方法論記事

マウスにおける歯列矯正の歯の動きの研究

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DOI：

10.3791/66884

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2024年8月2日

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1Department of Oral Diagnosis and Pathology, School of Dentistry, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry, Universidade Federal de Minas Gerais, 3Department of Physiology and Biophysics, Biological Science Institute, Universidade Federal de Minas Gerais, 4Private Clinic, 5Department of Metallurgical and Materials Engineering, School of Engineering, Universidade Federal de Minas Gerais, 6Laboratory of Immunopharmacology, Department of Biochemistry and Immunology, Biological Science Institute, Universidade Federal de Minas Gerais, 7Department of Orthodontics, School of Dental Medicine, University of Pittsburgh, 8Department of Oral Surgery, Pathology and Clinical Dentistry, School of Dentistry, Universidade Federal de Minas Gerais

この記事について

サマリー

ここでは、歯列矯正用歯の動き(OTM)を研究するためのプロトコルを提示し、骨の適応、根の吸収、および機械的刺激に対する骨細胞の応答のメカニズムを調査するための適切なモデルとして機能します。この包括的なガイドでは、OTMモデル、マイクロコンピューター断層撮影の取得、およびその後の分析について詳しく説明します。

要約

歯列矯正用歯の動き(OTM)は、破骨細胞と骨芽細胞によってそれぞれ調整された、歯槽骨が圧迫部位で吸収され、張力部位で沈着するダイナミックなプロセスを表しています。このメカニズムは、根の吸収や機械的な力の刺激に対する細胞の応答など、骨の適応のさまざまな側面を研究するための貴重なモデルとして機能します。ここで概説するプロトコルは、OTMを調査するための簡単なアプローチを提供し、ニッケルチタン(NiTi)コイルスプリングを使用するマウスモデルで0.35Nを最適な力として確立します。マイクロコンピュータ断層撮影法を用いて、セメント-エナメル接合部における直線距離の不一致を評価することにより、OTMを定量化した。評価には、歯列矯正による炎症性根吸収の分析も含まれており、根のミネラル密度や総体積あたりの根の体積の割合などのパラメーターが評価されました。この包括的なプロトコールは、骨のリモデリングプロセスの理解を深め、効果的な矯正治療戦略を開発する能力を高めることに貢献しています。

概要

骨リモデリングは、破骨細胞、骨芽細胞、骨内層細胞、および骨細胞によって調整される進行中のプロセスであり、成人の骨格の完全性を維持するために不可欠です1,2。主に破骨細胞と骨芽細胞の分化と活性によって駆動されるこのダイナミックなプロセスは、機械的ストレスと負荷3,4,5によって引き起こされる骨の再吸収と沈着を伴います。

動物実験は、歯列矯正の歯の動き(OTM)6,7を支える複雑な生物学的および細胞的メカニズムを解明する上で極めて重要な役割を果たします。このプロセスには、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、線維芽細胞、および顎骨と歯根膜内に位置するマクロファージやT細胞などの免疫細胞など、さまざまな種類の細胞が関与します7,8。これらの細胞は、機械的刺激や局所的な環境の変化に動的に応答し、周囲の骨の組成や構造に影響を与える7,8。さらに、病原体が存在しないにもかかわらず、細胞レベルで炎症反応を引き起こします。この炎症反応は、骨組織の代謝回転を増加させる役割を果たします9。

マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルなど、さまざまな動物モデルがOTM 7,8,10の実験的研究に利用されています。これらの中で、げっ歯類、特にマウスは、歯の動きと骨のリモデリング6の初期段階を調査するために好まれています。これまでの研究では、主に遺伝子組み換え株が広く利用可能であるため、ラットモデルよりもマウスモデルを使用する利点が強調されており、OTM 7,11における遺伝的影響の詳細な調査が可能になりました。現在、マウスの歯の動きを誘導するために、大きく分けて2つのモデルが用いられています。第1の方法は、第1上顎大臼歯と上顎切歯4,12の間にニッケルチタン(NiTi)コイルスプリングを挿入することを伴う。第2のアプローチは、第1および第2の上顎大臼歯13との間の歯間腔内に弾性バンドを配置することを含む。分析される主要なアウトカムは、典型的には、歯の動きの大きさおよび骨のマイクロアーキテクチャを含み、好ましくはマイクロコンピュータ断層撮影法(マイクロCT)を用いて評価される14。理想的には、OTM4を生成するために適切な力が使用されていることを確認するために、歯根の完全性を評価することが重要です。

