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方法論記事

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化

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DOI:

10.3791/66899

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2024年7月19日

 ,  ,  ,  , 
1Ashoka University

この記事について

サマリー

ここでは、低分子量の細胞外DNAの割合を高めることにより、環境中の抗菌薬耐性(AMR)を評価する簡単な手法を紹介します。20%-30%のPEGと1.2 M NaClによる前処理により、ゲノムおよび水平伝播のAMR遺伝子の両方を検出できます。このプロトコルは、キット不要のプロセスに適しており、さらに最適化されています。

要約

環境監視は、パンデミック後の時代の公衆衛生を評価するための重要なツールとして認識されています。水、特に廃水は、環境中の病原体負荷をサンプリングするための選択源として浮上しています。開放排水路や地域の水処理施設からの廃水は、病原体と薬剤耐性(AMR)遺伝子の両方の貯蔵庫であり、頻繁に人間と接触します。水からAMRを追跡する方法はたくさんありますが、不均一なサンプルから高品質のDNAを高収率で単離することは依然として課題です。これを補うために、サンプル量を多くする必要があることが多く、現実的な制約が生じます。さらに、環境DNAは断片化されることが多く、AMR(プラスミド、ファージ、直鎖DNA)の供給源は低分子DNAで構成されています。しかし、直鎖状および低分子量のDNAを高収率で抽出する方法に焦点を当てた抽出プロセスはほとんどありません。ここでは、ポリエチレングリコール(PEG)の沈殿特性を利用して、少量の廃水から高収率の線形DNAを抽出する簡単な方法が報告されています。この研究は、メタゲノム解析のために収集された水サンプルから、直鎖状DNAの割合を濃縮することにより、全体的なDNA収量を増加させることを実証しています。また、低分子DNAの増強は、高分子DNAや細胞内DNAに着目した環境AMRのアンダーサンプリングという現在の問題を克服するものです。この方法は、処理プラントからの排水など、細胞外DNAが存在するが低濃度の場合に特に有用であると期待されています。また、遺伝子の水平伝播によって広がるAMR遺伝子断片の環境サンプリングも強化されるはずです。

概要

SARS-CoV-2とその余波は、感染症の発生を監視および予測する上での環境監視の重要性を強調しました1,2。ウイルスのパンデミックは明らかですが、抗菌薬耐性(AMR)の台頭はしばしば陰湿なパンデミックと表現され、世界中で主要な公衆衛生上の懸念事項となっています3,4。そのため、AMRの進化と広がりを理解するための協調的な戦略が急務となっています。水域と廃水は、病原体とAMR5,6,7,8の両方の貯水池として機能することができます。したがって、共有水源は、特に低・中所得国(LMIC)では、衛生状態の悪さと人口過剰が密接に関連しているため、人間の間で病気を感染させる強力な原因となっています9,10,11。水源の検査は、コミュニティの健康を評価するために長い間採用されてきました12,13,14。最近、都市の下水処理場からの廃水は、診療所1,2,15,16,17,18におけるCOVID症例の良好な事前指標であることが証明されました。

特定の疾患のモニタリングと比較して、環境中のAMRの検出と追跡はより複雑な問題を引き起こします。多数の抗菌薬が使用されていること、多様な耐性遺伝子、異なる局所選択圧、および細菌間の遺伝子の水平導入により、真のAMR負荷を評価することは困難であり、一度評価されたとしても、それを臨床観察と相関させることは困難である19,20,21,22。その結果、臨床AMRの協調的なサーベイランスは世界中のいくつかの組織によって実施されています3,23,24、環境AMRモニタリングはまだ初期段階にあります(19,25,26)。

近年、環境AMRを追跡するためのさまざまな方法が報告されており、5,27、28,29でレビューされています。これらのほとんどの出発点は、不均一な環境サンプルから良質なDNAを抽出することであり、それ自体が課題です。さらに、環境DNAは通常、敵対的な環境にさらされるため断片化されます。断片化された細胞外DNAは、AMR遺伝子の重要な貯蔵庫として長い間認識されており(30,31,32でレビュー)、遺伝子の水平伝播を介して細菌に出入りする可能性が追加されています。したがって、環境中のAMR負荷を測定することを目的としたプロトコルでは、可能な限り直鎖状および低分子量のDNAをサンプリングすることが重要です。驚くべきことに、直鎖状および低分子量DNAの高収率抽出に特化した方法の開発にはほとんど焦点が当てられていませんでした。

