組換えペプチドタグ特異的位置制限照射強化ビオチニル化に基づく細胞内リボソームサブポピュレーションの単離

サマリー

AviTag特異的位置制限照明強化ビオチニル化(ALIBi)は、リボソームの細胞内集団を標識し親和性を精製し、下流のシーケンスおよびプロテオーム解析のために開発された新しいオプトジェネティック活性化法です。

要約

増え続ける証拠は、mRNA翻訳が細胞内で高度に区画化されたプロセスであり、細胞内での輸送と特定のmRNAの局在化が、理想的な環境で適切な量でコンパートメント特異的機能を持つタンパク質を産生するために鍵であることを示唆しています。しかし、これらのmRNAを翻訳するリボソームの細胞内分離や特性解析の技術はこれまで限られており、翻訳機構の組成が局所化mRNA翻訳の調節にどのように寄与するかについては多くが解明されていません。

ここでは、エピトープタグ付け、新たに開発された光遺伝学活性化スプリットビオチンリガーゼ、アフィニティ精製を組み合わせて、関心のある任意の細胞内区画に局在するリボソームを迅速かつ特異的に標識・分離するAviTag特異的Location-Restricted Illumination-enhanced Biotinylation(ALIBi)を実証します。まず、CRISPR/Cas9編集を用いてAviTagペプチド、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ切断部位、FLAGエピトープタグをリボソームタンパク質に融合させます。分裂したビオチンリガーゼは細胞門標的ドメインに融合し、この細胞株で発現し、通常のビオチン濃度では不活性です。補助的なビオチンと青色光照射によって活性化されると、リガーゼは近傍のAviTaggedリボソームをビオチニル化し、ストレプタビジン被覆ビーズ上のビオチン化リボソームおよび関連するタンパク質やmRNAの親和性精製を可能にします。TEVプロテアーゼ切断による非変性洗脱により、コアリボソームタンパク質、リボソーム関連タンパク質、リボソーム結合mRNAの下流特性解析に適したサンプルが得られます。

本プロトコルでは、AviTagをリボソームタンパク質に融合させ、分裂したビオチンリガーゼ酵素を目的のオルガネルに標的化するための設計原則をレビューします。ALIBiシステムの活性化、細胞溶解、親和性精製、サンプルの洗脱を実証しました。最後に、典型的な結果とトラブルシューティングについて話します。

概要

特定の細胞内区画から生物学的サンプルを分離し、細胞内組織化や輸送が細胞プロセスにどのように関与するかをよりよく調査できるツールの重要性があります。mRNA翻訳はその代表的な例であり、増え続ける証拠は翻訳が非常に区分化されており、特に多くのmRNAはそのコードされたタンパク質が所在する小器官に局在していることが示唆されています^1,2。しかし、翻訳機構の細胞内局在についてはあまり知られていません。リボソームは核小体と核内で存在を始め、ここでリボソームタンパク質(RP)とリボソームRNA(rRNA)からの組み立てが始まります。その後、細胞質に輸出され組み立ての最終段階を経て、^mRNA3,4の翻訳を開始します。翻訳の標準的な部位には細胞質および小胞体が含まれます。後者は、膜に結合された小器官や細胞外分泌物に向かう整合性タンパク質を合成する場所^です。より最近特定された局所翻訳部位には、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、神経細胞プロセス6,7,8,9,10,11,12があります。興味深いことに、リボソーム関連タンパク質、翻訳後修飾、rRNA修飾、コアリボソームタンパク質の非標準的化学量論などの翻訳機構の特徴が、特定のmRNAや翻訳忠実度や翻訳精度、^13,16、17のパラメータの翻訳を制御する調節機構に関与するという証拠も生まれつつあります^{。18、19、20}。例えば、リボソームと相互作用する数百のタンパク質が特定されており、これらは細胞内リボソーム組成の違いを引き起こす^{可能性があります。}しかし、細胞内リボソーム集団を単離する技術はこれまで限られています。したがって、翻訳機構の組成が局所的なmRNA翻訳の調節にどのように寄与するかについては、多くのことが未解決のままです。特に哺乳類モデルシステムと互換性のある細胞内リボソーム集団を分離するための多用途な方法の登場により、これらの翻訳機構の特徴を細胞内レベルで探求できるようになります。

