD4⁺ T細胞を単離します(材料の表)。
   3. CD4、CD45RA、およびCD45ROに対する抗体で細胞を染色し(材料表)、他の場所で説明したように、ナイーブCD4⁺ T細胞をCD4⁺/CD45RA⁺/CD45RO^-細胞としてFACS選別を進めます^29,30。
      注:このプロトコルで使用されるFACSソーターの仕様については、 材料の表 を参照してください。
   4. ²⁹に記載されているように、ナイーブCD4⁺ T細胞のヘルパーTヘルパー1(T_H1 CD4⁺細胞)への分化を誘導する。簡単に説明すると、FACSで選別したナイーブCD4⁺ T細胞_を1.5x 10⁶細胞/mLで培養し、抗CD3/抗CD28磁気ビーズで1:1の比率で刺激します。細胞をカウントし、2〜3日ごとに1.5 × 10⁶細胞/ mLに達したら分割します(T_H1培地組成については表1を参照)。
   5. ²⁹で説明されているように、分化の7日後のエフェクター機能サイトカインの分泌を評価します。
2. 細胞の固定と透過化
   注:これらの手順はすべて^、30,31に説明されており、若干の適応があります。
   1. 最適な細胞接着を確保するには、ガラスカバースリップ(10 mm、厚さ1.5 H)をコーティング溶液(表1)で次のように処理します。
      1. ガラスカバースリップを最初に蒸留水(ddH₂O)で洗浄し、次に70%エタノール(EtOH)ですすぎ、風乾させて洗浄します。
      2. 洗浄したカバースリップをステップ1.2.1.3-1.3の24マルチウェルプレートに入れます。
      3. 200μLのコーティング液をガラスカバースリップに一滴塗布します。5分後、ドロップを取り出して自然乾燥させます。
      4. 200μLのddH₂Oを一滴塗布してカバースリップを洗浄します。5分後、ドロップを取り出して風乾します。
      5. 手順1.2.1.3-1.2.1.4を3回繰り返します。
   2. ナイーブなCD4⁺ T細胞およびT_H1 CD4⁺ 細胞を1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に2×10⁶ 細胞/mLの濃度で再懸濁します。
      注:示された濃度は、ヒト初代Tリンパ球などの小細胞に特に推奨されます。接着性細胞の場合、ガラスコーティング処理は不要です。代わりに、適切な細胞培養培地を使用して、ガラス表面上で細胞を直接増殖させます。
   3. セル懸濁液を200 μL滴下してガラスカバースリップに塗布します。細胞を室温(RT)で30分間播種します。次に、ドロップを取り除きます。
   4. 新たにろ過した3%パラホルムアルデヒド(PFA溶液、 表1)で細胞を室温で10分間固定します。
   5. ガラスカバースリップをTPBS(表1)でRTで3 x 5分間洗浄します。
   6. TPBSを除去し、透過化溶液(表1)を室温で10分間添加します。
   7. 透過処理溶液を廃棄し、サンプルを保存溶液(表1)で1時間から4°Cで一晩(ON)インキュベートします。
      注:この段階では、プロトコールを安全に停止することができ、ガラスカバースリップを24マルチウェルプレート中の保存溶液中で3〜4週間保存することができる。
3. 免疫蛍光
   1. (オプション)24マルチウェルプレートからカバースリップを取り外し、ドライアイスで30秒間急速に凍結し、RTで解凍した後、保存溶液でプレフィルドウェルでガラスカバースリップを洗浄します。
   2. (オプション)手順1.3.1を3回繰り返します。
   3. 透過化溶液中でRTで5分間洗浄します。次に、RTでTPBSを使用して2 x 5分間洗浄します。
   4. 0.1 N HClで室温で12分間インキュベートします。
   5. 1x PBSで2回のクイックウォッシュを行います。
      注:凍結融解ステップやHCl処理など、指定された細胞透過化条件は、クロマチンが密集している細胞の核成分を染色するのに最適です。ただし、クロマチンの圧縮が少ない細胞を扱う場合は、これらのステップを減らすか回避することをお勧めします。さらに、細胞質成分を標的とする場合は、HCl処理を削減または排除することを検討してください。
   6. 一次抗体(BRD4、1:500、またはSUZ12、1:100)を抗体希釈バッファー(表1)(ガラスカバーガラス各枚につき200 μL)で希釈し、4°Cで細胞をインキュベートします。
      注:免疫蛍光法は、実験ニーズ、二次抗体、および検出システムに応じて、複数の一次抗体をマルチプレックス化することで実施できます。
   7. RTでPBS-T(表1)で3 x 5分間、軽く振って洗浄します。
   8. 抗体希釈バッファー(ガラスカバーガラス各紙あたり200 μL)で希釈した二次抗体と室温で1時間、細胞をインキュベートします。
      注:実験のニーズと利用可能な検出システムに最も適した二次抗体を選択してください。各二次抗体は、一次抗体が由来する分子種を標的としていることを確認してください。さらに、顕微鏡のフィルターおよび光源に適合する蛍光色素を選択してください。選択した蛍光色素と核染色剤の発光スペクトルとの間のスペクトルの重複を避けることが重要です。
   9. RTでPBS-Tで5分×3分、軽く振って洗浄します。
   10. 1 ng/mLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を1x PBSで希釈し、室温で5分間染色します。
       注:代替色素は、二次抗体の発光スペクトルと重ならない限り、核染色に使用できます。
   11. 1x PBSで数回のクイックウォッシュを行います。
   12. ガラスカバースリップを、色あせ防止封入剤を使用した顕微鏡スライドに取り付けます。

