ヤギ腸逆嚢を用いたヒスチジンの膜輸送のデモンストレーション:学部生のための体験型教育ツール

サマリー

ここでは、ヤギの腸内でのヒスチジンの膜輸送を実証する安価で再現性の高い方法を報告します。このプロセスは、ナトリウム勾配によって可能になるヒスチジンイオンとナトリウムイオンを腸細胞膜全体に共輸送することによって発生します。この方法は、体験学習教育学を利用して、生体膜を横切る溶質の動きをよりよく理解します。

要約

ヒスチジンは必須アミノ酸であり、免疫系、肺換気、血管循環に関与する代謝産物の前駆体でもあります。食事性ヒスチジンの吸収は、腸細胞の頂端膜上に存在するブロード中性アミノ酸トランスポーター(B⁰AT)によるナトリウム共役中性アミノ酸輸送に大きく依存します。.ここでは、ヤギ空腸逆嚢を使用して、内腔からの腸絨毛腸細胞によるヒスチジンの吸収を示します。さまざまな濃度のナトリウムとヒスチジンに曝露された空腸嚢をアッセイして、時間の関数として嚢内のヒスチジンの濃度を決定しました。結果は活発なヒスチジン吸収を示しています。塩の濃度を上げると、ヒスチジンの吸収が高くなり、ヤギの腸管逆嚢におけるナトリウムとヒスチジンの吸収が共鳴していることが示唆されました。このプロトコールは、適切な修飾を施したアミノ酸または他の代謝産物の腸内移動性を視覚化するために適用することができます。この実験は、学部生が膜輸送の概念を理解するのに役立つ体験型教育ツールとして提案します。

概要

生体細胞は、細胞内サイトゾルを細胞外含有量から分離する膜脂質二重層に囲まれています。膜は、溶質¹の動きを調節する半透性の障壁として機能します。生体膜を横切る輸送は、溶質の濃度や電荷など、いくつかの要因に依存する溶質の透過係数の影響を受けます。一般に、溶質は、受動的拡散、促進拡散、および能動的輸送²の3つのメカニズムを使用して膜内を移動します(図1)。単純拡散とは、可溶性、非電荷、および非極性の溶質が、半透膜を介して濃度勾配を下るプロセスです(図1A)。膜タンパク質は、高濃度の領域から低濃度の領域への溶質の移動を伴うため、このプロセスには役立ちません。拡散速度は、フィックの法則³に基づいています。一方、促進拡散はタンパク質依存性の輸送であり、メンブレンはエネルギーを消費することなく選択的な溶質のみが濃度勾配を通過することを可能にします(図1B)。この種の輸送は特異的であり、飽和速度論を示す点で単純な拡散とは異なります。

能動的輸送とは、ATPまたはイオン勾配を使用して、分子の濃度勾配に逆らって、つまり低濃度の領域から高濃度の領域への分子のタンパク質依存的な輸送です(図1C)。トランスポーターがATPを加水分解すると、その輸送は一次能動的輸送と呼ばれます(図1C、左パネル)。アクティブ・トランスポートの別の形式は、セカンダリ・アクティブ・トランスポートです(図1C、右パネル)。二次能動輸送では、溶質は電気化学的勾配に基づいて移動されます。これは、トランスポータータンパク質がイオン(通常はNa⁺)の濃度勾配への移動と、その濃度勾配に対する別の分子またはイオンの動きと結合するときに発生します。この種の溶質の動きは、溶質とイオンの両方が同じ方向に移動する共輸送(Symport)と、溶質とイオンが反対方向に移動する交換(Antiport)があります。

食物源からの食事性アミノ酸と単糖類は小腸で吸収されます。小腸は、機能的に十二指腸、空腸、回腸の3つのセグメントに分けることができます(図2)。溶質の吸収は小腸全体で起こり、最大の吸収は空腸と回腸の近位端で発生します。腸腸細胞は分極した細胞であり、隣接する2つの細胞をつなぐタイトジャンクションは、基底外側と頂端膜部位の2つの異なる膜部位を作り出します(図2)。消化によって生成された管腔溶質の吸収は、頂端膜部位⁴で起こります。