リボソームを含む細胞内画画を分離する最も初期の方法は、連続的な溶解と遠心分離の原理に基づいていました^21,22。通常、これらの方法は特定の小器官に限定され、しばしば長い処理時間を必要とします。より新しい方法としては、ビオチンリガーゼBirAを基にしており、これはAviTagペプチド基質10,23,24を特異的にビオチニル化します。BirAは、リボソームにAviTagでタグ付けされた細胞内の関心小器官に遺伝的に局在することができます。しかし、BirAは生理学的濃度のビオチンで活性であるため、AviTag保有リボソームの構成的かつ非特異的なビオチニル化を避けるためには、ビオチン枯渇条件下で細胞培養が必要です。^10,24。これにより、ビオチン欠乏に感受性の高い細胞タイプでのBirAの使用が制限されます²⁵。最後に、BioID、TurboID、APEX 26,27,28などの遺伝子組み改変酵素を用いた多発ビオチニル化法が開発されています。誘導すると、これらの酵素は反応性ビオチン中間体を産生し、酵素の半径内のリジン残基を共有結合的に修飾します。プロミスカス・ビオチニル化法は細胞内プロテオームのマッピングに非常に有用ですが、局在リボソーム周辺のタンパク質を識別するには、リボソームに近いタンパク質よりも情報量が少ないです。

ここでは、AviTag特異的位置制限照明強化ビオチニル化(ALIBi)と呼ばれる、細胞内リボソーム集団の標識および分離法を新たに開発した方法を実演します。この方法は、青色光照射下でヘテロ二量体化するオプトジェネティック強化マグネット(eMag)スイッチ(図1A)に融合した分割型BirAを活用します²⁹;また、FLAGエピトープ、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ切断部位、AviTag(FTA)がRpl31リボソームタンパク質に融合したペプチドタグ(図1B)が存在します。分裂酵素は選択された小器官に遺伝的に標的化でき、生理的濃度のビオチンでは不活性であり、ブルーライト照射と補助ビオチンの追加で数分以内に再構成可能です(図1C-E)。その後の細胞溶解、親和性精製、TEVプロテアーゼ切断による非変性酵素的溶出により、リボソームやmRNAやリボソーム関連タンパク質などの共精製分子が生成され、これらはRNAシーケンシングや質量分析プロテオミクスなどの後続解析法に適しています(図1A)。したがって、この方法はリボソームの組成だけでなく、リボソームが結合するmRNAも明らかにします。ALIBiを細胞内リボソーム集団の特徴付けに画期的な応用を報告した最近の論文では、分裂酵素を細胞質、核小体、核、小胞体、細胞膜、ミトコンドリアに標的化することに成功しました(表1)³⁰。これらの細胞下区画間の翻訳機構の比較により、小胞体およびミトコンドリアにおける翻訳に関する新しく予想外の発見が得られ、核および核小体のリボソーム生合成因子の将来の研究の潜在的な手がかりとなりました。

このプロトコルには、ALIBiシステムのトランスフェクションと活性化、細胞溶解、親和性精製、サンプル洗脱の詳細な実証が含まれています。また、ウェスタンブロットによる親和性精製の成功を検証する方法や、下流RNAシーケンシングや質量分析(MS)プロテオーム解析の実施に関する推奨事項も議論します(補 足ファイル1参照)。このプロトコルは、Rpl31を内因性Rpl31遺伝子座からFTA(L31-FTA)にホーモ接合して発現するマウス胚性幹細胞(mESCs)を用いた実験のために作成されています。この細胞株は著者から要望に応じて提供可能です。この細胞株を生成する戦略は補 足ファイル1 および 補足図S1 および 補足図S2に記載されています。分裂酵素をコードするプラズミドは複数の細胞小器官に標的として存在します(カタログ番号#235608から235643)。分裂酵素をこれらの小器官に標的とする設計原理は 補足ファイル1に記載されています。プロトコルでは、各サンプルが10cmプレートで培養されたmESCから来ると仮定しています。10cmスケールは質量分析プロテオミクスに十分な材料を提供し、6ウェルスケールはウェスタンブロットやRNAシーケンスに十分であることがわかりました。

