人間の手に対するCulex tarsalis蚊の調査および摂取行動の研究のためのAC-DC電気浸透学

サマリー

AC-DC電気浸透学を使用して、人間の手に対するCulex tarsalis蚊の調査と摂取行動を研究するための手順が説明されています。

要約

蚊は、人間や動物の健康に悪影響を及ぼす病原体を媒介します。蚊の採血生物学や宿主や病原体との相互作用について理解を深めることで、蚊が媒介する病気を制御するための新たな標的を開発できる可能性があります。残念ながら、蚊のプローブ(つまり、刺す)行動は、宿主組織内で発生するため、よく理解されていません。ここでは、AC-DC電気浸透法(EPG)を使用して、人間の手でプローブして摂取するときに生成される電気信号の変化を記録することにより、蚊の摂食行動を間接的に視覚化および定量化するための非侵襲的な手順について説明します。細い金線を導電性の銀接着剤を使用して蚊に取り付け、EPG装置に接続します。人間の宿主は、基板電圧プローブを手に持っています。有線の蚊による宿主のプローブにより、電気回路が完成し、電気信号は「波形」としてコンピューターに記録され、分析のために測定および列挙できます。この方法論は、ネッタイシマカとネッタイシマカの探索と摂取行動を特徴付けるために使用されており、他の蚊種にも適用できます。EPGは、病原体、殺虫剤、およびその他の要因が蚊の摂食行動に及ぼす影響を研究するために使用できます。

概要

蚊は、病気の媒介者や迷惑な害虫としての役割により、世界中で苦しみと経済的損失を引き起こしています¹.ハマダラカはマラリアを媒介し、世界中で年間推定2億1,900万人の症例、40万人以上の死者²、120億米ドルの直接費用³を引き起こしています。ネッタイシマカは、ほぼ全世界に存在し、チクングニア熱、デング熱、リンパ系フィラリア症、リフトバレー熱、黄熱病、ジカ熱などの感染因子を持ち、命を奪い、医療システムを圧倒し、慢性的な苦痛、生涯にわたる罹患率、および障害をもたらすため、公衆衛生上の重要性の最も顕著な媒介者です^4,5。さらに、Culex蚊は、馬脳炎、日本脳炎、リンパ系フィラリア症、セントルイス脳炎、および西ナイル熱の病原体を媒介し、人間と動物の健康の両方に影響を与えます^3,4。

殺虫剤ベースのアプローチによるベクターコントロールは、ベクター媒介性疾患をグローバルに制御するための主要な方法です^6,7.しかし、蚊の駆除に利用できる殺虫剤の数は限られています。さらに、殺虫剤耐性は多くの種、特にネッタイシマカで進化しており、ベクター媒介性疾患と戦う能力に影響を与え、新しい防除戦略の必要性を推進しています^6,8。蚊の生物学、蚊と宿主と病原体の相互作用、および病原体の伝播を調節するプロセスについての理解を深めることで、ベクター制御のための新しいツールの開発を促進することができます⁶。

宿主組織におけるプローブと摂取の挙動は、病原体の伝染と疾患の病理に影響を与える可能性があります^9,10,11,12.例えば、ネッタイシマカが破裂した血管の外側に溜まった血液ではなく、毛細血管から直接栄養を与えた場合、より多くのミクロフィラリアが摂取されました¹³。したがって、このトピックに関する基礎研究と応用研究は、蚊の制御戦略や病原体伝染に対するその他の対策の開発、改良、評価に役立ちます。しかし、宿主の皮膚の表面下で発生する不可解な給血行動の詳細には、これらの行動がしばしば生きた動物モデルに対する侵襲的な手順を必要とするか、透明な人工基質や流動食を使用するため、大きな知識のギャップが存在します^9,11,14,15.非侵襲的電気浸透法(EPG;電気浸透グラフとも呼ばれる)技術は、植物病原体の伝染、宿主植物の抵抗性、および殺虫剤の作用機序に関連する植物摂食昆虫の摂食行動を研究するために使用されてきました。なぜなら、研究者は宿主組織内で発生する口の動きや行動を間接的に観察、記録、定量化できるからです^10,12。

1950年代以降、蚊を含む給血節足動物に電子侵入監視技術が適用されてきました。^{16,17,18,19,20}.しかし、EPGは、波形に対応する生物学的活性が検証されなかったため、採血節足動物に広く採用されることはありませんでした²¹。さらに、初期の機器の設計と電子機器は、一部の電気信号の過度な強調、高いノイズ対信号比、波形の低分解能と歪み、および脊椎動物の宿主に刺激をもたらしました^12,22。より新しい機器であるAC-DC EPGモニター²³は、変数設定と改善された信号処理を備えているため、採血節足動物の記録や、実験的相関研究での波形の生物学的起源の解読に適しています^10,12。

EPGの場合、電気信号は基板電圧プローブ(つまり、参照電極)を介してホストに印加されます。節足動物は記録電極に取り付けられ、宿主に配置されます。節足動物がマウスパーツ(スタイレット)をホストに挿入すると、電気信号はAC-DC EPGモニタに伝達され、信号処理されます。電気信号は、口の部分の動き、摂取、唾液分泌、病原体の獲得/接種などの特定の行動に対応する「波形」としてコンピューターに表示されます^10,12。波形の持続時間と数に関連する逐次応答変数と非逐次応答変数^24,25 で、波形の周波数と持続時間に基づいて計算し、種内および種間で発生する摂食行動、および生物的および非生物的要因に応答して発生する摂食行動についての洞察を得ることができます。 宿主、病原体、農薬、環境条件など^10,12.

これまで、AC-DC EPGモニターは、人間の手を食べるAe. aegypti²⁶およびCulex tarsalis²⁷の蚊、およびウシの子牛を食べるDermacentor variabilisおよびAmblyomma americanumのダニ^{28のプローブおよび摂取行動を特徴付けるために使用されてきました}。さらに、この装置を使用した病原体研究を容易にするために、EPG^{29のマウスモデル}が最近開発されました。人間の手は、蚊のプローブやその他の行動をいつ感じたかを人間のホストが報告できるため、最初の蚊の波形特性評価に最適です。これにより、波形と行動の相関が容易になります(表1)。さらに、さまざまなヒト集団の蚊の摂食行動の可塑性をよりよく理解することで、蚊と蚊が媒介する病原体に対するより専門的な管理介入の開発に貢献できる可能性があります。

表1:AC-DC EPGを使用して人間の手でCulex tarsalisから記録された電気信号を分類するために使用される波形ファミリの説明。 各波形ファミリーに対応するプローブフェーズと生物学的活性。詳細については、Cooper et al.^{27 を参照してください}。略語:AC =交流、DC =直流、EPG =電気透過計。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

蚊の生物学と宿主とベクターの相互作用を研究するためのEPGの使用を容易にするために、AC-DC EPGモニターを使用して人間の手に対するCx. tarsalis蚊の摂食行動を定量化する方法論がここで提示されます。これらのプロトコルは、オンライン リソースで説明されている基本的な AC-DC EPG 手順に基づいています³⁰ は、ユーザーが AC-DC EPG および関連ソフトウェア^{31 に関する基本的な実務知識を持っていることを前提としています}。概説されている手順は、他の蚊や宿主種に合わせて変更でき、蚊の摂食行動に関する仮説主導の研究を促進するための基盤を提供します。