頂端膜における腸管内ヒスチジン輸送は、ナトリウム依存性の二次活性シンポートの一例です。基底外側端では、腸細胞に入るヒスチジンは、濃度勾配を下って肝臓門脈循環に移動します。腸細胞内のナトリウムの細胞内濃度は12 mmoles/L¹に維持され、これは基底外側膜にあるNa⁺ K ⁺ ATPaseによって細胞外にナトリウムが活発に送り出されるため、細胞外/管腔濃度よりも低くなっています(図3)。腸細胞の頂端膜では、B⁰ATとナトリウム中性アミノ酸トランスポーター(SNAT)5が、ヒスチジンだけでなく、ナトリウム依存性^共輸送5,6でアスパラギンやグルタミンなどのアミノ酸も輸送する主要なトランスポーターです。腸細胞の基底外側膜に存在するLarge Amino acid Transporter(LAT)1と呼ばれる別の輸送タンパク質は、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンなどの大きな中性アミノ酸を膜を横切って輸送^する7。

体験学習教育学を通じて、分光光度法や日常的な生化学的アッセイなどの技術と統合された膜輸送の概念を教えることを目的として、概念をわかりやすい言葉で示すだけでなく、学部生の参加型学習を可能にする方法論を開発することが不可欠です。現在、学生がこのような生化学の概念を学ぶための実践的な取り組みのために利用できるリソースは限られています。ここでは、学部の研究室で再現が容易で、他の代謝産物の輸送の評価にも適応できる、ヤギの腸膜を介したヒスチジン輸送を実証するための簡単なプロトコルを報告します。さらに重要なことに、この方法は学部の研究室で安価な材料を利用しているため、最も単純な実験室環境でも体験学習が可能です。

プロトコル

図 4では、プロトコル全体とすべてのステップを概略図として示しています。この方法は、ラットの腸8を用いた先行研究から得られた^{ものである。}実験は、機関のガイドラインに準拠して実施されました。この研究で使用されたサンプルは、商用ベンダーから調達されました。

注意:この実験中は手袋を着用してください。

1. 逆空腸嚢の調製

1. ヤギ空腸を前処理して清掃します。
   1. 生贄にされたばかりの健康なヤギの内臓を、認可されたベンダーから調達します。
   2. 内臓を十分な1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れて、洗浄のために完全に浸します。
   3. 小腸を大腸から分離し、はさみを使用して外部結合組織が除去されていることを確認します。
   4. 10mLシリンジを使用して1x PBSで小腸を穏やかに洗い流し、未消化の食物物質を確実に除去して小腸の中空袋を得る。このプロセスを少なくとも3回繰り返すと、効果的なクリーニングが可能になります。
      注意: 洗い流し中は、過度の力や針の使用を避けてください。力を加えると、腸壁に穴が開き、腸腸細胞が損傷する可能性があります。
   5. 定規を使用して小腸の全長を測定し、十二指腸(小^腸の1 /4)と残りの部分が空腸と回腸に均等に分割された3つの部分を取得します。
   6. 空腸部分を使用して実験を進めます。
2. 逆空腸を準備します。
   1. 空腸部分をクリーニングし、ブレードを使用してすべての結合組織を取り除きます。
   2. 空腸を12〜15 cmの長さに切り、1x PBSで洗い、PBSの入ったシャーレに入れます。
   3. ガラス棒を使用して空腸部分を反転させ、絨毛部分が外側に露出できるようにします。
      注意: 鋭利なエッジのあるガラス棒の使用は避けてください。さらに、ガラス棒の直径は、嚢の直径より大きくてはなりません。
      注:この時点で、光学顕微鏡で絨毛を視覚化できます(図4)。
   4. 逆空腸部分を1x PBSでやさしく洗い流します。
   5. 逆空腸の側面から漏れがないか確認してください。
   6. 逆空腸部分を5cmの長さの嚢に切ります。
   7. 一方の端を麻ひもで結び、袋にPBSを充填して、結んだ端に視覚的な漏れがないか再確認します。
   8. もう一方の端を結んで、外面に絨毛のある空の逆嚢を作成します。
   9. 逆さまの袋を濾紙で軽くたたいて、外部漏れがないか再確認してください。
3. 逆さ嚢を1x PBSで平衡化します。
   1. 同日に実験を進めるか、嚢を1x PBSで4°Cで一晩保存します。

