方法論記事

人間の手に対するCulex tarsalis蚊の調査および摂取行動の研究のためのAC-DC電気浸透学

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DOI:

10.3791/66877

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2024年11月29日

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1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

この記事について

サマリー

AC-DC電気浸透学を使用して、人間の手に対するCulex tarsalis蚊の調査と摂取行動を研究するための手順が説明されています。

要約

蚊は、人間や動物の健康に悪影響を及ぼす病原体を媒介します。蚊の採血生物学や宿主や病原体との相互作用について理解を深めることで、蚊が媒介する病気を制御するための新たな標的を開発できる可能性があります。残念ながら、蚊のプローブ(つまり、刺す)行動は、宿主組織内で発生するため、よく理解されていません。ここでは、AC-DC電気浸透法(EPG)を使用して、人間の手でプローブして摂取するときに生成される電気信号の変化を記録することにより、蚊の摂食行動を間接的に視覚化および定量化するための非侵襲的な手順について説明します。細い金線を導電性の銀接着剤を使用して蚊に取り付け、EPG装置に接続します。人間の宿主は、基板電圧プローブを手に持っています。有線の蚊による宿主のプローブにより、電気回路が完成し、電気信号は「波形」としてコンピューターに記録され、分析のために測定および列挙できます。この方法論は、ネッタイシマカとネッタイシマカの探索と摂取行動を特徴付けるために使用されており、他の蚊種にも適用できます。EPGは、病原体、殺虫剤、およびその他の要因が蚊の摂食行動に及ぼす影響を研究するために使用できます。

概要

蚊は、病気の媒介者や迷惑な害虫としての役割により、世界中で苦しみと経済的損失を引き起こしています1.ハマダラカはマラリアを媒介し、世界中で年間推定2億1,900万人の症例、40万人以上の死者2、120億米ドルの直接費用3を引き起こしています。ネッタイシマカは、ほぼ全世界に存在し、チクングニア熱、デング熱、リンパ系フィラリア症、リフトバレー熱、黄熱病、ジカ熱などの感染因子を持ち、命を奪い、医療システムを圧倒し、慢性的な苦痛、生涯にわたる罹患率、および障害をもたらすため、公衆衛生上の重要性の最も顕著な媒介者です4,5。さらに、Culex蚊は、馬脳炎、日本脳炎、リンパ系フィラリア症、セントルイス脳炎、および西ナイル熱の病原体を媒介し、人間と動物の健康の両方に影響を与えます3,4。

殺虫剤ベースのアプローチによるベクターコントロールは、ベクター媒介性疾患をグローバルに制御するための主要な方法です6,7.しかし、蚊の駆除に利用できる殺虫剤の数は限られています。さらに、殺虫剤耐性は多くの種、特にネッタイシマカで進化しており、ベクター媒介性疾患と戦う能力に影響を与え、新しい防除戦略の必要性を推進しています6,8。蚊の生物学、蚊と宿主と病原体の相互作用、および病原体の伝播を調節するプロセスについての理解を深めることで、ベクター制御のための新しいツールの開発を促進することができます6。

宿主組織におけるプローブと摂取の挙動は、病原体の伝染と疾患の病理に影響を与える可能性があります9,10,11,12.例えば、ネッタイシマカが破裂した血管の外側に溜まった血液ではなく、毛細血管から直接栄養を与えた場合、より多くのミクロフィラリアが摂取されました13。したがって、このトピックに関する基礎研究と応用研究は、蚊の制御戦略や病原体伝染に対するその他の対策の開発、改良、評価に役立ちます。しかし、宿主の皮膚の表面下で発生する不可解な給血行動の詳細には、これらの行動がしばしば生きた動物モデルに対する侵襲的な手順を必要とするか、透明な人工基質や流動食を使用するため、大きな知識のギャップが存在します9,11,14,15.非侵襲的電気浸透法(EPG;電気浸透グラフとも呼ばれる)技術は、植物病原体の伝染、宿主植物の抵抗性、および殺虫剤の作用機序に関連する植物摂食昆虫の摂食行動を研究するために使用されてきました。なぜなら、研究者は宿主組織内で発生する口の動きや行動を間接的に観察、記録、定量化できるからです10,12。

1950年代以降、蚊を含む給血節足動物に電子侵入監視技術が適用されてきました。16,17,18,19,20.しかし、EPGは、波形に対応する生物学的活性が検証されなかったため、採血節足動物に広く採用されることはありませんでした21。さらに、初期の機器の設計と電子機器は、一部の電気信号の過度な強調、高いノイズ対信号比、波形の低分解能と歪み、および脊椎動物の宿主に刺激をもたらしました12,22。より新しい機器であるAC-DC EPGモニター23は、変数設定と改善された信号処理を備えているため、採血節足動物の記録や、実験的相関研究での波形の生物学的起源の解読に適しています10,12。

EPGの場合、電気信号は基板電圧プローブ(つまり、参照電極)を介してホストに印加されます。節足動物は記録電極に取り付けられ、宿主に配置されます。節足動物がマウスパーツ(スタイレット)をホストに挿入すると、電気信号はAC-DC EPGモニタに伝達され、信号処理されます。電気信号は、口の部分の動き、摂取、唾液分泌、病原体の獲得/接種などの特定の行動に対応する「波形」としてコンピューターに表示されます10,12。波形の持続時間と数に関連する逐次応答変数と非逐次応答変数24,25 で、波形の周波数と持続時間に基づいて計算し、種内および種間で発生する摂食行動、および生物的および非生物的要因に応答して発生する摂食行動についての洞察を得ることができます。 宿主、病原体、農薬、環境条件など10,12.

これまで、AC-DC EPGモニターは、人間の手を食べるAe. aegypti26およびCulex tarsalis27の蚊、およびウシの子牛を食べるDermacentor variabilisおよびAmblyomma americanumのダニ28のプローブおよび摂取行動を特徴付けるために使用されてきました。さらに、この装置を使用した病原体研究を容易にするために、EPG29のマウスモデルが最近開発されました。人間の手は、蚊のプローブやその他の行動をいつ感じたかを人間のホストが報告できるため、最初の蚊の波形特性評価に最適です。これにより、波形と行動の相関が容易になります(表1)。さらに、さまざまなヒト集団の蚊の摂食行動の可塑性をよりよく理解することで、蚊と蚊が媒介する病原体に対するより専門的な管理介入の開発に貢献できる可能性があります。

表1:AC-DC EPGを使用して人間の手でCulex tarsalisから記録された電気信号を分類するために使用される波形ファミリの説明。 各波形ファミリーに対応するプローブフェーズと生物学的活性。詳細については、Cooper et al.27 を参照してください。略語:AC =交流、DC =直流、EPG =電気透過計。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

蚊の生物学と宿主とベクターの相互作用を研究するためのEPGの使用を容易にするために、AC-DC EPGモニターを使用して人間の手に対するCx. tarsalis蚊の摂食行動を定量化する方法論がここで提示されます。これらのプロトコルは、オンライン リソースで説明されている基本的な AC-DC EPG 手順に基づいています30 は、ユーザーが AC-DC EPG および関連ソフトウェア31 に関する基本的な実務知識を持っていることを前提としています。概説されている手順は、他の蚊や宿主種に合わせて変更でき、蚊の摂食行動に関する仮説主導の研究を促進するための基盤を提供します。

表 2: 一般的な AC-DC EPG 用語の定義。 定義は、オンラインリソースに記載されているものに基づいています30,31および科学文献32。略語:AC =交流、DC =直流、EPG =電気透過計。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