表 2: 一般的な AC-DC EPG 用語の定義。 定義は、オンラインリソースに記載されているものに基づいています^30,31および科学文献³²。略語:AC =交流、DC =直流、EPG =電気透過計。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

プロトコル

このプロトコル(IRB-10729)は、カンザス州立大学のヒト研究のための治験審査委員会(IRB)によって承認されました²⁷で、病原体のない蚊のみでの使用を目的としています。人間のボランティアは、研究に参加し、データを公開するためのインフォームドコンセントを与えました。動物、人間、またはバイオハザードを扱う作業を開始する前に、すべての手順が適切な機関の規制委員会または監督者によってレビューおよび承認されていることを確認してください。このプロトコルで使用されるすべての機器と材料の詳細については、材料の表を参照してください。

1. 初期準備とセットアップ

1. AC-DC EPG モニタ (図 1A)、ファラデー ケージ (図 1B,C)、および前述のソフトウェア ^30,31 を、以下に説明する変更 (手順 1.1.1-1.1.5) を使用してセットアップします。機器とソフトウェアのセットアップと使用に関するステップバイステップのチュートリアルについては、オンラインリソース^{30を参照してください}。必要な設定をハードウェア管理および波形レビューソフトウェアのデフォルトとして保存します。一般的な AC-DC EPG の用語とその定義のリストについては、表 2 を参照してください。
   1. ヘッドステージアンプ(ヘッドアンプ)と基板電圧プローブをコントロールボックスのチャンネル1に接続します.
      注意: AC-DCモニターが4つの昆虫と宿主を同時に収容できる場合でも、単一チャネルからの録音が表示されます。
   2. コントロールボックスのチャネル1がオンになっており、スイッチインターフェイスボックスの対応するPre-1チャネルとPost-1チャネルがオンになっていることを確認します。
      注意: 使用されていないチャンネルは、オフのままにしておく必要があります。
   3. ハードウェア管理ソフトウェアを使用して、DI-710 A/Dボードのチャンネル1とチャンネル3を有効にします(他のボードは有効にしません)整流前および整流後の信号を記録します。
   4. ハードウェア管理ソフトウェアをフォーマットして、整流前および整流後の波形を表示/オーバーラップします(たとえば、プリ信号の場合は1 = 1、ポスト信号の場合は2 = 3)。
   5. ハードウェア管理ソフトウェアのサンプリングレートをチャンネルあたり毎秒100サンプルに設定します(つまり、S / s / CHAN:100
   )。
2. 昆虫のスタブを構築します^26,27,29,30:
   1. はんだごてを特定のロジンコアはんだの推奨温度に予熱します。
   2. ワイヤーカッターストリッパーツールを使用して、20 AWG銅線ロールの端からプラスチックコーティングを~6 cm剥がしますが、内部の銅線束を切断したり、マーキングしたりしないでください（図2A)。次に、露出した銅線の束を切り取り、個々のストランドに解きほぐします (図 2B)。
   3. ラジオペンチを使用して、銅線の1本のストランドをヘッドの下の適切なエスカッシャンピンのシャフトに巻き付けます(つまり、フラットトップ)銅線の大部分がピンのヘッドを超えて伸びるようにします。ワイヤーのテールをピンの頭の上で折り、ワイヤーを所定の位置に固定します (図 2C).
      注意: テストエスカッシャンピンを取り付けて、ヘッドのポートにぴったりとフィットするピンを特定します amp (電源をオフにし、プラグを抜いて、10⁶オーム(Ω)に設定した場合)。
   4. エスカッシャンピンのシャフトをヘルピングハンドはんだ付け補助具で留めて、銅線が上を向くようにします。次に、エスカッシャンピンと銅線の接合部に水溶性フラックスの小さなダブ (~0.2 cm ボール) を塗布します (図 2D).
      注意: フラックスは有毒であり、注意して取り扱う必要があります。
   5. はんだを~10cmほどき、まっすぐにします。フラックスが溶けて金属が熱くなるまで、高温のはんだごてをピンのヘッドに数秒間押し付けます。次に、はんだの先端をはんだごての横のピンのヘッドに押し付けて、はんだが溶けて接合部を完全にコーティングし、ピンとワイヤを融合して昆虫の切り株にします。
   6. 昆虫の切り株が冷える間、はんだごての先端をスチールウールと湿らせたスポンジで拭きます。
   7. 冷めたら、助ける手から昆虫の切り株を取り出します。昆虫の切り株を70%エタノールで洗い流し、次に水で残存フラックスを取り除きます。銅線を希望の長さ (~3 cm) にトリミングします 図 2E)。
   8. 手順1.2.3〜1.2.7を繰り返して、20〜30個の昆虫のスタブを構築します。
3. 昆虫吸引器を組み立てます^26,27:
   1. ガラス製のパスツールピペットの先端を炎に通し、ピペットを少し回転させます。ピペットの端が昆虫の腹部にぴったりと収まる適切なサイズになるまで繰り返します。
   2. 改造したパスツールピペットの大きい方の端を蚊帳で覆い、実験室の吸引器に接続されたシリコンチューブに直接挿入し、接合部を電気テープで固定して昆虫吸引器を形成します(図2H).
      注:パスツールピペットとネットは、異なるサイズを簡単に切り替えるためのクイックディスコネクトャーが取り付けられた短いプラスチックチューブに挿入できます（図2H)。

図 1: 人間の手で記録するための AC-DC EPG モニタ機器のセットアップ。(A) EPG のコンポーネント、(1) コントロール ボックス、(2) スイッチ インターフェース ボックス、(3) 電源、(4) DI-710 A/D ボード、(5) コンピュータ、(6) 電源レギュレータ、(B) ファラデー ケージ (C)グースネックスタンドのデジタル顕微鏡、(8)プチプチとエアピロー、(9)基板電圧プローブ、(10)実験室のスタンドのヘッドステージアンプ。略語:AC =交流、DC =直流、EPG =電気透過計。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2：を配線するための記録電極と、配線中に蚊を操作するための昆虫吸引器。 (A) 20 AWGの銅線に6cmのプラスチックコーティングを施したもので、内部の銅線束が露出しています。(B)銅線束の個々のストランド。(C)真鍮のエスカッシャンピンの頭に巻き付けられた銅線の1本のストランドで、ワイヤーのテールがピンの頭に折りたたまれています。(D)はんだ付けの準備のために、はんだ付け補助具によって保持された真鍮のエスカッシャンピンと銅線の接合部にフラックスを軽くたたきます。(E)真鍮の釘を銅線にはんだ付けして構成された完成した昆虫の切り株。(F)昆虫の切株の銅線の先端に金線を巻き付け、銀のりで固定した記録電極。(G)記録電極先端の金ループのクローズアップ。(H)改造されたパスツールピペット、蚊帳、プラスチックチューブ、電気テープ、およびオスクイックディスコネクタから作られた組み立て済み(上)および分解された(下)昆虫吸引器、メスクイックディスコネクタが取り付けられた実験室用吸引器チューブ(右上)。スケールバー= 1 cm(AF)、200μm(G)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 蚊の配線