プロトコル

1. mESC細胞培養

注:ALIBi活性化および細胞溶解の前には、mESCは細胞培養において標準的な無菌技術で取り扱うべきです。完全なmESCの遠心分離は、特に指定がない限り室温で200 × g で3分間行うべきです。使用前に、特に指定がない限り、水浴で37°Cまで予温された媒体を行ってください。mESCは一晩ゲラチン化した新鮮な組織培養プレートに移行させるべきです(ステップ1.1参照)。

1. L31-FTAのmESCを解凍する前日に、10cmのプレートの底面に0.1%ゼラチン5mLを塗ります。37°Cで一晩抱卵します。
2. mESCメディア成分を組み合わせ(表2)、0.2μmフィルターを通します。4°Cで最大1ヶ月間保存してください。
3. 解凍当日には、溶けた細胞を希釈するために培地5mLを温め、培地を10mLで装填します。
4. 液体窒素貯蔵から~5 × 10⁶ L31-FTA mESCを含むクライオビアを回収します。すぐに37°Cの水浴で瓶の底をくるくると回して解凍します。
5. バイアル容量が許す限り、5 mLの培地から0.5〜1 mLの培地をクライオビアル内容物と優しく混ぜ、その後クライオヴィアル内容物を5 mL mediaのアリコートに戻します。
6. 遠心分離で細胞をペレット状にします。上清液を吸引してください。
7. 細胞ペレットを10mLのメディアアリコートで再懸濁します。
8. 10cmプレートからゼラチンを吸引し、すぐに細胞懸濁液をプレートに移します。37°Cで孵化します。
9. 24時間ごとに(排出日を除く)プレートから古い培地を吸引し、新しい培地10mLに交換します。
10. コロニーが70%〜80%のコンフルになったら(通常はプレートから48時間後)、古い培地を吸引し、10mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で2回うすいでいます。
11. DPBSを吸引した後、プレートに0.05%トリプシン2mLを塗布します(表2参照)。37°Cで5分間孵化します。
12. プレートに4mLの冷たいmESC培地を加えてトリプシンを中和します。すぐに5mLまたは10mLの血清学的ピペットでプレート内で上下に15回ピッピングし、コロニーを単細胞懸濁液に解離させます。
13. サスペンションを円錐形のチューブに移します。オプションとして、血液細胞計を使って細胞数を数えるためにアリコートを除去することもできます。
14. 遠心分離で細胞をペレット状にします。上清液を吸引してください。
15. 細胞ペレットを新しい培地に再懸浮させます。新しくゼラチン化した10cmプレートに5個×10個^の6細胞(通常1:6のパスゲージ比)をプレートし、37°Cで培養します。 必要に応じてステップ1.9–1.15を繰り返し、トランスフェクションを進める準備が整うまで続けます。
16. 凍結セルストックを作るには、mESCのプレートをトリプシン化します(ステップ1.10–1.14の手順通り)。細胞ペレットを冷凍培地(5×10個⁶ 細胞あたり250–500μL)に再懸浮させ、クライオビアルに分割し、-80°Cの細胞冷凍容器で一晩ゆっくり冷凍してから液体窒素貯蔵に移します。

2. トランスフェクション

注意:mESCが通過準備が整った日にトランスフェクションを行うこと。プラスミドはトランスフェクション後3〜5時間で発現を始めることがあります。発現後は、暗闇での細胞を扱い、早期活性化を防ぐために37°C以下の温度への曝露を最小限に抑えることを推奨^{します。過去}の研究では、磁石光の光形成ドメインは青色光照射下だけでなく、寒さにさらされるとも二量体化することが示されています。皿は専用のインキュベーターに入れるか、共有インキュベーターの棚をアルミホイルで光から遮るのも良いでしょう。インキュベーターの外でセルを扱う際は、事前にすべての部屋の照明や窓を消すか遮断し、赤いライトヘッドランプを使って視界を確認してください。インキュベーターの扉を必要以上に長く開けっぱなしにしないでください。一度に少量ずつプレートをインキュベーターから取り出し、取り扱い中は断熱面(すなわち清潔な発泡スチロールの箱蓋)の上に置き、室温の作業面との接触を最小限にしてください。使用前にメディアを十分に温めてください。発光顕微鏡でプレートを検査しないでください。