プロトコル

本プロトコル（IRB-10729）は、カンザス州立大学の人間を対象とした研究に関する機関審査委員会（IRB）27によって承認されており、病原体を含まない蚊のみに使用することを目的としています。人間のボランティアは、本研究への参加およびデータの公表についてインフォームドコンセントを与えました。動物、人間、またはバイオハザードを扱う作業を開始する前に、すべての手順が適切な機関の規制委員会または監督者によって審査され、承認されていることを確認してください。本プロトコルで使用したすべての機器および材料の詳細については、材料表を参照してください。

1. 初期準備とセットアップ

  1. 以前に説明した方法30,31に基づき、以下に示す修正（ステップ1.1.1-1.1.5）を加えて、AC-DC EPGモニター（図 1A）、ファラデーケージ（図 1B,C）、およびソフトウェアをセットアップする。機器およびソフトウェアのセットアップと使用に関するステップバイステップのチュートリアルについては、オンラインリソース30を参照すること。ハードウェア管理および波形レビューソフトウェアで、目的のセットアップをデフォルトとして保存する。一般的なAC-DC EPGの用語とその定義については、表 2を参照すること。
    1. ヘッドステージアンプ（ヘッドアンプ）と基質電圧プローブを、コントロールボックスのチャンネル1に接続する。
      注：AC-DCモニターは4匹の昆虫とホストを同時に収容できるが、ここでは単一チャンネルでの記録について説明する。
    2. コントロールボックスのチャンネル1がオンになっており、スイッチインターフェースボックスの対応するPre-1およびPost-1チャンネルがオンになっていることを確認する。
      注：使用していないチャンネルはオフのままにしておく必要がある。
    3. ハードウェア管理ソフトウェアを使用して、DI-710 A/Dボードのチャンネル1と3（それ以外は不可）を有効にし、整流前および整流後の信号を記録できるようにする。
    4. ハードウェア管理ソフトウェアをフォーマットし、整流前および整流後の波形を表示/重ね合わせできるように設定する（例：前信号には 1 = 1、後信号には 2 = 3）。
    5. ハードウェア管理ソフトウェアで、サンプリングレートを1チャンネルあたり毎秒100サンプルに設定する（すなわち、S/s/CHAN: 100）。
  2. 昆虫用スタブを製作する26,27,29,30：
    1. 使用する特定のロジン芯はんだに適した推奨温度まで、はんだごてを予熱する。
    2. ワイヤーストリッパーを用いて、20 AWG銅線ロールの端から約6 cmのプラスチック被覆を剥く。この際、内部の銅線束を切断したり傷つけたりしないように注意する（図 2A）。その後、露出した銅線束を切断し、個々の素線にほどく（図 2B）。
    3. ラジオペンチを使用して、銅線1本を適切なエスカッシェンピンの頭（平らな上部）の下のシャフトに巻き付け、銅線の大部分がピンの頭よりも外側に伸びるようにする。その後、ワイヤーの端をピンの頭側に折り曲げて固定する（図 2C）。
      注：エスカッシェンピンを適合テストし、ヘッドアンプのポート（電源オフ、プラグ抜去、106 Ohms (Ω)に設定した状態）にぴったりとはまるものを特定する。
    4. エスカッシェンピンのシャフトをサードハンド（はんだ付け補助器具）で挟み、銅線が上を向くようにする。次に、エスカッシェンピンと銅線の接合部に水溶性フラックスを少量（約0.2 cmの球状）塗布する（図 2D）。
      注意：フラックスは毒性があるため、慎重に取り扱うこと。
    5. はんだを約10 cmほど解き、真っ直ぐにする。フラックスが溶け、金属が熱くなるまで、熱いはんだごてをピンの頭に数秒間当てる。その後、はんだの先端をはんだごての隣のピンの頭に押し付け、はんだが溶けて接合部を完全に覆い、ピンとワイヤーが融合して昆虫用スタブになるまで加熱する。
    6. 昆虫用スタブを冷却させている間に、スチールウールと湿ったスポンジではんだごての先端を洗浄する。
    7. 冷却後、サードハンドから昆虫用スタブを取り出す。昆虫用スタブを70%エタノール、次いで水で洗浄し、残留フラックスを除去する。銅線を目的の長さ（約3 cm、図 2E）にカットする。
    8. 20〜30個の昆虫用スタブが完成するまで、ステップ1.2.3〜1.2.7を繰り返す。
  3. 昆虫アスピレーターを組み立てる26,27：
    1. ガラス製パストゥールピペットの先端を、わずかに回転させながら炎に通す。ピペットの端が昆虫の腹部にぴったりとはまる適切なサイズになるまでこれを繰り返す。
    2. 加工したパストゥールピペットの太い端を蚊帳ネットで覆い、それをラボ用アスピレーターに接続されたシリコンチューブに直接挿入し、接合部を電気テープで固定して昆虫アスピレーターを作成する（図 2H）。
      注：パストゥールピペットとネットを、クイックディスコネクター付きの短いプラスチックチューブに挿入しておくことで、異なるサイズへの切り替えを容易にできる（図 2H）。

EEG記録用の電気生理学ラボのセットアップ。アンプ、コンピュータ、ファラデーケージ、およびセンサーを含む。
図 1: ヒトの手での記録のためのAC-DC EPGモニター装置のセットアップ。 (A) EPGの構成部品：(1) コントロールボックス、(2) スイッチインターフェースボックス、(3) 電源、(4) DI-710 A/Dボード、(5) コンピュータ、(6) 電圧レギュレータ、および (B) ファラデーケージ。ケージ内には (C) グースネックスタンド付きデジタル顕微鏡 (7)、(8) 気泡緩衝材およびエアクッション、(9) 基質電圧プローブ、およびラボスタンド上の (10) ヘッドステージアンプが含まれる。略語：AC = 交流、DC = 直流、EPG = 電気貫通記録装置（electropenetrograph）。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

チューブ、ワイヤー、およびツールを用いたカテーターの組み立て工程。流体転送のための実験セットアップ図。
図 2: モスキートの配線用記録電極と、配線中のモスキートを操作するための昆虫アスピレーター。 (A) 内部の銅線束を露出させるために、プラスチックコーティングを 6 cm 除去した 20 AWG 銅線。 (B) 銅線束の個々のストランド。 (C) 真鍮製エスカッションピンの頭に巻き付けられ、ワイヤーの端がピンの頭に折り畳まれた1本の銅線ストランド。 (D) はんだ付けの準備として、ヘルピングハンズはんだ付け補助具で固定された、真鍮製エスカッションピンと銅線の接合部に塗布された少量のフラックス。 (E) 真鍮製の釘に銅線をはんだ付けして作製した、完成した昆虫スタブ。 (F) 昆虫スタブの銅線の先端に金線を巻き付け、銀接着剤で固定して作製した記録電極。 (G) 記録電極先端の金ループの拡大図。 (H) 改変したパステールピペット、防蚊ネット、プラスチックチューブ、電気テープ、およびオス側クイックディスコネクタで作製された、組み立て済み（上）および分解済み（下）の昆虫アスピレーターと、メス側クイックディスコネクタを装着したラボ用アスピレーターチューブ（右上）。スケールバー = 1 cm (A-F)、200 µm (G)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. カイチュウバエの配線