マイクロCTは、石灰化組織のマイクロアーキテクチャを評価するためのゴールドスタンダードとして広く認識されています14が、データのスキャン、分析、および報告のための標準化された方法論とプロトコルの欠如は、採用された正確な手順を識別し、結果を解釈し、異なるOTMモデル間の比較を容易にする上でしばしば課題を提示します14,15。

ここでは、OTM、骨の微細構造、歯根のマイクロCT取得と解析など、OTMマウスモデルのステップバイステップガイドを紹介します。この方法では、制御された機械的な力を第一大臼歯に加え、顎骨内での動きを誘発します。この方法の選択は、実現可能性、関連性、精度など、いくつかの要因に起因します。このようなアプローチにより、詳細な定量分析が可能になり、歯列矯正の歯の動きの根底にある生物学的プロセスに関する貴重な洞察が得られ、将来の改善された矯正治療戦略の開発が容易になります。

プロトコル

すべての手続きは、ミナスジェライス連邦大学倫理委員会(No.166/2022)によって確立された倫理基準に厳密に準拠していました。各実験の前に、サンプルサイズの計算は必須です。体重約20〜30gの8〜10週齢の雄C57BL6 / J野生型マウスを使用してください。マウスは、25°Cに維持された室内のケージに収容し、12時間の光/12時間の暗サイクルに従う必要があります。コイルを取り付けた後、動物には柔らかい食事を与える必要があります。毎日のモニタリングには、体重と全体的な健康状態の評価を含める必要があります。

1. 機械的に誘導された歯槽骨リモデリング

  1. 遠位カットペンチを使用して、0.25 x 0.76インチのNiTiオープンコイルスプリングを、歯列矯正用ワインガートプライヤーを使用して、スプリングに対して垂直に配置された6つのループと2つのループ形状の端の次の寸法にカットします。
  2. 直径0.20mmの丸型クロムニッケル(CrNi)ワイヤーを、Mathieuピンセットと丸型器具をサイズ基準として使用して、端をループ状にして目的の構成に成形します。
  3. コイルのループ状の端と0.20mmの丸いCrNiワイヤーを組み立てます。
  4. キシラジン(10 mg / Kg)とケタミン(100 mg / Kg)を含む0.2 mLの溶液の腹腔内注射で動物に麻酔をかけます。.手順を開始する前に、ペダル反射を使用して麻酔の深さを評価してください。ピンセットを使用して動物のつま先のいずれかを慎重につまみます。反射がないことは、全身麻酔の適切な平面を示しています。角膜の損傷や術後の痛みを避けるために、動物が麻酔された後に眼の潤滑剤を塗布してください。
  5. 動物を背側褥瘡に座らせ、手術台の上に置き、手足を固定して動きを制限し、口腔内アクセスを可能にします。
  6. 直径0.50mmのワイヤーで作られ、0.08mmのワイヤーで固定された開口器を利用して、頭の動きを防ぎながら完全な視覚化を容易にします。右側を実験側(OTM側)、左側を矯正コイルなしのコントロール(コントロール側)として使用します。
    注:口腔内構造の視覚化を強化するには、実体顕微鏡と光学光システムを使用して達成する必要があります。
  7. 右の第一大臼歯と切歯の表面をそれぞれアセトンとセルフエッチングプライマーを使用して清掃し、エッチングします。このシステムはセルフエッチングであるため、事前の酸コンディショニングは必要ありません。
    1. プライマーを1つのステップで塗布し、酸と接着剤として同時に機能します。マイクロブラシを使用して、少量のセルフエッチングプライマーを収集し、上部第一大臼歯と切歯の咬合面に塗布します。このステップでは、セルフエッチングプライマーが第一大臼歯と第二大臼歯の間の近位表面に到達しないように注意する必要があります。これにより、歯の要素がくっついて歯の動きが妨げられる可能性があります。大臼歯と切歯の咬合面でプライマーを30秒間光硬化させます。
  8. 6ループNiTiオープンコイルスプリングの遠位端を右上顎大臼歯の咬合面に光硬化樹脂で接着し、30秒間光硬化させます。ワイヤーの端にレジンのインクリメントを追加して、マウスへの害を防ぎ、30秒間光硬化させます。
  9. 手術台に取り付けられたレールとクランク機構からなる特別に設計された装置を使用して、コイルを作動させます。これにより、前後方向の動きを前後にスライドさせることができます。
  10. 0.20mmの丸線のフリーループ形状の端をテンションゲージのフックに接続します。
  11. クランクを作動させたら、ダイナモメーターが0.35Nの力を記録するまで、手術台をレールに沿って動かします。
  12. 0.20mmの丸線を両方の上切歯に接着して、コイルを固定します。実験期間中は、それ以上の再活性化は行われません。ワイヤーを切断して、動物をダイナモメーターから切り離します。 さらに樹脂を少し加えると、デバイスの金属エッジが露出したり、動物を傷つけたりしないようにします。30秒間の光硬化。動物をテーブルから分解します。
  13. 近心方向に0.35Nの力を課す装置を備えた右上の第一大臼歯は、実験側で構成されています。上顎骨の左側(歯列矯正器具なし)をコントロール4,16として使用します。
  14. このデバイスを12日間維持し、アクティベーションは必要ありません。鎮痛剤は使用しないでください。歯列矯正の動きは炎症過程を通じて起こり、鎮痛薬はアラキドン酸カスケードに悪影響を及ぼし、骨のリモデリング速度に影響を与え、結果を無効にする可能性があります。
  15. 手術終了後、生理食塩水の皮下注射で動物を治療し、デバイスによる適応期間中の脱水症状を回避します。動物を完全に回復するまで、動物を加熱して個々のケージに入れ、この期間が経過すると動物を集合ケージに入れます。
  16. キシラジン (10 mg/Kg) とケタミン (100 mg/Kg) を含む 0.2 mL 溶液の腹腔内注射による鎮静による 12日目にマウスを安楽死させ、その後鋭利なハサミで斬首します。