1. トランスフェクションの前日に、10cmのプレートをゼラチン化してください。
2. トランスフェクション当日には、プレートからゼラチンを吸引し、7.5mLの培地を加えて37°Cで予温します。 細胞の再懸濁のために37°Cで還元血清培地を予温します。
3. トランスフェクション試薬18.75 μLを250 μLの還元血清培地に希釈します。そっと叩いて混ぜ、室温で5分間孵育します。
4. NおよびCフラグメントをコードする2つのプラスミドを共発現する場合は、各プラスミド3.75 μgを還元血清培地250 μLに加えます。もし1つのプラスミド(すなわちGFP陰性対照群または全長のBirA陽性対照群)のみを発現する場合は、代わりに単一プラスミドを7.5μg添加します。
5. プラスミド/還元血清培地の混合物をトランスフェクション試薬/還元血清培地の混合物に加え、タップ/反バージョンで混合します。室温で15分間培養します。
6. その間に、トリプシン化してmESCをペレット化します(ステップ1.10–1.14)。ペレットを温めた還元血清培地に10 ×⁶ cells/mLの濃度で再懸浮させます。
7. プラスミド/トランスフェクション試薬/還元血清培地混合物に7.5個×10^個6個 (750μL)の再懸濁細胞を加えます。チューブを反回転させて混ぜます。RTで10分間培養し、時折チューブを逆さまにして細胞を懸浮させます。
8. 再びチューブを短く反転させ、mESC/プラスミド/トランスフェクション試薬/還元血清培地混合物を温めた培地を含むプレートに加えます。プレートを優しく揺らして細胞が均等に分布するようにしてください。
9. プレートを37°Cで3〜5時間培養し、その間に細胞が付着します。
   注意:今後は、光や37°C以下の気温への曝露を避けるための上記の注意点を守ることを推奨します。
10. 古いメディアを優しく吸い込みましょう。新鮮に温めた培地を加え、細胞が外れないようにプレートの側面をピペットで下ろします。37°Cで孵化を再開してください。
11. トランスフェクションから24時間後に活性化/溶解した場合はセクション3に進みます。トランスフェクション後48時間で活性化/溶解を計画している場合は、トランスフェクト細胞をプレートしてから~24時間後に培地を交換してください。

3. ALIBi活性化と細胞溶解

注意:溶出開始(ステップ5.4)までは暗闇で細胞やサンプルを扱い続けてください。細胞を氷で冷却した後(ステップ3.15)、サンプルを冷蔵し、洗脱開始まで冷たい試薬のみを使用します。作業面、機器、試薬、プラスチックは、開封したての商品を使用し、硬い表面はRNAse除染液と70%エタノールで拭き取るかすすぎます。サンプルや機器を扱う際は手袋を着用してください。MSプロテオミクス用サンプルの場合、作業スペースを粉塵を保つことでケラチン汚染を最小限に抑えることも重要です。素肌を隠し、長い髪を後ろで結びましょう。