1. 蚊と銀のりを準備します(EPGの前の午後/夕方):
   1. Cx. tarsalis KNWR株の蚊を前述したように飼育し、維持します²⁷.
   2. 成虫の雌の蚊を、卵閉後5〜17日で8〜12時間速くして、プローブ率を高めますが、死亡率を避けるために水へのアクセスを許可します。
   3. 新しい銀のりを準備します^{26,27,28,29,30}:
      1. 510 mgの4〜8 μmの銀フレークを20 mLビーカーに加えます。.天びんを風袋引きし、1,100 mgの無毒のスクールグルーをシルバーフレークの上のビーカーに加えます。
      2. 天びんを風袋引きし、接着剤の上のビーカーに510mgの8〜10μmの銀フレークを加え、次にピペットを使用して1,000μLの水を加えます。
      3. ビーカーに攪拌器をそっと加え、攪拌板の上に置きます。ゆっくりと攪拌を始め、徐々に「速い」設定に上げて、4分間攪拌します。すべてのコンテンツが組み込まれていることを確認してください。
      4. トランスファーピペット(先端を切り落とした状態)を使用して、銀の接着剤を1.5mLの微量遠心チューブに移します。
      5. 銀のりのチューブの上部をパラフィルムで包み、使用するまでベンチトップに保管します
         注:銀のりは最大2日間正しい一貫性を持っていますが、使用前の夜に新しい接着剤を作ることをお勧めします³⁰。
2. 記録電極の準備^26,27,29,30:
   1. 使用前に銀のりを激しく渦巻きます。
   2. 準備した昆虫の切り株とワイヤード蚊を保持するために、新しいプラスチックラップでフォームブロックを包みます
      注意: フォームは、配線された蚊が互いに触れずに表面に立つのに十分な大きさで、収納ボックス内に収まるほど小さい必要があります。注意:給血後に放出される排泄液滴には病原体が含まれている可能性があります。使用後は、ラップ/フォームブロックを適切に廃棄してください。
   3. 銅線の上部1 cmをかみそりの刃ですべての面が光沢が出るまでこすり落とし、銅線の先端から変色(および昆虫の切り株を再利用する場合は古い銀の接着剤)を取り除きます。蚊ごとに1つの昆虫の切り株と、いくつかの追加のものを準備します。
   4. 直径0.025mmの金線を4〜5cmの長さにカットします。ワイヤーがへこまないように、常にテープでマスクされた自動閉鎖鉗子でワイヤーを保持してください。
      注:金色のワイヤーは、黒い背景に対してはるかに見やすくなります。
   5. 金線の端を昆虫の切り株の銅線のきれいな先端に沿って置き、金線を銅線に3倍優しく巻き付けます。
   6. 解剖プローブを使用して銀の接着剤を塗布し、金線を所定の位置に保持します。テールやルーズエンドがないことを確認してください。接着剤が乾くまで、昆虫の切り株を泡の中に置きます。
   7. 昆虫の切り株に取り付けられた金色のワイヤーを優しくなでて滑らかにし、長くて穏やかな弧を描くように形を整えます(図2F)。ワイヤーを希望の長さ(~2.5〜3cm)にトリミングします。
   8. 解剖顕微鏡下で作業し、細かい鉗子を使用して金線の先端に金のループを作り、以下に説明するようにループを90°の角度で曲げます(ステップ2.2.8.1-2.2.8.4;図 2E,F)。ゴールドループが完全に閉じていることを確認します。昆虫の切り株をフォームブロックに戻します。
      1. 利き手ではない方の手で、真鍮の釘で昆虫の切り株を持ち、金線の先端を顕微鏡ステージに触れさせます。利き手を使って、細い先の鉗子で金線の一番端をつかみます。
      2. 細い先の鉗子を使用して、金線が接着されている場所の近くにある昆虫の切り株の銅線に金線の先端を交差させます。細い先の鉗子と金線の端を顕微鏡ステージに接触させます。
      3. 金線が細い先の鉗子の先端の周りに小さな金のループを形成するまで、昆虫の切り株をそっと引っ張ります(強く引っ張りすぎないでください)。金線を放し、鉗子を慎重に取り外します。
      4. 昆虫の切り株を利き手ではない手で保持したまま、細い先の鉗子で金のループをつかみ、鉗子がワイヤーの首に対して垂直な角度になり、鉗子の先端が金のループの中央に広がるようにして、ループの両側をつかみます。昆虫の切り株をそっと引っ張りながら、鉗子を昆虫の切り株から離すように軽く回転させながら、ループがワイヤーの首に対して90°の角度で曲がるまで(図2G)。
3. 蚊に記録電極を取り付けます^26,27,29,30(EPGの朝):
   1. 絶食した蚊に_CO2ガスで麻酔をかけ、すべての動きが止まるまで麻酔します。蚊を麻酔パッドに仰向けに置き、腹部を研究者に向けて置きます。
   ~
   2. 2 cm の実験用テープを解剖顕微鏡の下に置き、粘着性のある面を下にして置きます。テープに0.5cmの銀接着剤(~10μL)を落とします。
   3. 麻酔をかけた蚊の腹部を改造されたパスツールピペットに吸引し、腹部が所定の位置に固定されるのに十分な時間だけ吸引します。吸引器を使用して、銀の接着剤の上の解剖スコープの下に蚊を保持します.
      注:翼は改造されたパスツールピペットの先端の内側または外側に配置できますが、翼を内側に持つと、蚊が脱落するのを防ぐのに役立ちます。翼を曲げたり傷つけたりしないでください。
   4. すばやく作業して、細いピンを銀の接着剤に浸し、蚊の前庭(つまり、胸部の背側表面)に薄い層を塗ります。可能であればすぐに次のステップに進みます(または必要に応じて蚊に麻酔をかけ直してください)
      注意: ピンを前後にこすって前庭の鱗屑を取り除くことをお勧めします。これにより、キューティクルの細孔に接着剤が浸透するのを確実にすることができます。蚊の他の部分に接着剤が付着しないようにしてください。
   5. 記録電極の先端にある金のループを銀のりにすばやく浸し、蚊の前庭の銀の接着剤のスポットに置きます。ループを前後に揺らして、前庭と同じ高さに収まるようにします。接着剤が乾くまでワイヤーを保持します(~20-25秒)。
   6. フォームの昆虫の切り株を、ワイヤード蚊が目覚めたときに快適に立つことができる角度で交換します。次の蚊の配線に進みます.
      注意: 各配線作業の品質についてメモを取ることをお勧めします。
   7. 必要な数の蚊が配線されたら、フォームブロックを収納ボックスに入れます。蚊は、使用するまで通常の飼育条件下で維持してください。