2. 画像取得

注意: 画像取得の持続時間は、機器と選択した設定によって異なります。

1. 共焦点顕微鏡の取得
   1. 共焦点顕微鏡を使用して3D画像をキャプチャし、zで0.25μmのステップサイズと0.1〜0.2μmのピクセルサイズを設定します。
      注:63x 1.4 NAオイル対物レンズで光回折制限の最適な解像度を達成するために、ピンホールサイズを0.8 AU、ライン平均の2倍、フレームサイズを1024ピクセル×1024ピクセルに設定しました。励起レーザーとチャネル取得シーケンスは、使用されている蛍光色素間の干渉やクロストークを防ぐために意図的に選択されました。ただし、パラメータの調整は、特定の顕微鏡と試料の特性に合わせて調整する必要があります。このプロトコルで使用される共焦点顕微鏡の仕様については、 材料表 を参照してください。
   2. 生物学的複製ごとに約50個の細胞を包含するランダムなフィールドを一定数取得します。

3. 画像解析

1. ソフトウェアのインストール
   1. フィジーの公式ダウンロードページ(https://imagej.net/software/fiji/downloads)から利用可能な最後のバージョンのフィジーをダウンロードしてインストールします。
   2. フィジーの更新サイトから3D Suiteをインストールするか、3D SuiteのWebサイト(https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download)の指示に従って手動でインストールします。
   3. GDSC(FindFoci)は、フィジーの更新サイトからインストールするか、GitHubリポジトリ(https://github.com/aherbert/gdsc)の指示に従って手動でインストールします。
2. TIFF変換
   1. 「convert_to_TIFF.py」スクリプト(補足ファイル1)をダウンロードします。
   2. スクリプトをフィジーにドラッグアンドドロップし、コードを実行します。
   3. 表示されるパネルで、実験が保存されているパスを参照します。変換された TIFF ファイルを含むサブフォルダは、同じ実験フォルダに作成されます。
3. 3D Managerで設定を初期化します。
   1. 「プラグイン」 | 「3DSuite」 | 「3D マネージャーオプション」をクリックして、3D マネージャーオプションパネルを開きます。
   2. 3D Managerオプションウィンドウで、ボリューム(単位)、平均グレー値、バウンディングボックス(pix)、標準偏差グレー値、重心(pix)、および重心(単位)の測定値に対応するチェックボックスを選択します。
   3. 次のオプションにチェックを入れます: エッジXY上のオブジェクトを除外 するおよび エッジZ上のオブジェクトを除外 するオプションを選択し、 OKをクリックします。
      注: この手順は、空間情報ファイルと定量的情報ファイルに保存されるメトリックを最初に構成するために 1 回だけ実行する必要があります。選択したメトリクスは、パイプラインが適切に機能するために不可欠です。この手順には、ディスカッションのセクションで詳しく説明されているように、オプションの追加メトリックを含めることができます。
4. FindFoci GUI でパラメータを設定します。
   注: この手順は、最適なパラメーターを使用して半自動パイプラインを構成するために 1 回だけ実行する必要があります。その後、スクリプトに組み込まれます。
   1. テスト画像を開きます。スタックを含むタンパク質チャネルを複製し(Ctrl + Shift + D)、 hyperstack チェックボックスをオンにし、 Channels(c) ボックス内で適切なチャネル番号を指定し、それに応じて名前を変更します。
   2. フィジーマクロレコーダーを起動するには、[ プラグイン] |マクロ |レコード。
   3. FindFoci プラグインを開きます ([プラグイン] |GDSCの |フィンドフォックス |FindFoci GUI)をクリックし、[Image]ドロップダウンメニューから分析する画像を選択します。
   4. パラメータを次のように設定します(図2A):ガウスぼかし= 1.5;バックグラウンドメソッド= 平均以上のSD;背景パラメータ= 9;検索方法 = ピークの割合 - バックグラウンド検索パラメータ = 0.7;ピーク法 = 背景上の相対値;ピークパラメータ= 0.2;最小サイズ = 5;最大ピーク = 1,000,000。
      注:示されているパラメータは、当社のケーススタディに基づいて選択されたものであり、他の染色手順には適していない場合があります。