  1. 蚊と銀色接着剤の準備（EPGの前日午後または夜間）：
    1. 既報のとおりにCx. tarsalis KNWR株の蚊を飼育・維持する27。
    2. 羽化後5〜17日の成虫雌蚊を8〜12時間絶食させ、プローブ速度を高める。ただし、死亡を避けるため水にはアクセスできるようにしておく。
    3. 新鮮な銀色接着剤を調製する26,27,28,29,30：
      1. 20 mLビーカーに4〜8 µmの銀フレーク510 mgを加える。天秤を風袋引きし、銀フレークの上に非毒性の学校用グルー1,100 mgを加える。
      2. 天秤を風袋引きし、グルーの上に8〜10 µmの銀フレーク510 mgを加え、次にピペットを用いて水1,000 µLを加える。
      3. ビーカーにスターラーバーを静かに加え、スターラープレートに置く。低速で攪拌を開始し、徐々に「高速」設定まで上げ、4分間攪拌する。すべての内容物が均一に混合していることを確認する。
      4. （先端をカットした）移送ピペットを使用して、銀色接着剤を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移す。
      5. 銀色接着剤チューブの上部をParafilmで巻き、使用時までベンチトップで保存する。
        注：銀色接着剤は最大2日間は適切な粘度を維持するが、使用前日の夜に調製することが推奨される30。
  2. 記録電極の準備26,27,29,30：
    1. 使用前に銀色接着剤を激しくボルテックスする。
    2. 準備した昆虫用スタブと電極取り付け済みの蚊を保持するため、フォームブロックを新鮮なプラスチックラップで巻く。
      注：フォームは、電極取り付け済みの蚊がお互いに触れずに表面に立てるのに十分な大きさであり、かつ保存ボックスに収まる十分な小ささである必要がある。注意：吸血後に排出される排泄滴には病原体が含まれている可能性がある。使用後のプラスチックラップおよびフォームブロックは適切に廃棄すること。
    3. 銅線の先端をカミソリで上部1 cmほど、全周が光るまで削り、変色（およびスタブを再利用する場合は古い銀色接着剤）を取り除く。蚊1匹につき1つの昆虫用スタブを準備し、予備を数個用意する。
    4. 直径0.025 mmの金線を4〜5 cmの長さに切断する。線に凹みがつくのを避けるため、金線は常にテープで保護したセルフクロージング鉗子で保持する。
      注：金線は黒い背景に対して非常に視認しやすい。
    5. 金線の端を昆虫用スタブの銅線のきれいな先端に沿わせ、金線を銅線の周りに3回静かに巻き付ける。
    6. 解剖用プローブを使用して銀色接着剤を塗布し、金線を固定する。末端や緩んだ部分がないことを確認する。接着剤が乾くまで、昆虫用スタブをフォームに置く。
    7. 昆虫用スタブに取り付けた金線を静かに撫でて滑らかにし、緩やかな長い弧状に成形する（Figure 2F）。線を希望の長さ（〜2.5-3 cm）に切り詰める。
    8. 解剖顕微鏡下で、精密ピンセットを使用して金線の先端に金ループを作成し、以下に述べる手順（ステップ2.2.8.1〜2.2.8.4；Figure 2E,F）に従ってループを90°の角度に曲げる。金ループが完全に閉じていることを確認する。昆虫用スタブをフォームブロックに戻す。
      1. 非利き手で昆虫用スタブの真鍮釘を持ち、金線の先端が顕微鏡ステージに触れるようにする。利き手で精密ピンセットを用いて金線の最端部を掴む。
      2. 精密ピンセットを用いて、金線の先端を、金線が接着されている付近の昆虫用スタブの銅線の上に交差させる。精密ピンセットの端と金線を顕微鏡ステージに押し付ける。
      3. 精密ピンセットの先端の周りに小さな金ループができるまで、昆虫用スタブを静かに引く（強く引きすぎないこと）。金線を離し、注意深くピンセットを取り除く。
      4. 非利き手で昆虫用スタブを持ったまま、精密ピンセットで金ループを掴む。このとき、ピンセットが線のネックに対して垂直な角度になり、ピンセットの先端が金ループの中央にわたってループの両側を掴むようにする。ピンセットを昆虫用スタブから遠ざける方向に軽く回転させながら、昆虫用スタブを静かに引き、ループが線のネックに対して90°に曲がるまで操作する（Figure 2G）。
  3. 蚊への記録電極の取り付け26,27,29,30（EPGの当日朝）：
    1. 絶食させた蚊をCO2ガスで全ての動きが止まるまで麻酔にかける。麻酔パッドの上に、腹部が研究者側を向くように蚊を仰向けに配置する。
    2. 解剖顕微鏡下で、約2 cmの実験用テープを粘着面を下にして置く。テープの上に銀色接着剤を0.5 cmのドロップ（〜10 µL）状に置く。
    3. 麻酔状態の蚊の腹部を、 modified Pasteur pipetteを用いて吸い込む。腹部が定着するまでの短時間のみ吸引を行う。アスピレーターを使用して、蚊を銀色接着剤の上の解剖顕微鏡下に保持する。
      注：翅は modified Pasteur pipetteの先端の内側または外側のどちらでもよいが、内側にある方が蚊の脱落を防ぐことができる。翅を曲げたり傷つけたりしないように注意する。
    4. 迅速に作業し、ミニピンを銀色接着剤に浸し、蚊の前胸背板（すなわち胸部の背面）に薄く塗布する。可能であれば直ちに次のステップに進む（必要に応じて蚊を再度麻酔にかける）。
      注：クチクラの孔に接着剤が浸透しやすくするため、ピンを前後にこすって前胸背板の鱗片を取り除くことが推奨される。蚊の他の部位に接着剤が付かないように注意する。
    5. 記録電極先端の金ループを素早く銀色接着剤に浸し、蚊の前胸背板上の銀色接着剤スポットに配置する。ループを前後に揺らし、前胸背板にぴったりと密着させる。接着剤が乾くまで（〜20-25 s）線を保持する。
    6. 目覚めた時に電極取り付け済みの蚊が快適に立てる角度で、昆虫用スタブをフォームに戻す。次の蚊の電極取り付けに進む。
      注：個々の取り付けの品質についてメモを取っておくことが望ましい。
    7. 希望の数の蚊に電極を取り付けたら、フォームブロックを保存ボックスに入れる。使用時まで、通常の飼育条件下で蚊を維持する。