2. ヒスチジン輸送の実験装置

1. 表1に示されているように、塩化ナトリウムの異なる濃度に従って、3つの50 mLチューブを2セット組み立てます。
2. 準備した腸嚢を指定されたチューブに各セットで30分と60分浸します。
3. 指定された時間が経過したら、別の1.5 mL微量遠心チューブ内の嚢内の溶液を空にし、容量を決定します。
4. 2mLシリンジを使用して嚢内の液体を吸引します。または、嚢の一方の端をほどき、内容物を新しい1.5mLチューブに集めます。
5. 採取したサンプル0.1mLをヒスチジン推定のためにアッセイし、標準グラフを用いて濃度を算出します。

3. Pauly反応を用いたヒスチジンの推定

1. ヒスチジンの標準曲線を調製します。
   1. 表2に示すように、ヒスチジン(5 mM)と水のストック溶液を使用して、さまざまな濃度のヒスチジンを含む溶液を調製します。
   2. スルファニル酸(0.5 mL)と硝酸ナトリウム(0.5 mL)を各チューブに加えます。
   3. チューブを室温で5分間インキュベートし、その後、各チューブに炭酸ナトリウムとエタノールを各1 mL加えます。
   4. チューブを室温(~20°C)で20分間インキュベートし、波長490nmでの吸光度に注意してください。
   5. 吸光度とヒスチジン濃度の標準曲線をプロットします。
      注:このヒスチジンの試験は、ヒスチジンがジアゾ化合物を形成する特性に基づいています(図5)。

結果

腸絨毛によるヒスチジンの逆嚢の内腔への吸収によるヒスチジンの腸内可動性を実証するための実験ワークフローを、 図4、 表1 および 表2に示す。3つの独立した実験セットアップを実行し、代表的なデータを 図6に示します。

与えられた実験条件下で、Paulyの反応を用いたヒスチジン推定は、300μMまでLambert Beerの法則に従いました(図6A)。このヒスチジンの試験は、試薬中のアミノ酸とジアゾニウムイオンとの結合に依存しています。ポーリーの試薬は、スルファニル酸を濃塩酸に溶かしています。この酸は、硝酸ナトリウムとHClの存在下でジアゾ化を受けます。ジアゾニウム塩p-フェニルジアゾスルホン酸は、アルカリ条件下でヒスチジン分子と反応して、暗赤色/オレンジ色から黄色の錯体を形成し、490 nmで分光光度法で読み取ることができます(図5)⁹。このテストはヒスチジンとチロシンによって行われることに注意してください。この研究で使用された試験は、硝酸ナトリウムを冷却条件下で使用するのではなく、室温(~20°C)で直接硝酸ナトリウムを使用するように、元の反応をわずかに修正したバージョンです⁹。

逆嚢の内側から回収されたサンプルで観察された陽性のポーリー反応は、腸絨毛全体でのヒスチジンの吸収を示しています。 図6B は、空腸細胞におけるヒスチジンの取り込みとナトリウム濃度との間の相関を示しています。インキュベーション時間が30分から60分に増加するにつれてヒスチジンの吸収が増加することは、二次能動輸送を示しています。