   5. 病巣の識別を強化するには、次のパラメーターを調整します。
      1. ガウスぼかし は、焦点をより適切にセグメント化するためのスムージングの程度を定義します。焦点の直径(ピクセル)に近づけてください。
      2. Background パラメータは、背景と焦点信号を区別するためのしきい値を設定します。値を増やして、より厳しいしきい値を課します。
      3. Search param は、シグナル認識に含まれるピークからの蛍光の割合を定義します。蛍光ピークから遠い領域を含めるには、値を小さくします。
      4. ピークパラメータは、2つの信号ピークが連続的であるか分離していると見なされる程度を決定します。値を小さくすると、ピークが分離します。
      5. Max peaks は、識別可能な焦点の最大数を指定します。画像内のすべての焦点を含めるには、大きな数値を設定します。
   6. FindFoci を実行し 、レコーダー ウィンドウに表示される文字列 (ステップ 3.4.2、 図 2B) で、選択したパラメーター (引用符を除く) をコピーします。設定に関連する詳細については、プラグインマニュアルの説明 ²²を参照してください。
5. 核タンパク質定量パイプライン
   1. スクリプト「nuclear_prot_q.py」(補足ファイル2)をダウンロードします。
   2. スクリプトをフィジーにドラッグアンドドロップし、[実行]をクリックしてコードを実行します。
   3. 表示されたダイアログボックスの指示に従って、画像を処理します。
      1. 核チャネル:DAPI(または任意の核染色)のチャネルに対応する番号を入力します。
      2. Nucleus Gaussian Blur: セグメンテーションのために画像をぼかすために必要な sigma の値を入力します。
         注:このパラメータは、原子核の直径(つまり、 5〜6μm)に近づけてください。不均一な染色には、より高いシグマ値が示されています。
      3. タンパク質チャネル:目的の染色のチャネルに対応する番号を入力します。
      4. FindFoci パラメーター: マクロ記録ステップから取得した文字列をパッセージ 3.4.6 に貼り付けます (図 2B)。
      5. (オプション) 品質管理:セグメント化された原子核の品質を確認します。これにより、スクリプトが一時停止し、生成された各核対象領域 (ROI) を手動でチェックできるようになります。
      6. 画像ディレクトリを選択: 「参照 」ボタンをクリックして、分析対象のTIFFファイルを含むフォルダに移動します。
   4. すべてのボックスがコンパイルされたら、[ OK ] をクリックして実行を続行します。
   5. 核が正しくセグメント化されておらず、品質要件を満たさない場合は、 図 2C に示すように、核を削除または変更します。
      1. ROIManager3DウィンドウでROIリストを確認します。リストが空の場合は、マージ ウィンドウを選択し、[3D の定量化] をクリックしてマネージャーを更新します。次に、Quantify 3D 結果テーブルを閉じます。核チャネルを選択し、「Live-ROI」をクリックしてオンにします。
      2. 同じ核に属するROIを選択して Merge を押すか、不要な核の場合は Delete を押します。
      3. 「すべて選択」をクリックし、「マスク・チェック」ウィンドウで「OK」をクリックして解析を続行します。
      4. 結果については、ステップ3.5.3.6で示されたファイルパス内の Quantificationフォルダー に、分析に使用されたパラメーターのレコードを含むtxtファイルがあります。
6. Google Colab のパイプライン
   1. 「final_nuclear_protein_metrics.ipynb」ノートブック(補足ファイル3)をダウンロードします。
   2. Google Colab(https://colab.research.google.com/)でノートブックを開きます。
   3. 各画像フィールドの.csvファイルを含むすべてのフォルダをGoogleドライブの任意のフォルダにアップロードします。
   4. ノートブックで、結果サブフォルダーが格納されているフォルダーのパスを指定し、すべてのセルを実行します。コードのコンパイルが完了すると、コンパイルされたすべてのデータを含む最終的なスプレッドシート ファイルが、.csv ファイルがアップロードされたのと同じフォルダーに作成されます。