3. EPGのセットアップと準備（EPG前日の午前中）

  1. 装置の安定化およびトラブルシューティングを行うため、記録を開始する少なくとも30分前に、電源装置のスイッチを入れてAC-DC EPGモニターの電源を入れてください。
    注：コントロールボックスおよびスイッチインターフェースボックスで使用中のチャンネルは、オンのままにしておいて差し支えありません。
  2. コンピューターを起動し、ハードウェア管理ソフトウェアを開きます。
    注：信号が平坦な細線として現れない場合は、トラブルシューティングが必要です（考察セクションを参照してください）。
  3. タッチテストを実施する27,30 装置の機能性を検証するため：
    1. 接地した状態で（すなわち、素肌でファラデーケージに触れた状態で）、～のダイヤルを回します。 ヘッドアンプ 〜へ 106 Ω そして、昆虫用スタブのシャフトをポートに挿入します。
      注意：高い入力抵抗（Ri）レベルでタッチテストを行うと、ヘッドアンプを損傷させる可能性があります。
    2. 接地した状態でヘッドアンプのスイッチを入れ、昆虫スタブの銅線を人差し指と親指でしっかりと3回つかみます。EPGが正しく動作していれば、画面上のプリ信号とポスト信号の両方に3つの大きなピークが現れます。そうならない場合は、トラブルシューティングが必要です（考察セクションを参照してください）。
  4. 装置の設定を以下のように調整します。 150 mV 交流（交流）に、ある 10のRi7 Ω、a ハードウェアゲイン 20〜40倍、a ネガティブオフセット、a ネイティブベースライン、および一つの ソフトウェアゲイン の 8-16倍27,30、以下に述べる手順（ステップ 3.4.1～3.4.3）に従って行う。
    1. コントロールボックスのチャンネル1にあるスイッチとダイヤルを使用して、電圧、電流タイプ、ハードウェアゲイン（範囲、ゲイン、倍率）、オフセット、およびベースライン（ゼロ）を設定します。
      注：適切なハードウェアゲインの設定は、配線作業および銀ペーストの品質に依存するため、蚊個体間や日によって最適ゲイン設定に変動が生じることが予想されます。信号がピークアウトした場合（以下に定義）は、記録の途中でハードウェアゲインを調整する必要があるかもしれません。 表2 および～に示されている 図3A,C) または、視覚化するには小さすぎます。ハードウェアゲインの変更は、記録に永続的に影響します（以下に表示）。 図 3A,C).
    2. ヘッドアンプのダイヤルを使用してRiレベルを設定してください。
    3. ハードウェア管理ソフトウェアを使用して、ソフトウェアゲインの設定および調整を行います（例：プリ信号またはポスト信号を選択し、左クリックでソフトウェアゲインを上げ、右クリックで下げます）。
      注意：ソフトウェア上で行ったゲイン変更は、録画に永続的な影響を与えません。
  5. ハードウェア管理ソフトウェアで新しいレコーディングの設定を行いますが、次セクションのステップ4.3までレコーディングは開始しないでください。

4. ヒトの手におけるEPG26,27 :

  1. （所属機関のIRBが規定する方法で）インフォームドコンセントを得た後、被験者をファラデーケージの横に座らせ、片腕をケージ内に入れさせ、基質電圧プローブを把持してヘッドアンプの下に保持させます。
    注意：腕は、気泡緩衝材または同様の非導電性基材の上に心地よく置く必要があります。記録中は、手および基材電圧プローブがファラデーケージやヘッドアンプに接触しないようにしてください。破損を避けるため、電源を入れた後は、ボランティアがヘッドアンプに触れないことが不可欠です。誤ってヘッドアンプに触れた場合は、上述のタッチテストを行い、機能性を評価してください。
  2. ホストを定位置に配置したら、ヘッドアンプを横に向けます。保管ボックスから有線蚊を取り出し、昆虫スタブの真鍮ピンをヘッドアンプのポートに挿入して装置に接続します。蚊は吊り下げたままにしておきます。
    注意：ワイヤーから離れた蚊を処理するため、70%エタノールを入れたスプレーボトルを近くに用意しておくこと。
  3. ハードウェア管理ソフトウェアを使用して記録を開始します。蚊が快適に止まって刺針できるよう、ハンドアンプを手の上に配置します。
  4. 接地させた状態でヘッドアンプの電源を入れます。10分のタイマーを開始してください。プロービングを成功させるため、必要に応じてホストの手の位置を調整します。
    注：すぐに穿刺（プローブ）を行う傾向がある蚊を使用する場合は、蚊を手に配置する前にヘッドアンプの電源を入れてください。昆虫用スタブの銅線を曲げて蚊の位置をさらに微調整するには、細い木製のダボや非導電性の絵筆の持ち手を使用できます。EPG測定中の蚊の観察、特に行動相関研究においては、拡大鏡やグースネックスタンド付きのデジタル顕微鏡が有用です。
  5. ハードウェア管理ソフトウェアを使用して、記録中にホストの反応、蚊の行動、ゲインの変更などに関するタイムスタンプ付きの観察（イベントマーカーなど）を行ってください。次の項目を調整します。 シグナルの位置 画面上およびその ソフトウェアゲイン 両方の信号が画面上で明確に視認できるよう、必要に応じて調整します。〜を調整してください。 ハードウェアゲイン 信号が飽和した場合（図3A,C および 表2) または、ソフトウェアゲインを最大にしても波形が小さすぎる場合。以下を調整します。 オフセット 整流器のフォールドオーバーが観察された場合（図3C,C' および 表2）。ソフトウェアのマニュアルを参照してください。31 およびオンラインリソース30 これらの調整方法に関する詳細な手順については、以下をご参照ください。
    1. ～を調整するために シグナルの位置 画面上で、以下を選択してください。 pre または ポストシグナル （例：〜によって） をクリックして 
      1 = 1       または 2 = 3) そして 信号をドラッグする 画面上の希望する位置（理想的には画面中央付近で、かつ重複しない場所）へ。
    2. 調整するために ソフトウェアゲイン、ステップ 3.4.3 で説明したハードウェア管理ソフトウェアを使用してください。
    3. ～を調整するために ハードウェアゲイン、まず〜を回して開始します。 チャンネル1用ゲインダイヤル ゲインを上げるには右へ、下げるには左へ、それぞれ回します。その調整でピーキング（ゲインが高すぎること）を解消できない場合は、 図3A,C) または信号の詳細が明確に可視化されない（ゲインが低すぎる）場合は、...を反転させてください。 チャンネル1レンジおよび倍率切替スイッチ ゲインをさらに調整するために。
      注：波形データの解釈を容易にするため、ハードウェアゲインを調整したタイミングを記録するイベントマーカーの使用を推奨します。
    4. 〜を調整するには オフセット、～を裏返して チャンネル1オフセットスイッチ コントロールボックスの 陰性、その後、～を回します。 チャンネル1オフセットダイヤル コンピュータ画面上で、プリシグナルとポストシグナルのピークが同じ方向に出現するまで調整します。オフセットダイヤルを回しすぎると、ポストシグナルが再び反転します。
  6. 蚊が10分以内（またはその他の定義された時間点）にプローブしなかった場合は、ヘッドアンプのスイッチを切ります。時間経過時に蚊がプローブの途中である場合は、ヘッドアンプを切る前にプローブが完了するまで待ちます。ホストに注意深く手を引かせ、その後、付属の昆虫用スタブを用いて蚊を取り除きます。蚊を保管ボックスに戻します。
  7. ハードウェア管理ソフトウェアを使用して、記録を停止または終了します。次の蚊でEPGを実施してください（ステップ4.2）。
    注：蚊を1匹処理するごとに、ファイル名を変更することを忘れないでください。
  8. セッション終了時にヘッドアンプと電源を切断し、ソフトウェアを終了してください。
  9. 承認されたIRBの規定に従い、参加者へのデブリーフィング説明書またはそれに準ずる文書をボランティアと共に確認してください。
  10. プロトコルの要件に従って蚊を廃棄してください。フォームブロックからプラスチックラップを取り外し、適切に廃棄してください。
  11. すべてのデータ収集が完了した後、波形を確認および測定し、前述の方法でデータを解析する。24,25,26,27,29,30オンラインリソースを参照してください30 波形レビューソフトの使用方法、波形を描画した図の作成、波形の測定、解析用データの書き出し、統計解析の実施に関するステップバイステップのチュートリアル、および一般的な波形応答変数の詳細な解説について。