3. EPGのセットアップと準備(EPGの前朝)

1. 録音の少なくとも30分前にAC-DC EPGモニターの電源を入れます(電源のスイッチを切り替えて)、機器の平衡化とトラブルシューティングを可能にします。
   注意: コントロールボックスとスイッチインターフェースボックスで使用されているチャネルは、オンのままにしておくことができます。
2. コンピュータの電源を入れ、ハードウェア管理ソフトウェアを開きます。
   メモ: 信号が平坦な細い線として表示されない場合は、トラブルシューティングが必要です (ディスカッションのセクションを参照)。
3. タッチ テストを実行します^27,30 機器の機能を確認します。
   1. 接地状態(つまり、素肌でファラデーケージに触れる)で、ヘッドアンプのダイヤルを10⁶ Ωに回し、昆虫の切り株のシャフトをポートに挿入します
      注意: より高い入力抵抗(Ri)レベルでタッチテストを実施すると、ヘッドが損傷する可能性があります amp.
   2. 接地された状態でヘッドアンプのスイッチを入れ、人差し指と親指で昆虫の切り株の銅線を3回しっかりとつかみます。EPG が正しく機能している場合は、画面上の事前信号と事後信号の両方に 3 つの大きなピークが表示されます。そうでない場合は、トラブルシューティングが必要です (ディスカッションのセクションを参照)。
4. 以下で説明するように、Ri が 10⁷ Ω、ハードウェア ゲインが 20-40x、負のオフセット、ネイティブ ベースライン、ソフトウェア ゲインが 8-16x^{27,30 で、機器の設定を 150 mV の交流電流 (AC) に調整}します (手順 3.4.1-3.4.3)。
   1. 電圧、電流タイプ、ハードウェアゲイン(範囲、ゲイン、および乗算器)、オフセット、およびベースライン(ゼロ)を設定するには、コントロールボックスのチャネル1のスイッチとダイヤルを使用します。
      注意: 適切なハードウェアゲイン設定は、配線ジョブと銀接着剤の品質によって異なるため、最適なゲイン設定は蚊ごと、および日々の変動が予想されます。信号がピークアウトする場合(表2で定義され、図3A,C図3A,Cで示されている)、または視覚化するには小さすぎる場合、ハードウェアゲインは記録の途中で調整する必要があります。ハードウェア・ゲインの変更は、録音に恒久的に影響します (図 3A,C を参照)。
   2. ヘッドアンプのダイヤルでRiレベルを設定します。
   3. ハードウェア管理ソフトウェアを使用して、ソフトウェア・ゲインを設定および調整します(たとえば、プリまたはポスト信号を選択し、左クリックでソフトウェア・ゲインを上げるか、右クリックしてソフトウェア・ゲインを下げる)。
      注意: ソフトウェアでゲインを変更しても、録音に恒久的な影響を与えるわけではありません。
5. ハードウェア管理ソフトウェアで新しい録音を設定しますが、次のセクションのステップ4.3まで録音を開始しないでください。

4. EPG on human hands^26,27 :

1. インフォームドコンセントが得られたら(所属機関のIRBで指定)、ホストにファラデーケージの横に座らせ、片方の腕を内側にして、基板電圧プローブをつかんでヘッドアンプの下に保持します。
   注意: アームは、プチプチまたは同様の非導電性基板に快適に置く必要があります。手とサブステートvoltageプローブは、録音中にファラデーケージまたはヘッドアンプに接触してはなりません。損傷を避けるために、ボランティアはヘッドアンプの電源を入れた後は触れないことが不可欠です。ヘッドアンプに誤って触れた場合は、上記のタッチテストを実行してその機能を評価してください。
2. ホストが所定の位置になったら、ヘッドを回します amp 横に向けます。収納ボックスから有線の蚊を取り出し、昆虫の切り株の真ちゅうピンをヘッドアンプのポートに挿入して楽器に接続します。蚊をぶら下げたままにしてください.
   注意: ワイヤーから外れた蚊を制御するために、70%エタノールのスプレーボトルを近くに置いてください。
3. ハードウェア管理ソフトウェアを使用して録音を開始します。ヘッドを配置します amp 蚊が快適に立ってプローブできるように、手の上に
。
4. ヘッドアンプを接地状態でオンにします。10分のタイマーを開始します。成功のプローブを支援するために、必要に応じてホストの手の位置を調整します。
   注意: すぐにプローブする傾向がある蚊を使用する場合は、ヘッドをオンにします amp 蚊を手に置く前にオンにします。細い木製のダウルまたは非導電性の絵筆のハンドルを使用して、昆虫の切り株の銅線を曲げ、蚊の位置をさらに調整できます。グースネックスタンドに虫眼鏡やデジタル顕微鏡を装着すると、EPG中の蚊の観察、特に行動相関研究に役立ちます。
5. ハードウェア管理ソフトウェアを使用して、ホストの応答、蚊の行動、ゲインの変化などに関する記録中にタイムスタンプ付きの観察(イベントマーカーなど)を作成します。必要に応じて、画面上の信号の位置とソフトウェアゲインを調整して、両方の信号を画面にはっきりと見えるようにします。信号がピークアウトする場合 (図 3A,C および表 2) や、ソフトウェア・ゲインが最大になったときに波が小さすぎるように見える場合は、ハードウェア・ゲインを調整してください。整流器のフォールドオーバーが観察された場合は、オフセットを調整します（図3C,C'および表2)。これらの調整方法の詳細については、ソフトウェアのマニュアル³¹およびオンラインリソース^{30を参照してください}。
   1. 画面上の信号の位置を調整するには、事前または事後の信号を選択します(たとえば、
      をクリックします 1 = 1 または 2 = 3) を選択し、信号を画面上の目的の位置 (理想的には画面の中央付近、ただし重ならないように) にドラッグします。
   2. ソフトウェアゲインを調整するには、手順3.4.3で説明されているハードウェア管理ソフトウェアを使用します。
   3. ハードウェアゲインを調整するには、まずチャンネル1のゲインダイヤルを右または左に回して、ゲインを上げたり下げたりします。その調整がピークアウトを排除するのに十分でない場合(ゲインが高すぎます。図 3A,C) または、信号の詳細がはっきり見えるように (ゲインが低すぎる)、チャンネル 1 レンジとマルチプライヤ スイッチを反転してゲインをさらに調整します。
      メモ:波形データの解釈を支援するために、イベントマーカーを使用してハードウェアゲインが調整されたタイミングを記録することをお勧めします。
   4. オフセットを調整するには、コントロールボックスのチャンネル1オフセットスイッチをネガティブに切り替えてから、コンピューター画面上でプリ信号とポスト信号のピークが同じ方向に発生するまでチャンネル1オフセットダイヤルを回します。オフセットダイヤルを回しすぎると、ポスト信号が再び反転します。
6. 蚊が10分(またはその他の定義された時点)以内にプローブしない場合は、ヘッドアンプをオフにしてください。蚊がその時点でプローブの途中にある場合は、ヘッドアンプをオフにする前にプローブが終了するのを待ちます。ホストに慎重に手を離してもらい、付属の昆虫の切り株で蚊を取り除きます。収納ボックスの蚊を交換します。
7. ハードウェア管理ソフトウェアを使用して録音を停止/閉じます。次の蚊でEPGを続行します(ステップ4.2).
   注:蚊のたびにファイル名を変更することを忘れないでください。
8. セッション終了時にヘッドアンプと電源をオフにし、ソフトウェアを閉じます。
9. 承認されたIRBに指定されているボランティアと一緒に、参加者報告声明または同様のものを確認します。
10. プロトコル要件に従って蚊を処分します。発泡スチロールブロックからラップを取り外し、適切に廃棄します。
11. すべてのデータ収集が完了したら、波形を確認して測定し、前述のようにデータを分析します^{24,25,26,27,29,30}.波形レビューソフトウェアの使用、波形を描写する図の作成、波形の測定、分析のためのデータのエクスポート、統計分析の実施、および一般的な波形応答変数の詳細な説明に関するステップバイステップのチュートリアルについては、オンラインリソース^{30を参照してください。}