結果

この方法に概説されているプロトコルは、ヒト初代T細胞内の核タンパク質染色の変化の可視化と定量化を容易にし、多様な細胞タイプやタンパク質ターゲットに合わせてカスタマイズすることができます。ケーススタディとして、ナイーブ細胞とT_H1 CD4⁺ 細胞におけるBRD4およびSUZ12の染色を行い、解析しました。

BRD4は、静止ナイーブ細胞と分化したT_H1 CD4⁺細胞の両方で良好な点線の染色パターンを示し、両方の細胞タイプの病巣同定に設計されたパラメーターの使用を可能にします(図3A)。当社のパイプラインでは、核内のBRD4病巣の数、体積、蛍光シグナル(平均蛍光強度(MFI)として表される)、カバレッジ、空間配置など、さまざまなパラメータの定量化が可能です(図3B-F)。さらに、核体積に占める病巣の割合を決定する自動計算を導入し、核サイズの異なる細胞間での比較を容易にしました(図3E)。

最後に、核中心からの病巣の距離をマッピングするオプションを提供し、病巣の核位置を理解するのに役立てました(図3F)。定量から得られた結果は、_{T H}1細胞と静止期CD4⁺ T細胞との間のBRD4病巣の顕著な変化を強調しており、病巣の数、サイズ、輝度、体積の増加、およびそれらの分布と局在の違いが含まれます。これらの知見は、静止期のT細胞と比較して、活性化/増殖するT細胞の転写活性が高いことと一致しています²⁸。

これに対し、SUZ12は凝縮水の生成に関与しません。私たちの研究では、2つの細胞状態間でSUZ12の染色パターンに有意な差が観察されました:ナイーブT細胞の点状パターンは、T_H1 CD4⁺ 細胞のびまん性パターンに移行します(図4A)。このタンパク質挙動の大幅な変化は、T_H1 CD4⁺ 細胞におけるドット同定がほとんど成功していないため、同一のパラメータを使用した病巣の特徴の比較可能性を妨げます(図4A)。一般に、異なる細胞条件間で免疫蛍光染色を比較する際には、取得パラメーターと分析パラメーターの両方で一貫性を保つことが推奨されますが、目的のターゲットに大きな変化が生じた場合は調整が必要になります。