1. 遠心分離機を4°Cまで予冷します。
2. 照明を消した状態で、トランスフィクションされたプレートを一時的な37°Cのインキュベーターに移し、トランスイルミネーターを設置した後のメインインキュベーター内の温度変動にさらされないようにします。
3. 青色光トランスイルミネーターを70%エタノールで拭き取り、電源に接続してください。トランスイルミネーターをメインインキュベーターに置き、設置を続ける間、インキュベーターの条件が再び平衡するのを待ちます。
4. ビオチンとシクロヘキシミド(CHX)(10 cmプレートあたり10 mLの培地)を37°Cまで温めます。 補助ビオチンなしで対照サンプルを運用する場合は、CHXのみを投与するための別のアルコットを温めてください。
   注意:一部のバッファ成分は使用前日に混合し、4°Cで一晩保存することができます( 表2参照)。なお、ウェスタンブロットやMSプロテオミクス用の実験とRNAシーケンス用の実験には、異なる溶解液とウォッシュバッファーのレシピが使用されました。
5. DPBSのアリコートを冷やしてCHX(10cmプレートあたり20mL)を投与します。
6. RNAse除去バッファー、ソルトウォッシュ、リシスバッファー、ウォッシュバッファーを準備します( 表2参照)。グリセロールやトリトンX-100などの高濃度・粘性成分を含むバッファーは、均一な混合を確保するために完成したバッファーをピペットで処理します。使用前にバッファーを氷で冷やしてください。
   注意:ビーズ洗浄の手順では、現在のバッファー内のビーズ入管をポケット遠心分離機で短く回し、底部の内容物を回します。チューブを磁気ラックに1分間置くか、ビーズが完全に移動するまで放置します。ビーズペレットに触れずに上清液を吸引します。ビーズペレットが乾く前に、次のバッファーを加えます。ビーズペレットを再懸垂させるには、ピペットで優しく使うか、閉じたチューブを指の間で転がしながら磁石に押し付け、磁石によってビーズを素早く複数の方向に引き寄せます。最後に、再懸り下げたビーズを何度か逆さにして、チューブの内壁が洗われるようにします。
7. ストレプタビジンビーズのストックボトルを優しくピペットや揺らして再懸浮させます。10cmのmESCプレートごとに 450μL のビーズをタンパク質の低結合チューブに移します。
8. 上記のビーズ洗浄に関する注意に従い、ビーズ貯蔵バッファーを廃棄し、900μLのRNAse除去バッファーで2回洗浄します。
   注意:次のステップに遅れなく進んでください。RNAse除去バッファーでの長時間の滞在は、ビーズの結合能力を低下させる可能性があります。
9. ビーズを900μLの塩水で1回洗います。
10. 900μLのウォッシュIバッファーでビーズを2回洗います。2回目のウォッシュIバッファーでビーズを再懸濁した後、活性化と細胞溶解を行いながら4°CのウォッシュIバッファーにビーズを保存します。
11. 加熱された培地に、適切な場合にビオチン(最終濃度50μM、希釈した50 mMストックの1:1,000希釈)およびCHX(最終濃度100 μg/mL;1:100 mg/mL希釈)を加えます。使用まで37°Cで保ちます。
12. CHX(最終濃度100μg/mL;100mg/mLの1:1,000希釈液)をDPBSの冷たいアリコートに加え、使用まで冷やしておきます。
    注:以下の2つのステップは、補助的なビオチンおよびブルーライト照明によるALIBiの活性化について説明します。理想的な活性化期間は、下流アッセイで十分な量のリボソームビオチニル化が得られるのに十分長く、時空間の分解能を保つために十分短いことが求められます。理想的な活性化時間は、細胞型、実験の規模、分裂酵素の発現レベル、関心のある小器官近くのリボソームの存在量、分析技術の感度などのパラメータによって異なる場合があります。私たちは15分を開始点として推奨しており、これは代表的な結果(図2)および付随する作業で用いられた有効化時間³⁰分です。
13. トランスフェクトしたプレートから培地を吸引します。すぐに1プレートあたりCHXを含む温かい培地10mL±ビオチンを加えます。
14. 陰性コントロールプレートが点灯しない場合は、暗いインキュベーターに入れてください。プレートを照射するには、トランスイルミネーターの上に直接置き、スイッチを入れて15分間孵化させます。
15. 照明が完了したら、すぐに1枚あたり10mLの冷たいDPBS+CHXでプレートを2回洗います。洗う間と洗った後に皿を氷の上に置いてください。2回目の洗いを吸い取った後、プレートを傾けて残留するDPBSを吸引します。
16. 各プレートをできるだけ平らに氷の上に置き、次に2mLの氷冷溶解緩衝液を加えて溶解に進みます。プレートを氷の上で5分間培養し、その間に2〜3回プレートを叩いて細胞を外します。
    注意:ホイルの下で暗く、氷の上に置くと、この期間中にプレートを細胞培養エリアから別の暗い空間に移動させることができます。
17. 残った細胞はマイクロピペットでプレート表面上でリセートを上下にピッピングし、泡の形成を防ぎながら除去し、その後冷蔵・標識されたタンパク質の低結合チューブにリセートを移します。
    注意:任意:核や核小体のように溶解が難しい小器官の中には、超音波検査が効果的になることがあります。
18. 溶解が難しい小器官の場合、実験中のすべてのサンプルを4°C(出力3ワット)で45秒間超音波処理します。ソニックケーターの設計でオープンサンプルチューブへのプローブ挿入が必要な場合は、超音波検査中の溢れを防ぐために、まずプレートからより大きなチューブに溶解液を移してください。その後、2mLチューブに移します。
19. 溶解液を氷で15分間孵化します。
20. 溶解液を17,000 g × 4°Cで3分間遠心分離します。 上清液(浄化溶解液)を細胞デブリのペレットを乱さずに冷やした低結合タンパク質チューブに移します。
    注:RNA-seq解析を意図している場合、精製済み解体液のアリコートを総RNA分数として収集できます(詳細は 補足ファイル1「RNAシーケンスの推奨」ステップ1.1参照)。
    注:細胞量、トランスフェクション/培養条件、溶解条件がすべてのサンプルで均一であれば、通常はサンプル間で溶解液濃度が比較可能とみなし、総タンパク質濃度の定量は行いません。これにより活性化から親和性精製までの経過時間を最小限に抑えます。