図3:ピークアウト、コントロールボックスのゲイン変化、劣った配線による不明瞭な電圧変化、整流器のフォールドオーバー、ノイズによる最適でない録音の例。 (A)ピークアウト(青い水平矢印)とその後のコントロールボックスゲインが100倍から80倍、40倍、60倍、40倍から20倍(オレンジ色の垂直矢印)、(B)不明瞭な電圧変化、および(C)整流器がポスト(黒)信号でプレ(赤)信号と比較して折り重なる(波形J、 パネルC'に示すクローズアップ)、ラインノイズ(整流前信号で見える11Hzの正弦波(赤)信号のみ、パネルC'にクローズアップを示す)、ピーキングアウト(青い水平矢印)、およびコントロールボックスのゲインが500倍から200倍に変化する(オレンジ色の垂直矢印)。波形の名前は、各パネルの上部に表示されます。パネルCの右下隅にある紫色の矢印は、プローブが完了した後にヘッドアンプがオフになったことを示しており、整流器のフォールドオーバーの別の例を示しています。パネルCのプリレクティフィケーション信号に関連付けられた赤い水平線は、タイムスタンプ付きのノートを記録するためにイベントマーカーが使用された時期を示しています。Ri レベル、印加信号、時間スケール、およびソフトウェア ゲインは、(A) 10⁷ Ω、150 mV DC、13.2 s/div、8x;(B) 10⁷ Ω、150 mV DC、4.4 s/div、128x;(C) 10⁷ Ω、150 mV AC、7.4 s/div、2x;(C') 0.2 秒/div、8倍。略語: AC = 交流、DC = 直流、Ri = 入力抵抗、mV = ミリボルト、Ω = オーム、s/div = 分周あたりの秒数。 この図は、Cooper et al.^{27 からのデータを使用して作成されました}。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

AC-DC EPG記録は、Cx. tarsalis蚊が人間の手を血液で食べる様子を記録(図4)により、解析と公開に適した波形を生成しました²⁷。解釈可能な波形には、波形ファミリ(表1および図4)、タイプ、および波形レビューソフトウェアで圧縮(表2で定義)とソフトウェアゲインを調整した場合のサブタイプに分類できる、明確で識別可能な繰り返しパターンが含まれていました^27,31。Ae. aegypti feeding on human hands^{26で以前に説明したすべての波形ファミリー(J、K、L、M、N)とタイプ(L1、L2、M1、M2)}は、Cx. tarsalisが人間の手を食べるによって生成された波形で特定され、ここで説明した方法の有効性を検証しました。さらに、3つの新しい波形タイプ(M3、N1、N2)と多数のL1、L2、M1、およびM2のサブタイプが特定されました²⁷。さらに、マウスパーツがホストから引き出されたときのベースラインに戻る電圧降下は、波形ファミリ W^{27 と名付けられました}。

ここで概説した手順に従って、機器の設定(電流タイプとRiレベル)を体系的に変化させることで、人間の手を食べるCx.tarsalisを記録するための最適な設定、各波形の電気的起源、蚊ごとの完全および不完全なプローブの平均持続時間(秒単位)、および昆虫あたりの秒単位の波形持続時間(WDI)の統計的比較を決定することができました。 昆虫あたりの波形イベント数 (NWEI) と、settings^{27 の昆虫あたりのイベントあたりの波形持続時間 (WDEI)} です。蚊も異なる波形で中断され、どの波形が血液摂取と相関しているかを判断するために解剖されました²⁷。同様の調査が、同等の方法論を使用してAe. aegyptiに対して行われました²⁶。

EPGの繊細で複雑な性質のため、すべての録音が図4で示されたものほど手付かずのものであったわけではありません。ピークアウト (図 3A,C)、ハードウェア ゲインの変化 (図 3A,C)、不良配線ジョブ (図 3B)、波形 J の整流器のフォールドオーバー (図 3C,C')、および電気ノイズ (図 3C,C')は、波形を歪めたりマスクしたりすることがあり、出版品質の数値での使用に適さず、スコアリングと分析を困難にしていました。したがって、配線スキルを磨き、ゲインと電圧の設定を最適化し、オフセットを調整し、電気ノイズを制御するには、フロントエンドの努力が推奨されます。興味深いことに、整流器のフォールドオーバーは、Cx. tarsalis (図 3C,C') の波形ファミリー J でのみ観察され、オフセットが最初に調整されると、他の種類の蚊 (Ae. aegypti と Culex quinquefasciatus) が使用された場合でも再発しませんでした (データは示していません)。さらに、トラブルシューティングの結果、Figure 3 (パネル C と C') に示されている制御不能な電気ノイズは、ファラデーケージの故障によるものであることが明らかになりました。故障したファラデーケージで録音された録音はまだ使用可能でしたが、改良されたファラデーケージが構築されたときにノイズの問題が解決されました（図1B)。

すべての予防措置とフロントエンドの最適化が講じられた場合でも、モスキートへの電極取り付けの品質のわずかな変動や、信号を歪め、信号対雑音比を定期的に変更する未知の要因により、信号が可視範囲内にあり、各波形のピークの分解能が波形の識別と特性評価に十分であることを確認するために、録音中にハードウェアゲインを調整する必要がありました。 残念ながら、録音の途中でハードウェア・ゲインを調整すると、電圧が急激にシフトし(図3A、C)、波形が公開には適さないものの、測定や解析には(全体的または部分的に)使用することができます。

図4：250mV ACの印加信号を使用して、人間の手にあるCulexのtarsalisプローブからの代表的な波形をRi 10⁷ Ωで記録しました。 ファミリレベル(NP、J、K、L、M、W)の波形名が各パネルの上部に表示されます。下のパネルは、パネルAの選択した領域の拡大を示しています。挿入されたパネルは、示された領域の拡大を示します。タイムスケールとソフトウェアゲインは(A)7.0 s/div、16x;(B) 1.0 秒/div、64倍;(B') 0.2 秒/div, 64x;(C) 1.0 秒/div、64倍;(C') 0.2 秒/div, 32x;(D) 1.0 s/div, 64x;(D') 0.2 秒/div、64倍速略語:AC =交流、Ri =入力抵抗、mV =ミリボルト、Ω=オーム、s / div =分割あたりの秒数。この図は、Cooper et al.^{27 のデータを使用して作成されました}。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