この特定のシナリオでは、 図4Bに示すように、背景パラメータの調整、ガウスぼかし、検索パラメータ(プロトコルステップ3.4.5で提案)など、さまざまなパラメータの組み合わせを試したにもかかわらず、FindFociは、タンパク質の固有の分布特性のために、真のシグナルピークと重要でないシグナルピークを区別するのが困難です。さらに、核MFIのような従来の測定は、信号分布の変化を考慮していないため、誤解を招く可能性があることを強調しています(図4C)。

したがって、このような変化を測定するために、このプロトコルで導入したタンパク質拡散を特徴付ける指標である変動係数、 不均一性係数 (IC)の使用をお勧めします。このICは、T_H1 CD4⁺ 細胞におけるSUZ12病巣の拡散を正確に捕捉し、誤ったセグメンテーションアプローチでそれらの同定を強制することはありません( 図4Dを参照)。最後に、両方の細胞条件に均一に分布するDAPIをコントロールとして使用することにより、このパラメータの有効性をさらに検証します(図4E)。

図1:免疫蛍光染色の調製とデータ解析の概略図。 核タンパク質免疫蛍光染色の染色および解析のためのプロトコールは、サンプル調製、画像取得、および解析の3つの主要なフェーズで構成され、約4営業日にわたって行われます。このスクリプトは、核セグメンテーションを行う 3D Suite と、タンパク質チャネルを処理する FindFoci の 2 つのプラグインを利用します。病巣と核に関する空間的および定量的な情報は、別々のcsvファイルに収集されます。Google Colab で実行可能なスクリプトは、原子核のバウンディングボックスを使用して病巣測定値と対応する原子核をリンクし、収集されたデータに基づいて派生した測定値を計算します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:核タンパク質定量パイプライン設定の表現(A)病巣同定のパラメータを示すFindFociポップアップウィンドウ(プロトコルセクション3.4.3)。(B)FindFociの選択したパラメータを記録するマクロを表すポップアップウィンドウ。コピーされた文字列は、スタートアップウィンドウ内に貼り付けられます(プロトコルステップ3.4.6-3.5.3.4)。(C) 3Dマネージャを使用して関心のある核領域を手動で除去または変更するための核セグメンテーション品質管理ステップを示すパネル(プロトコルステップ3.5.5.1-3.5.5.3)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:BRD4病巣解析に基づく異なる細胞条件間の比較(A)ヒト初代ナイーブCD4⁺ T細胞およびT_H1 CD4⁺細胞におけるBRD4(灰色)の免疫蛍光染色の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像。核はDAPI(青)で対比染色されています。元の倍率63倍。スケールバー = 5 μm。下、パイプラインによって識別されたBRD4病巣は、白い矢印でマークされ、黄色で対抗されています(下)。(B)ナイーブ細胞_およびTH1CD4⁺細胞(n = 2個体)のBRD4病巣数/核を表す箱ひげ図。(C)ナイーブおよび_{T H}1 CD4⁺細胞(n = 2個体)におけるBRD4病巣の体積(μm³)の箱ひげ図。(D)ナイーブ細胞およびT_H1 CD4⁺細胞(n = 2個体)におけるBRD4病巣の病巣MFIの箱ひげ図表現。(E)全原子核体積(n = 2個体)に対するBRD4病巣が占める核体積の割合を表す箱ひげ図。(F)BRD4病巣の核重心から核周辺までの距離周波数の表現(n = 2個体)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:不均一性係数、SUZ12免疫蛍光シグナルの点状から分散パターンへの遷移を定量化するための指標 (A)ヒト初代ナイーブCD4⁺ T細胞およびT_H1 CD4⁺ におけるSUZ12(マゼンタ)の免疫蛍光染色の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像細胞。核はDAPI(青)で対比染色されています。元の倍率63倍。スケールバー = 5 μm。下には、パイプラインによって識別されたSUZ12病巣が白い矢印でマークされ、オレンジ色(B)で対抗されています。T_H1 CD4⁺ 細胞における誤った病巣同定の例は、白い矢印とオレンジ色のマスクで示し、2つの異なるパラメータ設定で示しています。(C)ナイーブ細胞およびT_H1 CD4⁺ 細胞(n = 2個体)におけるSUZ12の核MFIの箱ひげ図。(D)ナイーブ細胞およびT_H1 CD4⁺ 細胞(n = 2個体)におけるSUZ12 ICの箱ひげ図。(E)ナイーブ細胞とT_H1 CD4⁺ 細胞(n = 2個体)におけるDAPI ICの箱ひげ図。略語:DAPI= 4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;MFI = 平均蛍光強度;IC = 不均一性係数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