4. 親和性精製

1. 洗ったストレプトアビジンビーズを磁気ラックでペレットで塗ります。ウォッシュIバッファーを吸引してください。
2. 洗浄ビーズを含むチューブに1,200μLの精製溶解液を移します。ピペットで優しくビーズを再浮下させます。残りの精製溶解液は-80°Cで保存します。
3. 溶解液とビーズを4°Cの暗い場所でチューブローテーターで1時間キュベートします。
4. このインキュベーション中にTEVのエクストバッファーを準備します(表2)。

5. 洗脱

1. セクション3のビーズ洗浄のメモに従い、ビーズを磁気ラックにペレットし、上清液を冷やした低結合タンパク質チューブに移します。上清液は-80°Cで保存してください。
2. ウォッシュビーズを2回、900μLのウォッシュIバッファーで洗います。
3. ウォッシュビーズは900μLのWash IIバッファーで1回ずつ処理します。
   注:この工程が完了すると、サンプルを暗闇で扱う必要はありません。
4. ビーズに450μLのTEV溶出バッファーを加えます。
5. ビーズを室温でチューブローテーター上で1時間キュベートします。TEV溶出バッファーの低容量を用いた小規模実験では、チューブをシェーカーで1,000〜2,000rpmで培養してください。
6. 磁気ラックにビーズをペレットで落とします。エリューートをタンパク質の低結合チューブに移します。プロテオミクス解析やウェスタンブロットを意図する場合は、溶出液を-80°Cで保存してください。 RNA-seq解析を意図している場合は、エクス プリメンタルファイル1 「RNAシーケンシングの推奨」ステップ1.2のエクスチェンジ保存手順を参照してください。
7. オプション:親和精製でかなりのrRNA/mRNAが得られたかどうか(リボソームが単離されたことを示す)を事前に判断するために、TEV洗脱バッファーをブランクとしてマイクロボリューム分光光度計で洗い出します。
   注意:活性化されたシステムを含む細胞からの解散物は、分裂酵素、青色光/ビオチン、またはL31-FTAを欠く細胞からの洗散液よりも260 nmで高い吸収を持つべきです。

6. ウエスタン・ブロット

注意:溶除液および流過サンプルがLaemmliバッファーで変性されるまでは、光への曝露を避けることを推奨します。プレキャストゲル、市販のトランスファーバッファーおよびランニングバッファー、そしてセミドライトランスファーシステムを使用しています( 材料表参照)。SDS-PAGEおよびウェスタンブロットは、以下に特に記載がない限り、これらの部品に関する製造指示に従って行われます。