AC-DC EPGを使用する場合は、ハードウェアとソフトウェアの動作³⁰の基本的な理解を持ち、機器の損傷を避けるために、ここに記載されているプロトコルに注意深く従うことが重要です。最も注目すべきは、ファラデーケージに接地されていない限り、ヘッドアンプがオンになっているときにヘッドアンプに触れないようにすることです。ファラデーケージの中でできるだけ遠くまで録音することをお勧めします³⁰。周囲の電気ノイズが過剰な環境で記録しない限り、解釈可能な波形を得るためにケージのドアを必ずしも閉じる必要はありません。ファラデーケージには電動のものは何も入っていません。ファラデーケージ自体が適切に動作するには、ヘッドアンプのみを介して電気的に接地する必要があることに注意することが重要です。これは、ヘッドアンプを金属製の実験用スタンドに接続し、塗装をスタンドの片足から研磨して、ファラデーケージによって捕捉された電気が実験用スタンドに流れ、ヘッドアンプの金属ケーシングに流れ込み、コードを下ってコントロールボックスに流れ込むことによって達成されます。 電源を介して適切に接地された壁のコンセントに、および建物の地面³⁰を通って地球に。マルチメーターを使用して、さまざまな点間の抵抗率 (導電率の逆数) を測定することにより、ケージ内のコンポーネント間の接続の品質を確認できます。ワイヤレスAMラジオをファラデーケージ内に配置して、ドアを閉めたときに音が大幅に減少(または理想的には除去)されることを確認し、ファラデーケージが空中電気信号を適切にキャプチャしていることを確認することもできます(E. Backus per. Comm.)。

使用可能な記録を得るには、銀接着剤の適切かつ標準化された準備と昆虫への記録電極の取り付けが重要です。昆虫キューティクルは絶縁体であり、銀接着剤がキューティクルの細孔に十分に浸透して、昆虫の内部から前胸板³⁰の表面の金線に電気が伝わる経路を作成しない場合、コンデンサとして機能します。各 EPG セッションの前に同時に銀接着剤を準備し、チューブから新鮮な銀接着剤を使用し、配線手順中に頻繁に激しくボルテックスされた銀接着剤と交換します。金のループが胸部に対して配置されていることを確認して、ループ全体がキューティクルに接触し、片側に傾いたり、銀の接着剤と鱗の厚い層で分離したりして、強力な電気接続を形成し、蚊の外れやワイヤーからの逃げを防ぎます。

ここで説明するプロトコルは、さまざまな蚊種を扱う場合に最適化する必要があります。特定の節足動物で記録するための最適なEPG設定(Riレベル、電圧、電流タイプ、およびハードウェアゲイン)は、実験的に決定する必要があります^12,30。ただし、オフセットを一度調整すると、同様の蚊を扱うときに再調整する必要はありません。Ae. aegypti²⁶ および Cx. tarsalis²⁷ を伴う AC-DC EPG の最適な設定が決定されています。追加の種の波形ライブラリ(表2で定義)は、蚊へのEPGの採用を促進します。また、蚊の種類や麻酔の選択によって摂血行動が異なる影響を受ける可能性があるため、目的の蚊の麻酔を最適化することも必要です。たとえば、Cx. tarsalis は CO₂ による 15 分間の麻酔後、4 時間の回復期間を必要としますが、Ae. aegypti の場合、氷による 15 分間の麻酔期間の後、15 分間の回復期間で十分です。しかし、キュレックス足根は低温にさらされても倒れにくいため、回復期間が長いにもかかわらず、主に_CO2が使用されています。

AC-DC EPGモニタは、オンラインリソース^30,31を確認したり、経験豊富なユーザによるトレーニングを行ったりした後、簡単に使用できますが、いくつかのトラブルシューティングが必要です。当初、著者の蚊プローブのEPG記録には、ワヤダンデらによって観測または報告されていなかった予期しない11Hzのサイン波がプレシグナルにあった²⁶。E. Backusとの協議により、ファラデーケージが干渉するグランドループが問題である可能性が高いことが示されました。下の表から分離するためにゴム足で支えられた大きなアルミニウム製床板にボルトで固定されたアルミニウムフレームに接続された高導電性の銅製スクリーンで構成された新しいファラデーケージ(図1B)は、11Hzのノイズ信号を解決しました(図3C、C')。さらに、EPG 電源を最初にオンにしたときに、整流前および整流後の信号が、直線で滑らかで細い線ではなく、太くてぼやけた線として表示されることがありました。これは通常、楽器の電源を切り、すべてのコード接続を確認することで修正されました。それが失敗した場合は、通常、機器のプラグを1〜3分間抜くと効果的でした。ごくまれに、動作中に事前信号と事後信号が太くあいまいになることがありますが、これは、機器の電源を切って別のコンセントに差し込むか、電圧レギュレータとパワーコンディショナーを使用してEPGを壁に接続する前に差し込むことで対処しました。理想的には、EPG モニターの専用ラインは、EPG³⁰ と同じ電気回路に接続された冷蔵庫やその他の機器から発生するライン ノイズを排除します。

現在、蚊の研究に EPG を使用することには、主に 2 つの制限があります。まず、どのプロービング挙動が波形に対応するかを検証するための相関研究はほとんど行われていません。各波形ファミリー(表1)および一部の波形タイプ(M1およびM2)で何が起こっているかについては強力な仮説がありますが、血液摂取が波形ファミリーM^26,27と相関していることを除いて、これらの仮説は実験的に確認されています。最も重要なことは、多くの病原体が唾液中に伝染するため、唾液分泌イベントに対応する波形を特定する必要があります。治療グループ間の波形の持続時間と数の有意な違いを有意義に解釈するには、EPG 波形と蚊の生物学的活性との相関関係が必要になります。次に、EPG 中のプロービングおよび取り込み率は、予想よりもはるかに低くなる可能性があります²⁷。蚊を短いワイヤーに個別につなぎ、宿主に直接置くと、探査や摂取行動に影響を与える可能性のある長距離の宿主探索行動や社会的摂食行動を防ぐことができます。正しく配線された昆虫は、正常に歩いたり飛んだりすることができます。それでも、蚊はワイヤーに引っ張られることが多く、時には絡まったり、不自然な角度で体を保持したりすることがあり、ワイヤーで接続されていることが蚊の行動にある程度影響を与えることを示しています。著者らは、EPG中のプロービング率を高めるための多くの戦略をテストし、蚊を一晩絶食させ、高齢者を使用し、手に置く直前に人間の息にさらし、人間の唾液を手に塗布することが最も効果的であり、蚊がプローブするのに理想的な位置にあることを確認するために、手の位置を常に微調整する宿主を使用した²⁷。

これらの制限にもかかわらず、AC-DC EPGには、プロービングおよび摂取挙動を研究するための他のアプローチに比べて多くの利点があります。BiteOScope¹¹、flyPAD¹⁵、および自動生体材料プラットフォーム¹⁴ などのシステムは、血液供給中のプロービングおよび摂取行動と唾液分泌物を定量化するように設計されており、正常な宿主組織システムと宿主の手がかりを欠いている透明な人工基質と流動食を利用しています。これらの合成プラットフォームは多くの実験目的に役立ちますが、AC-DC EPGの明らかな利点は、自然宿主システム内でこれらの節足動物の行動と関心のある変数を研究できることです。さらに、AC-DC EPGシステムのユーザ定義の適応性は、他のEPG機器^22,33およびEPGのような電子監視デバイス^16,21よりも追加の利点を提供しますが、これらは、最大量の情報で波形を取得し、広範囲の宿主および節足動物への悪影響を最小限に抑えるために必要な調整可能なRiレベル、電流タイプ、および電圧レベルを有しません^22、23.筋電図検査 (EMG) 技術は、血液供給の研究にも使用されます。しかし、電気回路は通常、節足動物のみを含み、記録電極に最も近い筋電位のみが記録されるため、波形は、細胞の破裂、スタイレットの位置と活動、口器を通るストリーミング電位など、宿主と昆虫の界面で発生する詳細な活動に関する情報を提供しません^28,34.生体内顕微鏡技術を使用して、生体宿主組織における詳細な口器の動きと活動を直接視覚化することができますが、これらの技術には、生きた動物モデル⁹での侵襲的処置が含まれます。AC-DC EPGモニターのみが、侵襲的な処置を必要とせずに、生きた不透明な宿主組織で発生するプロービング、摂取、および唾液分泌行動について非常に詳細な情報をリアルタイムで提供でき、さまざまな節足動物での使用に適応できます^10,12。