解決	組成		コメント/説明
TH 1ミディアム	RPMI、GlutaMAX-I、10%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)、1%(v / v)非必須アミノ酸、1 mMピルビン酸ナトリウム、50 IU / mLペニシリン、50 μg / mLストレプトマイシン、20 IU / mL組換えIL-2、10 ng / mL組換えIL-12、2 mg / mL中和抗IL-4。		ステップ 1.1.4.
コーティングソリューション	0.1% ポリ-L-リジン ddH2O		ステップ 1.2.1.
PBS-Tの	1x PBS/0.1% TWEEN 20 pH 7.0		ステップ1.3。
固定用PFA溶液	0.1% PBS-TWEENで希釈した3%パラホルムアルデヒド(PFA)		ステップ 1.2.4.
TPBSの	0.05% Triton X-100 を 1x PBS で希釈		ステップ1.2.、1.3。
透過化ソリューション	0.5% TPBSを1x PBSで希釈		ステップ1.2.、1.3。
ストレージソリューション	20%グリセロール/ 1x PBS		ステップ1.2.7.、1.3.1。
抗体希釈バッファー	0.1% PBS-TWEEN/2% ヤギ血清/1% BSA		ステップ 1.3.6.、1.3.8.

表 1: このプロトコルで使用されるメディアとバッファーの構成。

補足ファイル1:「convert_to_TIFF.py」。 このファイルには、任意の画像ファイル(ND2、LIFなど)を正確な定量化プロセスに必要なTIFFファイルに変換するためのスクリプトが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:「nuclear_prot_q.py」。 このファイルには、少なくとも2つのチャネル(核染色、核タンパク質染色)を含む画像を測定および定量化できるスクリプトが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3: "final_nuclear_protein metrics.ipynb"。 このファイルには、"nuclear_prot_q.py" の出力を入力として使用して、関連するすべてのパラメーターの概要を抽出して 1 つの Excel ファイルにコンパイルする Jupyter ノートブックが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

本研究では、ヒトTリンパ球の核タンパク質に対する免疫蛍光実験を行う方法を紹介します。この方法は、前述のように、固定および透過化ステップのわずかな変更を通じて、さまざまな細胞タイプで使用するための柔軟性を提供します^30,31。

当社のイメージングワークフローは、文献、特にFindFociと3D Suite^22,23で概説されている確立された技術に基づいています。以前の出版物とは異なり、フィジーに統合された実行可能なJythonコードを提供し、半自動パイプラインを実現し、細心の注意を払ったパラメータ追跡と視覚的な品質チェックを可能にします。特に、プロトコルセクション3.5.3.5で核セグメンテーションの品質を調節するオプション機能を導入し、プロトコルセクション3.5.5で修正ステップを実装しました。Google Colabのスクリプト実行可能ファイルを使用すると、ユーザーは包括的な測定値を取得し、特定の生物学的シナリオに最適な測定値を選択できます。