2. マイクロCT測定

  1. 鋭利なハサミで上顎骨を採取し、すべての軟部組織を切断し、矢状面の頬骨を、冠状面の前鼻縫合糸と蓮状後頭部シンコンドロシスを切除します。上顎骨を10%中性緩衝ホルマリン(pH = 7.4)に48時間の固定期間浸します。この期間の後、ホルムアルデヒド溶液を70%アルコールに変更します。
  2. 高解像度スキャンのために、9〜18μmの等方性ボクセルサイズ、50kVのX線設定、0.5mmのアルミニウムフィルター、0.5°の回転角度のパラメータを使用して、上顎骨のマイクロCTスキャンを実行します。マイクロCTスキャンでは、複数のジョーを装着することができます。
  3. 使用されたマイクロコンピューター断層撮影(microCT)の製造元によって示されたマイクロトモグラフィー再構成プログラムを使用して、取得した画像を再構築します17。
  4. 使用したマイクロトモグラフィーの製造元が示す3D検査プログラムを使用して、再構築された画像を配置します。
  5. 右上顎骨(OTM側)の第1大臼歯と第2大臼歯のセメント-エナメル接合部(CEJ)と左半上顎骨(対照側)の直線距離の差を測定することにより、OTMを定量化します。この測定には、ラインツールを備えた適切なmicroCTアナライザーソフトウェアを利用します 17,18,19,20.
  6. 歯列矯正誘発性炎症性根吸収(OIIRR)の存在についてサンプルを確認してください。上顎第一大臼歯の遠位前庭根の関心領域(ROI)を、不規則な解剖学的関心領域を手動で描画する方法を使用して選択します。次のパラメータを測定します:根のミネラル密度(RMD; g / cm3)と総体積あたりの根の体積の割合(RV / TV; %)。この測定には、適切なマイクロCTアナライザーソフトウェアと3D容積測定ツールをご利用ください16,21.
  7. Mimicsソフトウェアを使用して上顎第一大臼歯の再建を行い、得られたデータを分析して、実験モデル16,21のOTMおよびOIIRRに関する結論を導き出します。