1. 溶解液、フロースルー、または溶出サンプルに6個のラエムリバッファーを加え、最終濃度は1個のラエムリバッファーにします。ヒートブロックまたはサーモサイクラーで95°Cで10分間加熱します。チューブの蓋や壁に結露ができたら、チューブを短く回転させてください。
2. タンクメーカーの指示に従い、ゲルタンク内にランニングバッファー付きのゲルを設置してください。サンプルとはしごを積み込め。
3. 125Vで45〜75分間、染料の前面がゲルの底に近づくまで動かします。その間にPBSTおよびブロッキングバッファを準備してください(表2)。
4. 転送システムの製造指示に従ってセミドライトランスファーを行います。
   注意:すべての膜洗浄・インキュベーション作業では、膜を完全に浸透させ、膜トレイを軌道または傾斜式ロッカーに置いてください。10×15cmのトレイには25〜50mLのバッファーが必要です。
5. 膜を移送スタックから取り外し、すぐに次のステップに進んで膜が乾燥しないようにしてください。
   注意:任意:膜の乾燥した部分は、特にストレプタビジン・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼのようにインキュベーションが短いプローブでは、不均一なブロッキングやプローブ結合を引き起こすことがあります。この問題を避けるため、移植後は100%メタノールで30秒、その後水に5分間浸して再度湿らせます。この措置は、移送後に乾燥したPVDF膜の再湿潤に関する一般的な推奨事項に類似しています。^32,33。
6. 膜をPBSTで室温で3回10分洗います。
7. 各ウェスタンブロットプローブの表 3 に指定された条件に従い、ブロッキング、洗浄、プローブ培養、二次抗体培養を行います。
8. ステップ6.7の最終洗浄後、メーカーの指示に従ってECL基板成分を混ぜ、膜に均一にコーティングします。化学発光ゲルイメージングシステムで画像をキャプチャします。

結果

ウェスタンブロット(プロトコルセクション6)は、実験の成功を予備的に評価する最も迅速な方法です。ストレプタビジン-HRPで膜を探査すると、システムの全成分が存在する細胞からの溶解液にはビオチニル化L31-FTAに対応するバンドが含まれているはずです(図2A、レーン20)。同じバンドは、通常はより強い強度で存在し、細胞を正の対照として全長のBirAをトランスフェクトした場合に存在します(図2A、レーン1–4)。このバンドは、システムコンポーネントが1つ以上省略されている場合(図2A、他のすべてのレーン)では、より薄いか存在しないはずです。哺乳類の細胞は70–80および120–130 kDaの範囲にある複数の内因性ビオチニル化カルボキシラーゼタンパク質を含^{んでいるため、}通常すべての...