これは、蚊の配線、昆虫吸引器の構築、およびヒト宿主に対する EPG の実行に関する最初の詳細な段階的な手順です。これらのプロトコルは、人間の宿主を餌とする蚊に対する AC-DC EPG の採用を促進することが期待されています。AC-DC EPGを用いた将来の研究の例としては、血液摂取前のプロービング行動のステレオタイプなシーケンスの同定、口器を通る血流の調査、節足動物種/発達段階間の摂食可塑性の比較など、血液摂食と宿主組織損傷の基本的なメカニズム¹⁰に関する研究が含まれる可能性がある²⁶.EPGは、殺虫剤、摂食防止剤、忌避剤の効果を定量化するためにも使用できます¹²。AC-DC EPGを使用して人間の手に付いた蚊を研究するためのここで紹介する手順は、これらの研究を加速し、蚊の血液摂食者の生物学に関する新しい洞察を可能にします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
instrumentation
AC-DC 4チャンネル電気透過計	EPG Technologies, Inc.		EPGの場合、電源、コントロールボックス、スイッチインターフェースボックス、4つのヘッドステージアンプ、4つの基板電圧プローブ、および関連コードが含まれます
エアピロー	Amazon.com
EPG DI-710データ収集ハードウェア(ADボード)	DATAQ Instruments Inc.		アナログEPG信号をデジタル化して、コンピューターで視覚化できるようにするため
調光可能なLED拡大鏡、大きな5倍ハンズフリー拡大鏡、ライトと読書趣味のスタンド付きクラフトソーイングワークベンチ	Amazon.com		EPG中の行動観察用、EPG中にプラグを抜くか、ノイズが発生する場合があります
Dino-Liteエッジデジタル顕微鏡(倍率250倍)	Dino-Lite	AF4915ZT	EPG中の行動観察用
Dino-Lite Flex-arm デスクトップスタンド	カメラを保持し操作するための	Dino-Lite	MS22B
Eisco Steel Retort Base Stand and Rod Set	Fisher Scientific	S41740	ヘッドステージアンプを保持し、ファラデーケージを接地するための(金属製である必要があります)
EPG Online Workshop	UF IFAS Extension	https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022	AKA、EPGを学ぶための「オンラインリソース」(機器のセットアップ、データ収集と分析、ファラデー構造、銀接着剤の準備、昆虫の切り株構造など)
Furman P-1800 AR パワー レギュレーター/パワー コンディショ	Amazon.com		ライン ノイズの低減
小さなバブル クッション ラップ	Amazon.com		ホストとファラデー ケージの間のバリアとして使用
Troemner Talboys Labjaws レギュラー クランプ ホルダー	フィッシャー サイエンティフィ	02-217-121	ヘッドステージ アンプを保持し、ファラデー ケージを接地します (金属製で、プラスチックでコーティングされていない必要があります)
Windowsコンピュータ	EPGおよび統計分析用	ベストバイ
Software
Backus 2.0データ分析SASプログラム	UF IFAS拡張ファイル	https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/	波形データの統計解析用
Ebert 1.0ファイルマニピュレータ、エラーチェッカーSASプログラム	UF IFAS拡張ファイル	https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/	波形データの統計解析用ファイルの準備用
、SASバージョン9.4	SAS Institute Inc.		波形データの統計解析用
WinDaq Lite	DATAQインスツルメンツ株式会社		EPGデータの記録とレビュー用。 WinDaq Hardware Managerソフトウェア(AKA「ハードウェア管理ソフトウェア」)とWinDaq Waveform Browserソフトウェア(AKA「波形レビューソフトウェア」)が含まれます。Windowsコンピュータでのみ使用してください。
ファラデーケージ
アルミスクリーンフレーム	ホームデポ	MSCF5167	for  ファラデーケージ
アルミニウムシートの壁、0.125(1/8)厚さ3003-H14	金属デポ	S318	ラデーケージ
コーナーブレースのベース用、1"	ホームデポ	339547	のための ファラデーケージフラット
ヘッドフィリップス小ネジ、#6-32 x 1 "	ファラデーケージ建設フラット
ワッシャー、#6	ファラデーケージ建設用	ホーム・デポ	・638977
Fluke 15B+ デジタル・マルチメーターは、電気アプリケーション向けで、最大 1000V および 10A の AC/DC 電圧および電流測定、およびファラデー・ケージ
ポータブルラジオAM FM、ラウドスピーカー、ヘッドフォンジャック、長距離受信用の2AA電池式ラジオ、ファ	ラデーケージ	Amazon.com
、0.11線径の16 x 16メッシュ、36インチ x 12フィート	メトロスクリーンワーク		ス ファラデーケージ
ラウンドヘッドコンボ小ネジの壁、 #6-32 x 3/4 "	ファラデーケージ建設用	ホームデポ	528466
サンドペーパー、1/2 "x 1"、150グリット	ホームデポ	19036-20-CC	底から塗料を取り除くための
5/16 "	ホームデポ	WCORN516	for  ファラデーケージ
スクリーンスプラインの壁、0.14"	ホームデポ	3034719	for  ファラデーケージの壁
Insect Stubs
Brass Escutcheon Pins	ホームデポ	801294
銅線、昆虫の切り株を作成するための20 AWG	Amazon.com
ハリス水溶性インフルエンザ	昆虫のスタブワイヤーをはんだ付けし、強力な接続を形成するのを助ける	ためのホームデポ	355398
ニードルノーズプライヤー	昆虫のスタブを構築するときにワイヤーを曲げるための	ホームデポ
Pro's Kit 900-015 はんだ付け	エスカッシャンピンを保持するための	Amazon.com
ロジンコア付き)	ホームデポ	296497	昆虫の切り株を作成するための
ワイヤー カッター ストリッパー ツール	ホーム・デポ		リッピングおよび切断用銅線 昆虫の切り株を構築するとき
YIHUA 928D-III はんだごて、110W ハイパワー、昆虫の切り株を構築するための完全デジタル ディスプレイ はんだごて	Amazon.com		;クリーニング用のスタンド、スポンジ、スチール ウールが付属しています
昆虫吸引器
Accuris ASPIREラボラトリーアスピレーター	Accuris機器	V0020	;ハンドヘルド真空コントローラ、細い先端(40mm)ステンレス鋼アダプタ、およびピペットチップアダプタChemglass
Life Sciences Pasteurピペット、蚊
改良	されたパスツールピペットを真空ラインに取り付けるための	ホームデポ
蚊帳ユーティリティファブリック、10 x 10 cm四方	Joann Fabrics	16651622	蚊が真空ポンプに吸引されるのを防ぐための
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16	Fisher Scientific	50-206-8914	異なる改造パスツールピペット間の迅速かつ容易な切り替え