信号振幅の経時的な一過性変化を示す電気生理学的データチャート。
図 3: ピーキングアウト、コントロールボックスのゲイン変更、不適切な配線による不明瞭な電圧変化、整流器のフォールドオーバー、およびノイズに起因する不適切な記録の例。ヒトの手で満腹まで吸血したCulex tarsalis 蚊からの波形であり、以下により歪んでいる：(A) ピーキングアウト（青色の水平矢印）およびそれに続くコントロールボックスのゲイン変更（100xから80x、40x、60x、40x、20xへ；オレンジ色の垂直矢印）、(B) 不明瞭な電圧変化、および(C) 前整流（赤色）信号と比較した後整流（黒色）信号における整流器のフォールドオーバー（波形Jを参照、パネルC'に拡大図を表示）、ラインノイズ（前整流（赤色）信号にのみ認められる11 Hzの正弦波、パネルC'に拡大図を表示）、ピーキングアウト（青色の水平矢印）、およびコントロールボックスのゲイン変更（500xから200xへ；オレンジ色の垂直矢印）。波形名は各パネルの上部に表示されている。パネルCの右下にある紫色の矢印は、プローブ完了後にヘッドアンプをオフにしたタイミングを示しており、整流器フォールドオーバーの別の例となっている。パネルCの前整流信号に関連する赤色の水平線は、タイムスタンプ付きのメモを記録するためにイベントマーカーが使用されたタイミングを示す。Riレベル、印加信号、タイムスケール、およびソフトウェアゲインは、(A) 107 Ω, 150 mV DC, 13.2 s/div, 8x；(B) 107 Ω, 150 mV DC, 4.4 s/div, 128x；(C) 107 Ω, 150 mV AC, 7.4 s/div, 2x；(C') 0.2 s/div, 8xである。略語：AC = 交流, DC = 直流, Ri = 入力抵抗, mV = ミリボルト, Ω = オーム, s/div = 1目盛りあたりの秒数。この図はCooperら27のデータを用いて作成された。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

結果

ヒトの手に対するCx. tarsalis蚊の吸血に関するAC-DC EPG記録（図4）により、解析および出版に適した解釈可能な波形が得られた27。波形レビューソフトウェアにおいて、圧縮（表2で定義）およびソフトウェアゲインを調整すると、解釈可能な波形には、波形ファミリー（表1および図4）、タイプ、およびサブタイプに分類可能な、明確で区別可能な繰り返しパターンが含まれていた27,31。ヒトの手を吸血するAe. aegyptiにおいて以前に記述されたすべての波形ファミリー（J、K、L、M、N）およびタイプ（L1、L2、M1、M2）26が、ヒトの手を吸血するCx. tarsalisによって生成された波形においても同定され、本手法の妥当性が検証された。さらに、3つの新しい波形タイプ（M3、N1、N2）およびL1、L2、M1、M2の多数のサブタイプが同定された27。加えて、口器が宿主から引き抜かれた際のベースラインへの電圧降下を、波形ファミリーWと命名した27。

ここに概説した手順に従い、機器の設定（電流タイプおよびRiレベル）を系統的に変化させることで、Cx. tarsalisの人手への吸血を記録するための最適設定、各波形の電気的な起源、蚊1匹あたりの完全および不完全なプローブの平均持続時間（秒）の決定、ならびに設定間における昆虫1匹あたりの波形持続時間（秒）（WDI）、昆虫1匹あたりの波形イベント数（NWEI）、および昆虫1匹あたりのイベントごとの波形持続時間（秒）（WDEI）の統計的比較が可能となった27。また、異なる波形が出ている最中に蚊の吸血を中断させ、解剖を行うことで、どの波形が血液摂取と相関しているかを特定した27。同様の調査を、同等の手法を用いてAe. aegyptiに対しても実施した26。

EPGは感度が高く複雑な性質を持つため、すべての記録が図 4に示されているものほど鮮明であったわけではありません。ピークオーバー（図 3A,C）、ハードウェアゲインの変動（図 3A,C）、不適切な配線（図 3B）、波形Jにおける整流器のフォールドオーバー（図 3C,C'）、および電気的ノイズ（図 3C,C'）によって、時折波形が歪んだり遮られたりし、出版品質の図に使用するには不適切であり、スコアリングや解析を困難にさせました。したがって、配線技術の習熟、ゲインと電圧設定の最適化、オフセットの調整、および電気的ノイズの制御など、事前の準備が推奨されます。興味深いことに、整流器のフォールドオーバーはCx. tarsalisの波形ファミリーJでのみ観察され（図 3C,C'）、一度オフセットを調整すると、他の蚊の種（Ae. aegyptiおよびCulex quinquefasciatus）を用いた場合でも再発しませんでした（データ未掲載）。さらに、トラブルシューティングの結果、図 3（パネルCおよびC'）に示されている制御不能な電気的ノイズは、ファラデーケージの欠陥に起因していたことが判明しました。欠陥のあるファラデーケージで行われた記録も依然として使用可能でしたが、改良したファラデーケージを製作したことでノイズの問題は解決されました（図 1B）。

あらゆる予防措置とフロントエンドの最適化を講じたとしても、蚊への電極装着品質のわずかな変動や、信号を歪ませし、信号対雑音比（S/N比）を変化させるその他の未知の要因により、信号が可視範囲内にあり、各波形のピーク分解能が波形の同定および特性評価に十分であることを保証するため、記録途中でハードウェアゲインを調整する必要が定期的に生じました。残念ながら、記録途中でハードウェアゲインを調整すると、急激な電圧シフトが発生する場合があり（図 3A, C）、その波形は出版には不適切となりますが、測定および解析には（全体または一部において）依然として使用可能です。

力の分析を示す静的平衡図。グラフはΣFx=0、ΣFy=0の式を強調している。
図 4: 人の手に配置したCulex tarsalisプローブから、印加信号 250 mV AC、Ri 107 Ω で記録した代表的な波形。各パネルの上部に科レベルの（NP, J, K, L, M, W）波形名が示されている。下段のパネルは、パネルAの特定領域の拡大図である。挿入パネルは、指定された領域の拡大図である。時間スケールとソフトウェアゲインは、(A) 7.0 s/div, 16x; (B) 1.0 s/div, 64x; (B') 0.2 s/div, 64x; (C) 1.0 s/div, 64x; (C') 0.2 s/div, 32x; (D) 1.0 s/div, 64x; (D') 0.2 s/div, 64x である。略語：AC = 交流, Ri = 入力抵抗, mV = ミリボルト, Ω = オーム, s/div = 1目盛りあたりの秒数。この図は Cooper et al.27 のデータを用いて作成された。こちらのリンクから、この図の拡大版を表示してください。

ディスカッション

AC-DC EPGを使用する場合は、ハードウェアとソフトウェアの動作30の基本的な理解を持ち、機器の損傷を避けるために、ここに記載されているプロトコルに注意深く従うことが重要です。最も注目すべきは、ファラデーケージに接地されていない限り、ヘッドアンプがオンになっているときにヘッドアンプに触れないようにすることです。ファラデーケージの中でできるだけ遠くまで録音することをお勧めします30。周囲の電気ノイズが過剰な環境で記録しない限り、解釈可能な波形を得るためにケージのドアを必ずしも閉じる必要はありません。ファラデーケージには電動のものは何も入っていません。ファラデーケージ自体が適切に動作するには、ヘッドアンプのみを介して電気的に接地する必要があることに注意することが重要です。これは、ヘッドアンプを金属製の実験用スタンドに接続し、塗装をスタンドの片足から研磨して、ファラデーケージによって捕捉された電気が実験用スタンドに流れ、ヘッドアンプの金属ケーシングに流れ込み、コードを下ってコントロールボックスに流れ込むことによって達成されます。 電源を介して適切に接地された壁のコンセントに、および建物の地面30を通って地球に。マルチメーターを使用して、さまざまな点間の抵抗率 (導電率の逆数) を測定することにより、ケージ内のコンポーネント間の接続の品質を確認できます。ワイヤレスAMラジオをファラデーケージ内に配置して、ドアを閉めたときに音が大幅に減少(または理想的には除去)されることを確認し、ファラデーケージが空中電気信号を適切にキャプチャしていることを確認することもできます(E. Backus per. Comm.)。