結果

このプロトコルにより、NiTiコイルスプリングを使用したOTMマウスモデルの調査が可能になります。0.35Nの力が加えられた場合、制御側の第1大臼歯と第2大臼歯の間の平均CEJ距離は243.69μm(図1A、線A)でしたが、OTM側では284.66μm(図1A、線B)で測定されました。OTM側と制御側の差は40.97μm でした(図1B)。右上顎骨(OTM側)と左上顎骨(対照側)の第一大臼歯と第二大臼歯の間のCEJ間の直線距離は、適切なマイクロCTアナライザーソフトウェアを使用して、ラインツールで少なくとも6つの異なるセクションで測定されました。OTM側の6つの測定値の平均値をコントロール側の平均値から差し引いて、OTM結果を生成しました(図1)。

OIIRRに関しては、対照側(それぞれ71.02 ± 10.11%、1.071 ± 0.1536 g/cm2)とOTM側(それぞれ73.38 ± 6.162%、1.048 ± 0.2119 g/cm2 μm)の両方で、歯科用RV/TVとRMDの値が示されました。 図 2)。

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図1:歯列矯正用歯の動き(OTM)。 (A)コントロール側とOTM側の代表画像。(B)コントロール側とOTM側のCEJ距離の結果と、OTM距離をもたらした距離の差。NiTiコイルスプリングを使用して、右上の第一大臼歯の近心方向に0.35Nの力が加えられ、研究のエンドポイントは12日目でした。10匹のマウスから生成されたOTM結果の平均±標準偏差。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:選択した関心領域(ROI)の代表的な画像。 上顎第一大臼歯の遠位前庭根のROIが示されており、これは、手動輪郭法を使用して描かれた不規則な解剖学的関心領域を使用して選択されたもので、根のミネラル密度(RMD;g/cm3)と総体積あたりの根の体積の割合(RV/TV;%)を分析します。平均±標準偏差の結果は、10匹のマウスから生成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、OTM中の骨リモデリングの根底にある細胞および分子メカニズムを解明するために設計された標準化されたプロトコルについて説明します。マウスにおけるこれらのメカニズムを完全に理解するには、精度と信頼性を確保するための綿密に計画されたプロトコルが必要である7,11。私たちの研究グループが実施した研究では、このプロトコルは、テンションゲージと特別に設計された装置を組み込むことにより、オペレーターのばらつきを効果的に低減し、マウスモデル4,16,17,18,19,20のOTMの最適な力として0.35Nを確立することが示されています.実験手順の有効性を向上させ、動物サンプルを最大限に活用するために、マイクロCT分析に利用される検体は、日常的な組織学のための処理も行うことができます。その後、OTMは、CEJを測定16,19の基準点として利用して、5μmセクションで評価することができます。ヘマトキシリンとエオシンの染色は、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)やマッソントリクロームなどの特殊な技術とともに、根の完全性を評価し、関心領域内の骨細胞、破骨細胞、および骨芽細胞を定量するための効果的な方法としても機能します4,5,16。

げっ歯類のOTM中の歯槽骨の微細構造の動的変化は、マイクロCTシステムを使用して調査されています。これらの評価は、臨床矯正治療14,15のための貴重な洞察を提供することを目的としています。マイクロCTは、内部構造を高分解能かつミクロン単位の精度で捉えることができる解析技術です。この方法により、小規模な試料を詳細な3D画像に再構成することができ、試料の正確な定性的および定量的分析が可能になる22。以前の研究と一致して、OTM は、右半上顎の第一大臼歯と第二大臼歯の CEJ と左半上顎 17,18,19,20 との間の線形不一致を定量化することによって評価されました。デンタルイメージングの文脈では、マイクロCTにはいくつかの利点があります。歯根表面の小さな欠陥を特定し、直線的な歯の変化を正確に測定し、海綿骨と皮質の骨の形態を評価することができます22,23。注目すべきは、マイクロCTを使用してげっ歯類の骨の微細構造を評価するための現在のガイドラインが、海綿骨および皮質の骨形態計測23を説明するために推奨される最小限の変数セットを強調していることである。さらに、矯正治療中の重篤な合併症であるOIIRRの発生を分析することが重要です16,21。OIIRRの存在は、加えられた力が過剰である可能性があることを示しており、調整が必要であることを示しているため、研究者は根吸収の強度を評価する必要があります16,21。