Thermo Scientific Nalgene HDPE Quick Disconnects (3/8 to 7/16 in.I.D.)	Fisher Scientific	15-315B	は、異なる改質パスツールピペット
Silver Glue
Elmer's Glue-All Multi Purpose White Glue	Amazon.com		for silver glue preparation
シルバーフレーク 99.9% 純粋、  4-8 & マイクロ;m	ThermoFisher	786.09	銀接着剤調製用
シルバーフレーク 純度 99.95% 純 8-10 & マイクロ;m	Inframat Advanced Materials	47MR-12F	銀接着剤製剤用
Insect Anesthesia
CO2 バブラーキット、1000 mL、#9 ラバーストッパー	FlyStuff	59-181	パッド使用中の昆虫の乾燥を防ぐための
パッド フレーム、蚊	がフライパッドから落ちるのを防ぐための	FlyStuff	59-118
フライパッド	ときの静電気を減らすための	FlystationブラシFlyStuff	59-205
Flystuff フライパッド 標準サイズの	FlyStuff	59-114	AKA "麻酔パッド"蚊の麻酔用
漏斗(直径4インチ)	Amazon.com		フライパッドに移す前に蚊のカップをガスで処理するための
プレキシガラスまたは平らなプラスチックの蓋(サイズにカット)	デポ	MC-27	蚊が目を覚ま
し始めた場合にフライパッドを覆うためのフライパッドと漏斗の間でガスを迂回させるためのプラスチックチューブホースクランプシングルポジションと調整可能なオープン(バラエティ1/8インチから1/2インチ)	Amazon.com
シングルステージCO2レギュレータ	2 tank」からのガスの流れを調整するための	フライスタッフ	59-142
T”フライ	パッドと漏斗の両方をCO2タンクチューブに接続するための	FlyStuff	59-123
、クリア	FlyStuff	59-124C	、漏斗とフライパッドを CO2 タンクのレギュレーターに接続するための
Insect Wiring
Black cardstock, (65Lb, 176 g/m2) 8.5" x 11"	Michael's Stores Inc.	金線を視覚化しやすくする	327826
黒い画用紙の正方形 3.5 インチ x 4.0 インチ	プル		956221 金線を視覚化しやすくする
球	Amazon.com		蚊を空腹させる
クラフト フォーム #12 ブロック (3.1 cm x 17.2 cm x 30.2 cm)	Joann ファブリック アンド クラフト ストア	ワイヤード カを保持するための	1941079
フレクト リボンディスペンサー、	金線を保管するための	Amazon.com
操作のための	フェザー級昆虫学鉗子	フィッシャーサイエンティフィック	S72110
ファイン鉗子(FST by Dumont:#5 91150-20、Inox-Electronic)	サイエンスツール	91150-20	蚊を配線するときに金のループを作るための
ペイントブラシ	Amazon.com		配線およびEPG中に蚊を操作するため。EPGに使用する場合は、プラスチックまたは木製のハンドルが必要です
細い先端の標準トランスファーピペット、狭い、5.8 mL	接着剤の準備用	トーマスサイエンティフィック	7761D21
金線、純度99.99%、厚さ0.025 mm	蚊を配線するための	Goodfellow	AU005121
Minutienピン、先端0.2 mm、1 cm	蚊に接着剤を塗布するための	フィッシャーサイエンティフィック	NC9681411
紙コップ	硬質紙管
ピンバイス	フィッシャーサイエンティフィック	50-996-811	昆虫の配線中に微細なピンを保持するため
蓋付きプラスチック収納ボックス (7 インチ x 9 インチ x 14 インチ)	Amazon.com		配線された蚊を輸送するための
プレキシガラスまたは平らなプラスチックの蓋 (サイズに合わせてカット)	ホームデポ	MC-27	蚊が目覚め始めた場合にフライパッドを覆うため
自己閉鎖鉗子	ッシャーサイエンティフィック	08-906	金線の保持と操作
用圧縮ガス
CO2 gas タンク	マセソン フライ		パッドで蚊を麻酔するための
Common Lab Items
バイオハザード使い捨てオートクレーブバッグ、8 1/2 "x 11"	フィッシャーサイエンティフィック	03-410-591	供給蚊の処分用
ブンゼンバーナーまたはプロパントーチ	Amazon.com		パスツールピペットの改造用
着色された実験室テープ	Daiggerサプライ	EF9763R	、銀接着剤の準備、およびマスキング鉗子
使い捨てピペットチップ、1000 & マイクロ;L	フィッシャー・サイエンティフィック		銀のりを作るときの水の分注
解剖顕微鏡	蚊を配線するための	ライカマイクロシステム
解剖プローブ	フィッシャーサイエンティフィック	NC9109673	銀の接着剤を適用する
三角フラスコ、1000mL	ッシャーサイエンティフィック		フライパッドエタノール使用中の昆虫の乾燥防止用
、70%	フィッシャーサイエンティフィ	04-355-122	逃げた蚊を回収するための
ガラスシャーレ フィ	ッシャーサイエンティフィック	08-747B	氷で蚊を麻酔するための
手袋 フィ	ッシャーサイエンティフィ		保護のための
キムワイプ キムテックサイエンスブランドの繊細なタスクワイパー	蚊を粉砕するための	フィッシャーサイエンティフィック	06-666
ラボコート 個人	保護のための	フィッシャーサイエンティフィック
LiBaスプレーボトル、詰め替え可能な空のスプレーボトル(消毒用アルコール金庫)	Amazon.com		逃げた蚊を回収するための
マグネティックスターバー、長さ2cm	ッシャーサイエンティフィック		銀の接着剤を混ぜるための
機械式シングルチャンネルピペット、1000 & マイクロ;L	フィッシャー・サイエンティフィック	13-690-032	銀のりを作るときの水の分注用
量遠心チューブ、1.5 mL	フィッシャーサイエンティフィック	銀のり	780420
;	フィッシャーサイエンティフィック	50-998-944	銀接着剤のチューブを密封するための
プラスチックラップ	Amazon.com		フォームブロックを覆うための
パイレックス20 mLビーカー	フィッシャーサイエンティフィック	07-250-051	銀のりを混ぜ合わせる
セミミクロバランス	フィッシャーサイエンティフィック	10-919-370	糧量用接着剤とシルバーフレーク
シャーピーペン、	ラベリング用	Amazon.com
片刃	片刃 電子顕微鏡科学	71980	昆虫の切り株を洗浄用
標準使い捨てトランスファーピペット	フィッシャーサイエンティフィック	133-711-7mL	銀のりを保存チューブに移す用
攪拌板	フィッシャーサイエンティフィック		銀のりを混ぜるため
タイマー/ストップウォッチ	フィッシャー・サイエンティフィック		宿主が各昆虫にさらされる時間を計る
超純水(18 MΩ)水	フィッシャー・サイエンティフィック		銀の接着剤の準備用
ユーティリティはさみ	線を切断するための	フィッシャーサイエンティフィ	08-945
ボルテックスミキサー	フィッシャーサイエンティフィック		銀のりを混合するため
研究生物
Culex tarsalis蚊	USDA ARSの穀物および動物の健康研究センター、カンザス州マンハッタンで研究	対象として使用するため