提供される解析パイプラインはJython(Java + Python)で記述されており、実行にはFijiのインストールと、3D SuiteとFindFociの2つの異なるプラグインが必要です(図1)。パイプラインは、TIFF形式への画像変換と、原子核のセグメンテーションを強化するためのガウスぼかしフィルターを使用した原子核を含むチャネルの前処理から始まります。3D Suiteは、i)核体積、重心、バウンディングボックスの座標(オブジェクトを囲み、焦点を右核に関連付けるために使用される最小のボックスを表す)などの 空間情報と、ii)MFIや信号の標準偏差などの 定量的情報の両方をキャプチャするように指示します。その後、パイプラインは FindFoci を使用して病巣信号の局所的な最大値を特定し、グローバルしきい値処理法 (多くの場合、ユーザーの裁量に依存し、精度に欠ける可能性がある) への依存を排除し、病巣に関連する空間情報と量的情報の両方を記録します。したがって、出力フォルダーには、チャネルごとに 2 つの CSV ファイルが含まれ、空間的 (M_.csv) メトリックと定量的 (Q_.csv) メトリックが含まれます。

収集および取得されたすべての測定値を含む最終ファイルは、Google ColabでPythonスクリプトを実行することによって生成されます。このファイルには、原子核あたりの病巣数、病巣 MFI、不均一性係数 (IC)、核 MFI、核重心からの病巣距離、占有核体積の割合などの指標が含まれています。画像1枚あたりの処理時間は、視覚的な品質管理ステップを含めて約1分と見積もっています。この処理時間は、免疫蛍光設定と分析パラメータの最適化により、さらに短縮できます。

このパイプラインは、良好な点線パターンと拡散パターンの両方を示す核タンパク質のパラメーターを計算し、ユーザーが最も適切なパラメーターを選択できるようにします。不均一性係数を利用して、タンパク質病巣の溶解を説明することをお勧めします。

フォーシーを適切に特定するための重要なステップには、本物の信号ピークとバックグラウンドノイズを区別するためのパラメータの設定が含まれます。パイプラインを実行する前に、ランダムな画像に対して徹底的なテストを行うことが重要です。私たちの研究は主に単一チャネルに焦点を当てていますが、パイプラインは免疫蛍光実験でさまざまなタンパク質を標的とするさまざまな色素の組み合わせの導入をサポートします。複数のチャンネルの同時解析はサポートされていないため、チャンネルごとに個別に実行する必要があります。さらに、このプロトコルでは特定の測定値を提示することを選択しました。ただし、蛍光シグナルの絶対変化を評価するための統合強度や、真円度やコンパクト性などの物理的パラメーターなどの追加のメトリクスも、セクション3.3.2のパイプラインに組み込むことができます。現在このパイプラインに統合されていないメトリクスを含めるには、それらを最終的なメトリクスファイルに統合するためのPythonプログラミングに習熟している必要があります。それ以外の場合は、空間情報ファイル(「M_.csv」)および定量的情報ファイル(Q_.csv)に自動的に含まれます。

このパイプラインのタイミングは、画像のサイズと量、解析ごとのチャンネル数、顕微鏡の設定などの要因によって異なります。さらに、マシンのパフォーマンスは実行時間に影響を与え、視覚的なステップによってプロセスが遅くなる可能性があります。

共焦点顕微鏡は貴重な洞察を提供しますが、観察された核構造やタンパク質病巣の精度を制限する可能性のある回折限定の技術であることは注目に値します。解析の頑健性を高めるために、検査する核と生物学的サンプルの数を増やすことをお勧めします。解析される核の数が増えると、分解能の制限に関係なく、核の形態やタンパク質分布の顕著な変化がより明らかになります。