使用可能な記録を得るには、銀接着剤の適切かつ標準化された準備と昆虫への記録電極の取り付けが重要です。昆虫キューティクルは絶縁体であり、銀接着剤がキューティクルの細孔に十分に浸透して、昆虫の内部から前胸板30の表面の金線に電気が伝わる経路を作成しない場合、コンデンサとして機能します。各 EPG セッションの前に同時に銀接着剤を準備し、チューブから新鮮な銀接着剤を使用し、配線手順中に頻繁に激しくボルテックスされた銀接着剤と交換します。金のループが胸部に対して配置されていることを確認して、ループ全体がキューティクルに接触し、片側に傾いたり、銀の接着剤と鱗の厚い層で分離したりして、強力な電気接続を形成し、蚊の外れやワイヤーからの逃げを防ぎます。

ここで説明するプロトコルは、さまざまな蚊種を扱う場合に最適化する必要があります。特定の節足動物で記録するための最適なEPG設定(Riレベル、電圧、電流タイプ、およびハードウェアゲイン)は、実験的に決定する必要があります12,30。ただし、オフセットを一度調整すると、同様の蚊を扱うときに再調整する必要はありません。Ae. aegypti26 および Cx. tarsalis27 を伴う AC-DC EPG の最適な設定が決定されています。追加の種の波形ライブラリ(表2で定義)は、蚊へのEPGの採用を促進します。また、蚊の種類や麻酔の選択によって摂血行動が異なる影響を受ける可能性があるため、目的の蚊の麻酔を最適化することも必要です。たとえば、Cx. tarsalis は CO2 による 15 分間の麻酔後、4 時間の回復期間を必要としますが、Ae. aegypti の場合、氷による 15 分間の麻酔期間の後、15 分間の回復期間で十分です。しかし、キュレックス足根は低温にさらされても倒れにくいため、回復期間が長いにもかかわらず、主にCO2が使用されています。

AC-DC EPGモニタは、オンラインリソース30,31を確認したり、経験豊富なユーザによるトレーニングを行ったりした後、簡単に使用できますが、いくつかのトラブルシューティングが必要です。当初、著者の蚊プローブのEPG記録には、ワヤダンデらによって観測または報告されていなかった予期しない11Hzのサイン波がプレシグナルにあった26。E. Backusとの協議により、ファラデーケージが干渉するグランドループが問題である可能性が高いことが示されました。下の表から分離するためにゴム足で支えられた大きなアルミニウム製床板にボルトで固定されたアルミニウムフレームに接続された高導電性の銅製スクリーンで構成された新しいファラデーケージ(図1B)は、11Hzのノイズ信号を解決しました(図3C、C')。さらに、EPG 電源を最初にオンにしたときに、整流前および整流後の信号が、直線で滑らかで細い線ではなく、太くてぼやけた線として表示されることがありました。これは通常、楽器の電源を切り、すべてのコード接続を確認することで修正されました。それが失敗した場合は、通常、機器のプラグを1〜3分間抜くと効果的でした。ごくまれに、動作中に事前信号と事後信号が太くあいまいになることがありますが、これは、機器の電源を切って別のコンセントに差し込むか、電圧レギュレータとパワーコンディショナーを使用してEPGを壁に接続する前に差し込むことで対処しました。理想的には、EPG モニターの専用ラインは、EPG30 と同じ電気回路に接続された冷蔵庫やその他の機器から発生するライン ノイズを排除します。

現在、蚊の研究に EPG を使用することには、主に 2 つの制限があります。まず、どのプロービング挙動が波形に対応するかを検証するための相関研究はほとんど行われていません。各波形ファミリー(表1)および一部の波形タイプ(M1およびM2)で何が起こっているかについては強力な仮説がありますが、血液摂取が波形ファミリーM26,27と相関していることを除いて、これらの仮説は実験的に確認されています。最も重要なことは、多くの病原体が唾液中に伝染するため、唾液分泌イベントに対応する波形を特定する必要があります。治療グループ間の波形の持続時間と数の有意な違いを有意義に解釈するには、EPG 波形と蚊の生物学的活性との相関関係が必要になります。次に、EPG 中のプロービングおよび取り込み率は、予想よりもはるかに低くなる可能性があります27。蚊を短いワイヤーに個別につなぎ、宿主に直接置くと、探査や摂取行動に影響を与える可能性のある長距離の宿主探索行動や社会的摂食行動を防ぐことができます。正しく配線された昆虫は、正常に歩いたり飛んだりすることができます。それでも、蚊はワイヤーに引っ張られることが多く、時には絡まったり、不自然な角度で体を保持したりすることがあり、ワイヤーで接続されていることが蚊の行動にある程度影響を与えることを示しています。著者らは、EPG中のプロービング率を高めるための多くの戦略をテストし、蚊を一晩絶食させ、高齢者を使用し、手に置く直前に人間の息にさらし、人間の唾液を手に塗布することが最も効果的であり、蚊がプローブするのに理想的な位置にあることを確認するために、手の位置を常に微調整する宿主を使用した27。

これらの制限にもかかわらず、AC-DC EPGには、プロービングおよび摂取挙動を研究するための他のアプローチに比べて多くの利点があります。BiteOScope11、flyPAD15、および自動生体材料プラットフォーム14 などのシステムは、血液供給中のプロービングおよび摂取行動と唾液分泌物を定量化するように設計されており、正常な宿主組織システムと宿主の手がかりを欠いている透明な人工基質と流動食を利用しています。これらの合成プラットフォームは多くの実験目的に役立ちますが、AC-DC EPGの明らかな利点は、自然宿主システム内でこれらの節足動物の行動と関心のある変数を研究できることです。さらに、AC-DC EPGシステムのユーザ定義の適応性は、他のEPG機器22,33およびEPGのような電子監視デバイス16,21よりも追加の利点を提供しますが、これらは、最大量の情報で波形を取得し、広範囲の宿主および節足動物への悪影響を最小限に抑えるために必要な調整可能なRiレベル、電流タイプ、および電圧レベルを有しません22、23.筋電図検査 (EMG) 技術は、血液供給の研究にも使用されます。しかし、電気回路は通常、節足動物のみを含み、記録電極に最も近い筋電位のみが記録されるため、波形は、細胞の破裂、スタイレットの位置と活動、口器を通るストリーミング電位など、宿主と昆虫の界面で発生する詳細な活動に関する情報を提供しません28,34.生体内顕微鏡技術を使用して、生体宿主組織における詳細な口器の動きと活動を直接視覚化することができますが、これらの技術には、生きた動物モデル9での侵襲的処置が含まれます。AC-DC EPGモニターのみが、侵襲的な処置を必要とせずに、生きた不透明な宿主組織で発生するプロービング、摂取、および唾液分泌行動について非常に詳細な情報をリアルタイムで提供でき、さまざまな節足動物での使用に適応できます10,12。

これは、蚊の配線、昆虫吸引器の構築、およびヒト宿主に対する EPG の実行に関する最初の詳細な段階的な手順です。これらのプロトコルは、人間の宿主を餌とする蚊に対する AC-DC EPG の採用を促進することが期待されています。AC-DC EPGを用いた将来の研究の例としては、血液摂取前のプロービング行動のステレオタイプなシーケンスの同定、口器を通る血流の調査、節足動物種/発達段階間の摂食可塑性の比較など、血液摂食と宿主組織損傷の基本的なメカニズム10に関する研究が含まれる可能性がある26.EPGは、殺虫剤、摂食防止剤、忌避剤の効果を定量化するためにも使用できます12。AC-DC EPGを使用して人間の手に付いた蚊を研究するためのここで紹介する手順は、これらの研究を加速し、蚊の血液摂食者の生物学に関する新しい洞察を可能にします。