ディスカッション

ALIBiは細胞内翻訳の研究における既存の技術に比べていくつかの利点を持ち、リボソーム生物学やそれ以外の分野での将来的な応用の可能性を秘めています。このプロトコルは、連続溶解および遠心分離と比べて同等かそれ以下の時間で済みます ^21,22 は、局在ペプチド配列で遺伝的に標的化できるあらゆる細胞内区画に応用可能です。構成活性のBirA^10,24と比較して、この方法はビオチン欠乏培地での培養を必要としません。これまで報告されている胎児ウシ血清中のビオチン濃度は0.04μMから0.2μMの範囲です。25,42,43;したがって、胎児用牛血清15%を含み、他のビ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
-80 °C storage			細胞培養用
0.1% gelatin in water	MilliporeSigma	ES-006-B	細胞培養用
0.2 µm filter units	Fisher	04-977-158	細胞培養用
0.5% trypsin-EDTA (10X)	ThermoFisher	15400-054	細胞培養用
1 M MgCl2	ThermoFisher	AM9010	溶解 & アフィニティ精製用
1 M Tris pH 7.5	ThermoFisher	15567027	溶解 & アフィニティ精製用
1 M Tris pH 8	ThermoFisher	AM9855G	オプション：エキソヌクレアーゼタグ付きタンパク質をリボソームタンパク質の内因性遺伝子座に挿入する場合
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes, autoclaved			トランスフェクション用
1.5, 2 mL, and 5 mL protein low-binding microcentrifuge tubes	Eppendorf	022431081, 022431102, 0030108302	溶解 & アフィニティ精製用
10 cm tissue culture plates			細胞培養用
10 M NaOH	MilliporeSigma	72068-100ML	溶解 & アフィニティ精製用
10x Tris/glycine/SDS running buffer concentrate	Bio-Rad	1610772	ウェスタンブロット用
37 °C tissue culture incubator x 2			細胞培養用。1台は主要な細胞培養インキュベーターおよびトランスフェクト細胞の照明用として機能し、2台目はALIBi活性化日のテンポラリスペースとして、主インキュベーター内のトランシリミネータのセットアップ中にトランスフェクト細胞を収容する。
37 °C water bath			細胞培養用
5 M NaCl	ThermoFisher	AM9010	溶解 & アフィニティ精製用
50 mM biotin	ThermoFisher	B20656	溶解 & アフィニティ精製用
6x Laemmli buffer	FIsher	50-196-784	ウェスタンブロット用
70% ethanol			消毒用
Acetonitrile	Fisher	A955	オプション：マススペクトルサンプル調製用
AcTEV protease kit	ThermoFisher	12575015	溶解 & アフィニティ精製用
ALIBi C-fragment plasmid	Addgene	#235615, 235636 – 235641	トランスフェクション用にはMidi-prepスケールが必要
ALIBi N-fragment plasmid	Addgene	#235614, 235635, 235642, 235643	トランスフェクション用にはMidi-prepスケールが必要
Aluminum foil			溶解 & アフィニティ精製用
ammonium bicarbonate	MilliporeSigma	5.3305	オプション：マススペクトルサンプル調製用
anti-FLAG antibody	MilliporeSigma	F3165	ウェスタンブロット用
anti-GAPDH antibody	Cell Signaling	5174	ウェスタンブロット用
anti-mouse secondary antibody	GE Healthcare	NA931V	ウェスタンブロット用
anti-rabbit secondary antibody	GE Healthcare	NA934V	ウェスタンブロット用
anti-Rpl12 antibody	Abcam	ab175219	ウェスタンブロット用
anti-Rpl31 antibody	Abcam	ab103991	ウェスタンブロット用
anti-Rpl5 antibody	ProteinTech	15430-1-AP	ウェスタンブロット用
anti-V5 antibody	ThermoFisher	R960-25	ウェスタンブロット用
Apyrase	NEB	M0398L	溶解 & アフィニティ精製用
Beta-mercaptoethanol (55 mM)	ThermoFisher	21985-023	細胞培養用
Blue light transilluminator	Clare Research Chemical	DR46B (small) or DR196 (large)	溶解 & アフィニティ精製用
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher	BP1600-100	ウェスタンブロット用
C18 tips (OMIX C18 tips)	Agilent	A57003100	オプション：マススペクトルサンプル調製用
Cell freezing container			細胞培養用
Centrifuge fitted for 15 mL and/or 50 mL conical tubes			細胞培養用
Centrifuge for 1.5-2 mL microcentrifuge tubes			溶解 & アフィニティ精製用。4 Cまで冷却可能、17,000 gまでの速度が可能なこと。理想的には、チューブを出し入れする際に一時的に暗くできる部屋に配置されていること。
Clarity ECL kit	Bio-Rad	170-5061	ウェスタンブロット用
Criterion gel tank	Bio-Rad	1656001	ウェスタンブロット用
Criterion TGX pre-cast gels, 4-20%	Bio-Rad	5671095	ウェスタンブロット用。追加のウェルサイズとレイアウトが利用可能
Cycloheximide	MilliporeSigma	C7698-5G	溶解 & アフィニティ精製用
Deoxycholate	MilliporeSigma	S1827	溶解 & アフィニティ精製用
Dithiothreitol	ThermoFisher	PIA39255	オプション：マススペクトルサンプル調製用
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190-250	細胞培養用
ES-qualified FBS	MilliporeSigma	ES-009-B	細胞培養用
Ethanol	Gold Shield	412828	ウェスタンブロット用
Ethanol	MilliporeSigma	459828	オプション：マススペクトルサンプル調製用
Formic acid	MilliporeSigma	A117	オプション：マススペクトルサンプル調製用
Fragment size analyzer and consumables		Agilent	オプション：RNAシーケンスライブラリ調製用。Agilent 2100 Bioanalyzer
Freezing media	ThermoFisher	12648-010	細胞培養用