図1:さまざまな種類の膜輸送。 さまざまな種類の膜輸送システムを示す模式図。(A)受動的拡散。(B)促進された拡散。(C)一次能動輸送(左)と二次能動輸送(右)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:腸絨毛内の腸細胞の組織化。 この図は小腸に焦点を当てており、十二指腸、空腸、回腸の3つの異なる部分を示しています。小腸にはさらに、絨毛と呼ばれる指のような突起があり、摂取した食物の吸収のための表面積を増加させます。微絨毛には、アミノ酸吸収のための特定のトランスポーターを含む腸細胞と呼ばれる細胞があります。タイトジャンクションは、細胞間の溶質の移動を防ぎます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:アミノ酸トランスポーターを持つ腸細胞。 漫画は、頂端と基底外側の端を示す1つの腸細胞を表しています。頂端にはB⁰ATやSNAT5タンパク質などのトランスポーターがあり、基底外側メンブレンはLAT1トランスポーターを含んでいます。一緒に、これらのタンパク質は、腸管腔から門脈循環へのヒスチジンの取り込みに関与しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ヤギの腸逆嚢を使用したヒスチジンの膜輸送を示すプロトコルの概略図。 ヤギの腸は、説明されているように調達され、前処理され、洗浄されました。簡単に言うと、空腸を切除し、逆嚢を作製しました。これらの嚢は、さまざまな塩濃度でのヒスチジンの取り込みを定量化するための実験を設定するために使用されました。絨毛は、光学顕微鏡を使用して400倍の倍率で観察されました。詳細な手順は本文に記載されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:ポーリーの方法に対する反応。 ポーリーの試験では、濃塩酸中にスルファニル酸を含む試薬でジアゾニウムイオンが形成されます。アルカリ性条件下では、ヒスチジンはジアゾニウム塩と反応し、赤色の化合物が形成され、その吸光度は分光光度計を使用して490nmで測定できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:Paulyの方法によるヒスチジンの推定(A)ヒスチジンの標準曲線。0〜300μMの範囲の様々な濃度のヒスチジンをポーリー反応にさらし、形成された錯体を波長490nmで測定した。(B)腸嚢中のヒスチジンの輸送を、150 mM(固体黒)および200 mM NaCl(固体灰色)塩溶液の存在下で30分間および60分間追跡した。逆嚢内のヒスチジンの濃度は、標準曲線を使用して推定しました(図6A)。値は、コントロール(0 mM NaCl)を基準にして報告されます。3回のテクニカルリプリケートを実施し、代表的なデータを示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:ヒスチジンの腸内可動性の実験セットアップ。 この表は、2つの時点における異なる濃度の塩化ナトリウムでの腸嚢のインキュベーションを示しています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:ヒスチジンの標準曲線の作成。 この表は、0〜300μMの範囲の既知の濃度のヒスチジンに対するポーリー反応のさまざまなステップと成分を示しています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

膜輸送は、基礎または応用を問わず、すべての主要な生物科学分野の学部生に教えられる最も基本的な概念の1つです。従来、膜を横切る移動は、放射性同位元素で標識された代謝物を使用して視覚化されてきました。ただし、これらの方法は非常に危険であり、教育や学習には適していません。体験学習は、このような複雑な概念を理解するための最良の教育手法ですが、インフラストラクチャの欠如、高価な蛍光ベースの色素/代謝物、そして最も重要なことに、動物の解剖実験の禁止によってさらに悪化する課題です。したがって、安全で、安価で、学部の実験室環境で実現可能なツールと代替方法を開発する必要があります。ここでは、学部生向けに膜輸送を教えるための新しい方法が開発されました。報告されたプロトコルは、Agarらの1954⁸からの適応であり、ヤギ腸細胞を横切るヒスチジンの一方向の活性膜輸送を実証している。この研究は、腸管膜を介したヒスチジン吸収を視覚化するための比色分析ベースのアッセイの使用を実証するために行われました。シンプルで再現性があり、学生にとって理解しやすく、どの実験室の設定でも実行できます。

逆腸嚢モデルは、ウィルソンとワイズマン¹⁰によって最初に開発され、後に組織の生存率を高めるために改良されました。薬物吸収のメカニズムと動態は、腸管逆嚢¹¹を用いて解明されている。このモデルの利点には、吸収のための広い領域が含まれます。ただし、組織の生存率は制限パラメーターの 1 つです。腸組織は、生理学的条件下で~2時間¹¹の間生存し、代謝的に活性なままであることが報告されています。このアプローチのもう 1 つの潜在的な注意点を考慮する必要があるのは、逆嚢製剤から筋粘膜と漿膜を除去できないことです。特定の化合物の筋筋層への結合は、これらの化合物の輸送を制限または過小評価する可能性があります。逆腸嚢モデルは感度が高く特異ですが、さまざまな要因が結果に影響を与える可能性があります。そのような要因には、動物の年齢、性別、種、食事、病状、および分析に使用される腸のセグメント(回腸、空腸、十二指腸、および結腸)が含まれます。pH、曝気、温度などの環境要因も結果に影響を与えます¹²。

腸の採取および動物の状態(生/死)の収穫の遅延は、ラット腸の十二指腸セグメントでの能動的輸送に影響を与えることが示されています。麻酔をかけた動物から採取することで、時間遅延が最小限に抑えられ、トランスポーターの劣化が回避される¹³。しかし、大学での動物解剖が禁止されていることを踏まえて、私たちの実験装置では、新たに犠牲にされた動物の腸が使用されました。このプロトコルは、腸細胞全体での代謝産物の定性的取り込みを確立するためにうまく使用できますが、膜輸送速度論を含む研究での使用には制限があります。このプロトコルの最も重要なステップは、生存可能な腸細胞を持つ漏れ防止の逆腸嚢の調製を成功させることです。繊細な性質と絨毛と腸細胞の生存能力は、練習で克服できる課題を提起します。さらに、出発物質が近交系の同種動物集団に由来しないことを考えると、実験間の結果のばらつきは重大な欠点です。これは、同じ動物からの複数の複製を使用することで克服できます。これらの考慮事項を念頭に置いて、この研究で提示された方法は、学部の実践的なトレーニングの教育ツールとして厳密に使用されます。