開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。この出版物での商品名または市販製品の言及は、特定の情報を提供することのみを目的としており、米国農務省による推奨または承認を意味するものではありません。このレポートの結論は著者のものであり、必ずしもUSDAの見解を表すものではありません。

謝辞

蚊の配線手順の先駆者としてオクラホマ州立大学のAstri Wayadande教授に感謝します。また、カリフォルニア州パーリアのUSDA-ARSのElaine Backus博士、フロリダ州ゲインズビルのEPG Technologies Inc.のAndrew Dowell氏には、EPG機器のトラブルシューティングの支援をいただきました。また、蚊を提供してくださったカンザス州マンハッタンのUSDA-ARS昆虫館のダスティン・スワンソン博士とウィリアム・ヤーネル氏、カンザス州マンハッタンのカンザス州立大学のミリアム・ルヒンダさんにも、手続き用ビデオの撮影に協力していただいたことに感謝します。この研究は、カンザス州立大学のIntegrated Molecular Entomology Core(IEMC)へのアクセスによって可能になりました。この研究は、USDA Research, Education, and Economics Workforce Development Agreement(#58-3022-0-002)およびHatch Multistate Project(NE1943)の支援を受けました。この原稿は、米国カンザス州マンハッタンにあるカンザス州立大学カンザス農業試験場からの寄稿番号24-194-Jです。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
instrumentation
AC-DC 4チャンネル電気透過計EPG Technologies, Inc.EPGの場合、電源、コントロールボックス、スイッチインターフェースボックス、4つのヘッドステージアンプ、4つの基板電圧プローブ、および関連コードが含まれます
エアピローAmazon.com
EPG DI-710データ収集ハードウェア(ADボード)DATAQ Instruments Inc.アナログEPG信号をデジタル化して、コンピューターで視覚化できるようにするため
調光可能なLED拡大鏡、大きな5倍ハンズフリー拡大鏡、ライトと読書趣味のスタンド付きクラフトソーイングワークベンチAmazon.comEPG中の行動観察用、EPG中にプラグを抜くか、ノイズが発生する場合があります
Dino-Liteエッジデジタル顕微鏡(倍率250倍)Dino-LiteAF4915ZTEPG中の行動観察用
Dino-Lite Flex-arm デスクトップスタンドカメラを保持し操作するためのDino-LiteMS22B
Eisco Steel Retort Base Stand and Rod SetFisher ScientificS41740ヘッドステージアンプを保持し、ファラデーケージを接地するための(金属製である必要があります)
EPG Online WorkshopUF IFAS Extensionhttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022AKA、EPGを学ぶための「オンラインリソース」(機器のセットアップ、データ収集と分析、ファラデー構造、銀接着剤の準備、昆虫の切り株構造など)
Furman P-1800 AR パワー レギュレーター/パワー コンディショAmazon.comライン ノイズの低減
小さなバブル クッション ラップAmazon.comホストとファラデー ケージの間のバリアとして使用
Troemner Talboys Labjaws レギュラー クランプ ホルダーフィッシャー サイエンティフィ02-217-121ヘッドステージ アンプを保持し、ファラデー ケージを接地します (金属製で、プラスチックでコーティングされていない必要があります)
WindowsコンピュータEPGおよび統計分析用ベストバイ
Software
Backus 2.0データ分析SASプログラム UF IFAS拡張ファイルhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/波形データの統計解析用
Ebert 1.0ファイルマニピュレータ、エラーチェッカーSASプログラムUF IFAS拡張ファイルhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/波形データの統計解析用ファイルの準備用
、SASバージョン9.4SAS Institute Inc.波形データの統計解析用
WinDaq Lite DATAQインスツルメンツ株式会社EPGデータの記録とレビュー用。 WinDaq Hardware Managerソフトウェア(AKA「ハードウェア管理ソフトウェア」)とWinDaq Waveform Browserソフトウェア(AKA「波形レビューソフトウェア」)が含まれます。Windowsコンピュータでのみ使用してください。 
ファラデーケージ
アルミスクリーンフレームホームデポMSCF5167for  ファラデーケージ
アルミニウムシートの壁、0.125(1/8)厚さ3003-H14金属デポS318ラデーケージ
コーナーブレースのベース用、1" ホームデポ339547のための ファラデーケージフラット
ヘッドフィリップス小ネジ、#6-32 x 1 "ファラデーケージ建設フラット
ワッシャー、#6 ファラデーケージ建設用ホーム・デポ・638977
Fluke 15B+ デジタル・マルチメーターは、電気アプリケーション向けで、最大 1000V および 10A の AC/DC 電圧および電流測定、およびファラデー・ケージ
ポータブルラジオAM FM、ラウドスピーカー、ヘッドフォンジャック、長距離受信用の2AA電池式ラジオ、ファラデーケージAmazon.com
、0.11線径の16 x 16メッシュ、36インチ x 12フィートメトロスクリーンワークス ファラデーケージ
ラウンドヘッドコンボ小ネジの壁、 #6-32 x 3/4 "ファラデーケージ建設用ホームデポ528466
サンドペーパー、1/2 "x 1"、150グリットホームデポ19036-20-CC底から塗料を取り除くための
5/16 " ホームデポWCORN516for  ファラデーケージ
スクリーンスプラインの壁、0.14" ホームデポ3034719for  ファラデーケージの壁
Insect Stubs
Brass Escutcheon Pinsホームデポ801294  
銅線、昆虫の切り株を作成するための20 AWGAmazon.com  
ハリス水溶性インフルエンザ 昆虫のスタブワイヤーをはんだ付けし、強力な接続を形成するのを助けるためのホームデポ355398
ニードルノーズプライヤー昆虫のスタブを構築するときにワイヤーを曲げるためのホームデポ
Pro's Kit 900-015 はんだ付けエスカッシャンピンを保持するためのAmazon.com
ロジンコア付き)ホームデポ296497昆虫の切り株を作成するための  
ワイヤー カッター ストリッパー ツールホーム・デポリッピングおよび切断用銅線 昆虫の切り株を構築するとき
YIHUA 928D-III はんだごて、110W ハイパワー、昆虫の切り株を構築するための完全デジタル ディスプレイ はんだごてAmazon.com;クリーニング用のスタンド、スポンジ、スチール ウールが付属しています
昆虫吸引器
Accuris ASPIREラボラトリーアスピレーターAccuris機器V0020;ハンドヘルド真空コントローラ、細い先端(40mm)ステンレス鋼アダプタ、およびピペットチップアダプタChemglass
Life Sciences Pasteurピペット、蚊
改良されたパスツールピペットを真空ラインに取り付けるためのホームデポ
蚊帳ユーティリティファブリック、10 x 10 cm四方Joann Fabrics16651622蚊が真空ポンプに吸引されるのを防ぐための
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914異なる改造パスツールピペット間の迅速かつ容易な切り替え