動物モデルを用いたOTM研究における重要なステップを順守することは、信頼性の高い結果を得るために不可欠です。これには、系統、年齢、骨代謝、成長率、遺伝的背景などの要素を考慮した動物の慎重な選択が含まれます。動物モデルの選択は、これらの要因の変動が骨の生理機能と歯列矯正の力に対する反応に影響を与えるため、研究結果に大きく影響します6。動物の安楽死のタイミングも重要です それは歯列矯正の力に反応して骨のリモデリングの特定の段階を捉えます。例えば、Taddeiら4 は0時間、12時間、72時間で分子解析を行い、6日後に組織病理学的解析を行い、OTM中の骨リモデリングマーカーの時間変化の評価を可能にしました。さらに、OTMの加齢に伴う変動が調査され、老化が骨のリモデリングプロセスにどのように影響するかが明らかになりました23。

NiTiコイルスプリングの使用は、歯の動きを誘発するのに効果的ですが、動物福祉や実験結果に影響を与える可能性のある特定の欠点があります。NiTiコイルスプリングの挿入は、ゴムバンド7を使用するなどの代替方法と比較して、より時間がかかり、技術的に要求が厳しいことが注目されています。この複雑さの増大は、挿入中の負傷のリスクを高めることにつながる可能性があり、その結果、処置後の体重減少の増加や動物の死亡率の上昇などの悪影響をもたらす可能性があります7。私たちの経験では、動物の日常的なモニタリングと、軟化飼料などの支援措置の実施は、動物モデルでのOTMにNiTiコイルスプリングを使用することに関連する悪影響を最小限に抑えるのに役立つことが証明されています。これらの対策は、動物の福祉に貢献するだけでなく、交絡因子を減らし、研究プロトコル4,16,17,18,19,20の一貫性を確保することにより、実験結果の信頼性と妥当性を高めます。

マウスにOTMを使用し、マイクロCT分析と組み合わせることで、骨の適応、根の吸収、および機械的な力刺激に対する細胞応答のメカニズムを調べるのに適したモデルが得られます。この統合的なアプローチは、矯正治療の根底にある複雑なプロセスに関する貴重な洞察を提供し、新しい治療戦略と介入の開発を促進します。

開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

私たちは、図式図に貢献してくださったBeatriz M. Szawka氏と、技術サポートを提供してくださったIlma Marçal de Souza氏に心から感謝します。J.A.A.A.は、ブラジルのFundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, E-26/200.331/2024)から授与されたフェローシップの受賞者です。この研究は、Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (406928/2023-1)、Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais、およびブラジルのCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superi(財務コード001)の支援を受けました。著者らは、X線マイクロトモグラフィー分析について、LabBio/UFMGのEduardo H. M. Nunes教授に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセトンSigma-Aldrich67-64-1
遠位カットプライヤーQuinelatoQO.700.00
ダイナモメーターSHIMPOFGE-5XY
光ファイバーイルミネーターコールパーマーN/A
ケタミンSyntec100477-72-3
NiTi オープンコイルスプリング 0.25 x 0.76ランサー矯正
Ø 0.20 mm 丸型クロムニッケル (CrNi)Morelli55.01.208
丸型 CrNi 硬質弾性矯正用ワイヤー Ø0.50 mm (.020 inch)Morelli55.01.050
丸型 CrNi タイ ワイヤー & オスラッシュ;0.20 mm (.008 inch)Morelli55.01.208
実体顕微鏡QuimisQ7740SZ
Transbond Plus Self Etching Primer3MLE-Q100-1004-7
Weingart PlierQuinelatoQO.120.00
XylazineSyntec23076-35-9
MicroCT Analysis
Skyscan 1174v2Bruker1174v2
Software
NReconSkyscanN/A
DataViewerSkyscanN/A
CTAnSkyscanN/A
模倣MaterialiseN/A

参考文献

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