概説されたプロトコルは、ヒスチジンの輸送を実証するために成功裏に使用されました。ナトリウムとヒスチジンの両方が逆嚢に一方向に取り込まれることは、二次能動輸送のシンポートタイプを示しています。中性アミノ酸の腸管吸収は、Na+ K+ ATPaseによって設定された濃度勾配に依存するベクトル動態に従います。同様のセットアップでは、細胞内負性膜電位と150 mMの細胞外ナトリウム濃度が維持されます。これらは両方とも、頂端でのB⁰ATによる中性アミノ酸の能動的輸送と、その後のLAT1による基底外側末端での腸細胞からの移動を促進します。興味深いことに、塩濃度が高い(200 mM)と、時間の関数としての吸収に有意差はありませんでした。現時点では、そのような観察の理由についてコメントすることはできません。ただし、同じ実験設定を拡張して、さまざまな時点の複数のナトリウム濃度と 150 mM 塩化コリンを使用したコントロールを含めて、ナトリウム依存性の輸送と飽和による寄与の可能性を示すことができます。

原則として、ヤギ/ブタ/ラット/マウスの逆空腸嚢は、推定のための生化学的アッセイがあれば、さまざまな食事代謝産物の腸管吸収を実証するために使用できます。さらに、腸管吸収または膜輸送阻害剤を妨害する可能性のある他の成分の影響も分析できます。逆嚢は、 in vitro での薬物吸収、薬物の腸管代謝、および薬物吸収におけるトランスポーターの役割を研究するための医薬品研究のツールとして効率的に使用されてきました。最後に、この技術は膜輸送の ex vivo デモンストレーションの一例であり、無細胞抽出物(in vitro)ではなく組織サンプルに依存しています。しかし、この利点は、感染していないヤギ/ブタ/ラットの腸が利用できることで相殺され、これが制限要因になる可能性があります。

学習プロセスを強化するために教師が利用できる多くの教育ツールの中で、体験学習または「実践による学習」は、学生が講義のトピックを全体的に理解する機会を提供する最も進歩的で効果的な指導方法である教育の哲学と方法論です。体験学習は、このアクティブラーニングプロセス中にサポートとメンターシップを提供するインストラクターだけでなく、学生も実践的な関与を保証します¹⁴。これは、従来の理論的な教室での指導に代わる優れた選択肢として機能し、特に、学生が想像するのが難しいと感じる膜輸送のような特定の重くて統合的な概念において機能します。このような演習は、仲間やメンターの両方からのインタラクティブで協調的な学習も促進します。現在のイニシアチブは、情報量が多いだけでなく、記憶に残り、学生にとって変革をもたらす可能性のある学習体験を創造し、可能にする方向への一歩前進であり、全体的な学習体験に大きな影響を与えます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL マイクロ遠心チューブ	TARSONS	500020
10 mL 試験管	BOROSIL	9800U04
50 mL 滅菌ファルコンチューブ	TARSONS	546041
500 mL ビーカー	ボロシル	10044977
500 mL コニカルフラスコ	ボロシル	691467
D-グルコース	SRL	42738
デジタル分光光度計	SYSTRONICS	2710
エタノール	EMSURE	1009831000
フィンピペット	サーモフィッシャー	4642090
ガラススターラーロッド	ボロシル	9850107
L-ヒスチジン	SRL	17849
NaCl	SRL	41721
ニトリル手袋	KIMTECH	112-4847
ペトリ皿	TARSONS	460090
緩衝生理食塩水(ph 7.4)	SRL	95131
ピペットチップ	ABDOS	P10102
炭酸ナトリウム	SRL	89382
硝酸ナトリウム	SRL	44618
二塩基性ナトリウム(無水)	SRL	53046
ナトリウム一塩基性(無水)	SRL	22249
スルファニル酸	SRL	の15354