Thermo Scientific Nalgene HDPE Quick Disconnects (3/8 to 7/16 in.I.D.)Fisher Scientific15-315Bは、異なる改質パスツールピペット
Silver Glue 
Elmer's Glue-All Multi Purpose White GlueAmazon.comfor silver glue preparation
シルバーフレーク 99.9% 純粋、  4-8 & マイクロ;mThermoFisher786.09銀接着剤調製用
シルバーフレーク 純度 99.95% 純 8-10 & マイクロ;mInframat Advanced Materials47MR-12F銀接着剤製剤用
Insect Anesthesia
CO2 バブラーキット、1000 mL、#9 ラバーストッパーFlyStuff59-181パッド使用中の昆虫の乾燥を防ぐための
パッド フレーム、蚊がフライパッドから落ちるのを防ぐためのFlyStuff59-118
フライパッドときの静電気を減らすためのFlystationブラシFlyStuff59-205
Flystuff フライパッド 標準サイズのFlyStuff59-114AKA "麻酔パッド"蚊の麻酔用
漏斗(直径4インチ)Amazon.comフライパッドに移す前に蚊のカップをガスで処理するための
プレキシガラスまたは平らなプラスチックの蓋(サイズにカット)デポMC-27蚊が目を覚ま
し始めた場合にフライパッドを覆うためのフライパッドと漏斗の間でガスを迂回させるためのプラスチックチューブホースクランプシングルポジションと調整可能なオープン(バラエティ1/8インチから1/2インチ)Amazon.com
シングルステージCO2レギュレータ2 tank」からのガスの流れを調整するためのフライスタッフ59-142
T”フライパッドと漏斗の両方をCO2タンクチューブに接続するためのFlyStuff59-123
、クリア FlyStuff59-124C、漏斗とフライパッドを CO2 タンクのレギュレーターに接続するための
Insect Wiring
Black cardstock, (65Lb, 176 g/m2) 8.5" x 11"Michael's Stores Inc.金線を視覚化しやすくする327826
黒い画用紙の正方形 3.5 インチ x 4.0 インチプル956221 金線を視覚化しやすくする
球Amazon.com蚊を空腹させる
クラフト フォーム #12 ブロック (3.1 cm x 17.2 cm x 30.2 cm)Joann ファブリック アンド クラフト ストアワイヤード カを保持するための1941079
フレクト リボンディスペンサー、金線を保管するためのAmazon.com
操作のためのフェザー級昆虫学鉗子フィッシャーサイエンティフィックS72110
ファイン鉗子(FST by Dumont:#5 91150-20、Inox-Electronic)サイエンスツール91150-20蚊を配線するときに金のループを作るための
ペイントブラシAmazon.com配線およびEPG中に蚊を操作するため。EPGに使用する場合は、プラスチックまたは木製のハンドルが必要です
細い先端の標準トランスファーピペット、狭い、5.8 mL接着剤の準備用トーマスサイエンティフィック7761D21
金線、純度99.99%、厚さ0.025 mm蚊を配線するためのGoodfellowAU005121
Minutienピン、先端0.2 mm、1 cm蚊に接着剤を塗布するためのフィッシャーサイエンティフィックNC9681411
紙コップ 硬質紙管   
ピンバイスフィッシャーサイエンティフィック50-996-811昆虫の配線中に微細なピンを保持するため
蓋付きプラスチック収納ボックス (7 インチ x 9 インチ x 14 インチ)Amazon.com配線された蚊を輸送するための
プレキシガラスまたは平らなプラスチックの蓋 (サイズに合わせてカット)ホームデポMC-27蚊が目覚め始めた場合にフライパッドを覆うため
自己閉鎖鉗子ッシャーサイエンティフィック08-906金線の保持と操作
用圧縮ガス
CO2 gas タンクマセソン フライパッドで蚊を麻酔するための
Common Lab Items
バイオハザード使い捨てオートクレーブバッグ、8 1/2 "x 11"フィッシャーサイエンティフィック03-410-591供給蚊の処分用
ブンゼンバーナーまたはプロパントーチAmazon.comパスツールピペットの改造用
着色された実験室テープDaiggerサプライEF9763R、銀接着剤の準備、およびマスキング鉗子
使い捨てピペットチップ、1000 & マイクロ;Lフィッシャー・サイエンティフィック 銀のりを作るときの水の分注
解剖顕微鏡蚊を配線するためのライカマイクロシステム
解剖プローブフィッシャーサイエンティフィックNC9109673  銀の接着剤を適用する
三角フラスコ、1000mLッシャーサイエンティフィック フライパッドエタノール使用中の昆虫の乾燥防止用
、70% フィッシャーサイエンティフィ04-355-122逃げた蚊を回収するための
ガラスシャーレ フィッシャーサイエンティフィック08-747B氷で蚊を麻酔するための
手袋 フィッシャーサイエンティフィ保護のための
キムワイプ キムテックサイエンスブランドの繊細なタスクワイパー 蚊を粉砕するためのフィッシャーサイエンティフィック06-666
ラボコート 個人保護のためのフィッシャーサイエンティフィック
LiBaスプレーボトル、詰め替え可能な空のスプレーボトル(消毒用アルコール金庫)Amazon.com逃げた蚊を回収するための
マグネティックスターバー、長さ2cmッシャーサイエンティフィック 銀の接着剤を混ぜるための
機械式シングルチャンネルピペット、1000 & マイクロ;Lフィッシャー・サイエンティフィック 13-690-032銀のりを作るときの水の分注用
量遠心チューブ、1.5 mLフィッシャーサイエンティフィック 銀のり780420
;フィッシャーサイエンティフィック50-998-944銀接着剤のチューブを密封するための
プラスチックラップAmazon.comフォームブロックを覆うための
パイレックス20 mLビーカーフィッシャーサイエンティフィック 07-250-051銀のりを混ぜ合わせる
セミミクロバランスフィッシャーサイエンティフィック 10-919-370糧量用接着剤とシルバーフレーク
シャーピーペン、ラベリング用Amazon.com
片刃片刃 電子顕微鏡科学71980昆虫の切り株を洗浄用
標準使い捨てトランスファーピペットフィッシャーサイエンティフィック 133-711-7mL銀のりを保存チューブに移す用 
攪拌板フィッシャーサイエンティフィック 銀のりを混ぜるため
タイマー/ストップウォッチフィッシャー・サイエンティフィック宿主が各昆虫にさらされる時間を計る
超純水(18 MΩ)水フィッシャー・サイエンティフィック 銀の接着剤の準備用
ユーティリティはさみ線を切断するためのフィッシャーサイエンティフィ08-945
ボルテックスミキサーフィッシャーサイエンティフィック 銀のりを混合するため
研究生物
Culex tarsalis蚊USDA ARSの穀物および動物の健康研究センター、カンザス州マンハッタンで研究対象として使用するため
ナー ック 、、、ファのためのホームデポ459999の壁。のテスト用 Amazon.com 抵抗、導通、ダイオード、およびキャパシタンス機能を測定します。純銅スクリーンをテストするための屋内、屋外、緊急使用 を備えた屋内、屋外、緊急使用用ポケットラジオ実験室スタンドスクリーンフレームコーナーの、の 昆虫のスタブを構築するための中にハンズはんだ付け補助 はんだ付け( スト 昆虫吸引器に吸引を適用するためのを配線する際の昆虫吸引器として使用するための5 3/4インチ長いフィッシャーサイエンティフィックNC0230004が含まれています商用電気着色ビニール電気テープ フライフライ標準サイズで作業するホームー CO1/8インチIDチューブ用フィッティング は ステー 綿 デクリア 昆虫ファインファインポイント 銀、蚊を断食するための フィガス血液用 攪拌用のフィックック 個人フィ微パラフィルムM を保管するためのファインポイント 金ック

参考文献

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