将来の潜在的なアプリケーションの観点から、この方法は、さまざまな細胞タイプおよび染色プロトコルに対する汎用性と適応性を示します。例えば、電離放射線誘起病巣(IRIF)の正確な定量がDNA損傷の直接的な指標として役立つ放射線生物学実験で容易に利用することができる³²。私たちの主な重点は核分析にありますが、プロトコールは、細胞質色素を組み込み、スクリプト内の核チャネルをそれに置き換えることで簡単にカスタマイズできます。さらに、この解析は、DNAやRNA FISH^30,31などの他の実験方法論にシームレスに統合でき、核トポロジー解析のデフォルトパラメータを活用します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL Safe-Lock Tubes	Eppendord	#0030121503	プロトコルセクション 1
10 mL Serological pipettes	VWR	#612-3700	プロトコルセクション 1
20 µL バリアピペットチップ	Thermo Scientific	#2149P-HR	プロトコルセクション 1
50 mL ポリプロピレンコニカルチューブ	Falcon	#352070	プロトコルセクション 1
200 µL型バリアピペットチップ	Thermo Scientific	#2069-HR	プロトコルセクション1
退色防止液 - ProlongGlass - mountingmedia	Invitrogen	#P36984	ステップ1.3.12
BSA(ウシ血清アルブミン)	シグマ	#A7030	ステップ1.3.6.、1.3.8.
CD4+ T 細胞分離キット	Miltenyi Biotec	#130-096-533	ステップ 1.1.2.
DAPI(4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)	Invitrogen	Cat#D1306	Step 1.3.10.
ドライアイス			ステップ 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead	Life Technologies	#1131D	磁気ビーズステップ 1.1.4.
EtOH	カルロエルバ	#4146320	ステップ1.2.1.1。
FACSAria SORP	BD Bioscences		ステップ1.1.3。BD FACSを搭載Diva Software version 8.0.3
FBS(Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	#10270106	Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS	Euroclone	GEH17144003F32	Step 1.1.1.
FIJIバージョン2.14.0	-		プロトコルセクション3
カバースリップ(10ミリメートル、厚さ1.5 H)	電子顕微鏡科学	#72298-13	ステップ1.2.1。
グリセロール	シグマ	#G5516	ステップ1.2.7-1.3.1。
ヤギ抗ウサギAF568二次抗体	Invitrogen	A11036	ステップ1.3.8。
HCl	Sigma	#320331	ステップ 1.3.4.
人間中和抗IL-4	Miltenyi Biotec	Cat#130-095-753	ステップ1.1.4。
ヒト組換えIL-12	Miltenyi Biotec	Cat#130-096-704	ステップ1.1.4。
ヒト組換えIL-2	Miltenyi Biotec	Cat#130-097-744	1.1.4。
ライカTCS SP5 共焦点顕微鏡	ライカマイクロシステム	ズ-	プロトコルセクション2、HCX PL APO 63x、1.40 NA油浸対物レンズを装備し、さらに3倍ズームを装備。ピンホールサイズ:0.8AU。ライン平均2×。フレームサイズ1024×1024ピクセル。
MEM非必須アミノ酸溶液	Life Technologies	#11140035	Step 1.1.4.
顕微鏡スライド	VWR	#631-1552	ステップ 1.3.12.
マウスモノクローナル抗ヒトCD4 APC-Cy7 (RPA-T4クローン)	BD Bioscience	#557871	Step 1.1.3.
マウスモノクローナル抗ヒトCD45RA PECy5 (5H9クローン)	BD Bioscience	#552888	Step 1.1.3.
マウスモノクローナル抗ヒトCD45RO APC (UCHL1クローン)	Miltenyi Biotec	#130-113-546	Step 1.1.3.
マルチウェル 24 ウェル	Falcon	#353047	プロトコル セクション 1
正常ヤギ血清	Invitrogen	PCN5000	ステップ 1.3.6., 1.3.8.
PBS	Life Technologies	#14190094	プロトコルセクション 1
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液	Life Technologies	#15070063	ステップ 1.1.4.
PFA	Sigma	#P6148	ステップ 1.2.4.
poly-L-リジン	Sigma	#P8920	1.2.1.
一次抗体 - BRD4	Abcam	#ab128874	Step 1.3.6.
一次抗体 - SUZ12	Cel Signalling	mAb #3737	Step 1.3.6.
RPMI 1640 W / GLUTAMAX-I	Life Technologies	#61870010	ステップ1.1.4。
ピルビン酸ナトリウム	ライフテクノロジー	#11360039	ステップ1.1.4。
トリトンX-100	シグマ	#T8787	ステップ1.2.、1.3。
TWEEN 20	Sigma	#P9416	ステップ 1.3.
ピンセット	-		プロトコルセクション1