DNAを沈殿させる一般的で簡単な方法は、ポリエチレングリコール(PEG)と塩化ナトリウム(NaCl)33などの塩を組み合わせることである。PEGは、DNA断片34,35のサイズ特異的沈殿を達成するために使用される高分子クラウディング剤である。PEG濃度が低いほど、効率的に沈殿できるDNAの分子量が高くなります。多くの研究では、DNAおよびRNAの環境抽出中にPEGが使用されました1,2(表1 17,33,36,37,38,39に要約)最終ステップ33,36,37またはSARS-CoV-2 15,40のようにウイルス粒子の抽出のために大きな水サンプルを濃縮するために。.現在の研究では、以前に環境DNA抽出に使用されていたPEG濃度(主にウイルス監視プロトコルによって決定される)は、低分子量の直鎖DNAを捕捉しないことがわかりました。そのため、短いDNA断片のサンプリングに失敗し、AMR含有量を正確に評価するのには適していません。この研究では、ポリエチレングリコールと塩化ナトリウムの特性を利用して、低分子量の直鎖状DNA断片を高収率で効果的に沈殿させ、将来的には費用対効果の高いDNA抽出法につながる可能性があります。この方法は、複雑な天然サンプルから断片化された低分子量DNAの割合を濃縮するために使用できるため、環境AMRのより正確な画像を取得できます。もう少し洗練すれば、この技術は、地方自治体やその他の政府機関が最小限の技術トレーニングで監視ツールとして使用するのに、簡単かつ低コストで適用するのに役立ちます。

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プロトコル

1. 排水サンプリング

  1. 500 mLのポリプロピレンビーカーをオープンドレンまたは下水処理プラント(STP)の貯水池に浸し、~300 mLの廃水サンプルを採取します。
  2. ~250 mLのサンプルを250 mLのオートクレーブ処理ポリプロピレンボトルに移します。
  3. ボトルのキャップをねじ込み、プラスチックフィルムで密封します。ボトルは閉じた袋に入れて直立させてください。
  4. サンプルを密閉容器に入れ、周囲温度で直立させて輸送します。
  5. サンプルを70°Cの熱風オーブンで4時間加熱不活性化してから、DNA抽出用に処理します。

2. 廃水サンプルからのDNA抽出

  1. 廃水サンプルが冷却されたら、サンプルを最大速度でボルテックスし、破片/スラッジを沈殿させます。
  2. 50mLの遠心分離チューブに廃水27.5mLをデカントし、13.5gのPEG-8000(最終濃度30%)と3gのNaCl(最終濃度1.2M)を加え、完全に溶解するまでよく混合します。
  3. サンプルを4°Cで一晩(~16-18時間)インキュベートします。
  4. サンプルを15,500 x g 、4°Cで30分間遠心分離します。
  5. 上清を捨てます。
    注:8000%のPEG-30は高粘度であり、上澄みを捨てるときにペレットが外れる可能性があります。上清は、ペレットが失われないように、ゆっくりと慎重にデカントする必要があります。ステップ2.6から2.23は、キットの指示に従って土壌DNA抽出キットを使用して実行し、いくつかの変更を加えます。
  6. ペレットをキットの溶解液800μLに溶解し、混合したジルコニウムビーズチューブに溶液を加えます。
    注:大量のペレットを処理する場合は、必要な数のチューブからペレットをプールします。たとえば、160 mLのサンプルを処理する場合。PEG と NaCl を含む廃水を含む 50 mL チューブが 4 本あります。4つのチューブすべてを15,500 x g 、4°Cで30分間遠心分離した後、4つのチューブすべてから上清を捨てます。それぞれに200 μLのCD1溶液を加え、ペレットを再懸濁し、1本のビーズチューブにプールします。
  7. ビードチューブを渦の上に水平に固定します。チューブを最高速度で20〜30分間ボルテックスします。
    注:長時間のボルテックスにより、サンプルの完全な溶解と均質化が保証され、DNA収量が向上します。
  8. チューブを8,000 x g で15秒間スピンダウンして、底部のビーズを沈殿させ、泡を取り除き、上清をチューブから1.5 mLの微量遠心チューブに完全に移します。一部のビーズは、このステップで転写されることもあります。
  9. 上清を15,000 x g で1分間遠心分離します。
  10. 上清を清潔な2mLの微量遠心チューブに移します。上清にはまだいくつかの懸濁粒子が含まれている可能性があります。
  11. 200 μLの沈殿液を加え、最高速度で5秒間ボルテックスします。4°Cで5分間インキュベートします。
    注:4°Cでのインキュベーションにより、DNAが溶液中に残っている間、タンパク質と細胞破片の沈殿効率が向上します。このステップでプロトコールを最大2時間一時停止することが可能ですが、抽出されたDNAの収量と品質が大幅に低下することはありません。
  12. 15,000 x g で室温(RT)で1分間遠心分離します。ペレットを避け、透明な上清を清潔な2 mLの微量遠心チューブに移します。
  13. 上清700 μLあたり600 μLの結合バッファーを添加し、最大速度で5秒間ボルテックスします。
  14. 700 μLのライセートをシリカスピンカラムにロードし、2分間インキュベートした後、15,000 x g で1分間遠心分離します。
    注:シリカカラム上でライセートをインキュベートすると、DNAのカラムへの結合が促進され、DNA収量が向上します。
  15. フロースルーを破棄し、すべてのライセートがスピンカラムを通過するまでステップ2.14を繰り返します。
  16. スピンカラムを清潔な2 mLコレクションチューブに慎重に入れます。スピンカラムにフロースルーが飛散していないことを確認してください。
  17. スピンカラムに500 μLの洗浄バッファーを加え、スピンカラムを15,000 x g で1分間遠心分離します。
  18. フロースルーを捨て、スピンカラムを同じ2 mLコレクションチューブに戻します。
  19. 500 μLのエタノール洗浄バッファーをスピンカラムに加えます。15,000 x g で1分間遠心分離します。
  20. フロースルーを捨て、スピンカラムを新しい2 mLコレクションチューブに入れます。
  21. 16,000 x g で2分間遠心分離し、残留エタノールを除去します。スピンカラムを新しい1.5 mLチューブに入れます。
  22. 100 μLの溶出バッファー(55°Cに予熱)を白色フィルターメンブレンの中心に添加し、5分間インキュベートします。
    注:加熱された溶出バッファーは、メンブレン上でのインキュベーションとともに、DNA、特に高分子量DNAの溶出効率を高めます。
  23. 15,000 x g で1分間遠心分離します。スピンカラムを破棄します。
  24. 溶出したDNAに、3 M NaCl 10 μL (1/10 容量の DNA 溶出液) と 250 μL の冷却無水エタノール (2.5 容量の DNA 溶出液) を加えます。反転させてよく混ぜ合わせ、内容物を8,000 x g で15秒間スピンダウンします。
  25. DNA-エタノール混合物を-20°Cで少なくとも1時間インキュベートします。
    注:DNA-エタノール混合物のインキュベーションは、抽出されたDNAの収量または品質を有意に低下させることなく、16時間まで増やすことができる。
  26. 19,000 x g 、4°C、30分間遠心分離します。上清をデカンテーションで捨てます。
  27. 500μLの冷やした70%エタノールをペレットに加えます。
  28. 19,000 x g 、4°C、15分間遠心分離します。上清をデカンテーションで捨てます。
  29. チューブを裏返し、ティッシュペーパーで軽くたたいて、毛細管現象により残留エタノールを除去します。
  30. すべてのエタノールが蒸発するまで、37°Cで5〜10分間加熱ブロック上でチューブを開いたままにして、DNAペレットを完全に乾燥させます。
  31. DNAペレットを30〜50μLのオートクレーブ二重蒸留水(ddH2O)に再懸濁します。37°Cで5〜10分間インキュベートします。
  32. DNAを8,000 x g で15秒間スピンダウンします。
  33. Nanodrop分光光度計の Nucleic Acids 設定でdsDNAアプリケーションを選択します。
    1. 台座は糸くずの出ないティッシュペーパーと水で拭いてください。ddH2Oを使用して装置をブランクにし、2 μLのDNAサンプルを台座にロードします。
    2. 濃度比と吸光度比(A260/280およびA260/230)を測定して純度を決定します。
  34. DNAサンプルは-20°Cで保存します。

3. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅直鎖状DNAの沈殿により、さまざまな分子量にわたるDNAの回収を確認

  1. 大腸菌MG155由来のゲノムDNAを用いて、PCRにより遺伝子断片を増幅し、fusA、lacZ、gapA、rpsD、16S rRNA、marRの遺伝子から線状断片のプールを生成します(プライマー配列とPCR条件については表2を参照)。
  2. PCR精製キットを使用してPCR産物を精製し、PCR産物を一緒にプールします。
  3. プールしたアンプリコンを等量の1.5 mL微量遠心チューブに分割し、1つのチューブに「インプットDNA」とラベルを付けます。
  4. 「インプットDNA」とラベル付けされたチューブを除く各チューブに、所望の条件(9%、20%、30%PEG-8000、0.3 M、1.2 M NaCl)に従ってPEGおよびNaClを添加し、最終容量を1 mLにします。
  5. チューブを4°Cで一晩(~16-18時間)インキュベートします。
    注:3.16までの残りの手順では、「インプットDNA」は変更されずに冷蔵庫に保管されます。
  6. 卓上型微量遠心分離機で、所望の速度(15,000 x g または20,000 x g)に従ってチューブを4°Cで1時間回転させます。
  7. マイクロピペットを使用して、ペレットの反対側から上清900μLを慎重に取り除きます。
  8. 最初のエタノール洗浄:ペレットに冷やした70%エタノール900μLを加え、チューブを静かに反転させて混合します。
  9. ステップ3.6で使用したのと同じ速度(15,000 x g または20,000 x g)でチューブを4°Cで30分間回転させます。
  10. デカンテーションによって上清を取り除きます。
  11. 2回目のエタノール洗浄:500μLの冷やした70%エタノールをペレットに加えます。
  12. ステップ3.6で使用したのと同じ速度(15,000 x g または20,000 x g)でチューブを4°Cで30分間回転させます。 上清をデカンテーションで捨てます。
  13. チューブを裏返し、ティッシュペーパーで軽くたたいて、毛細管現象により残留エタノールを除去します。
  14. すべてのエタノールが蒸発するまで、加熱ブロック上でチューブを37°Cで5〜10分間開いたままにして、DNAペレットを完全に乾燥させます。
  15. ペレットを20 μLのオートクレーブ済み二重蒸留水に再懸濁します。
  16. さまざまな条件で沈殿したDNAの濃度と「インプットDNA」を、Nanodrop分光光度計または蛍光光度計で測定します。
  17. 沈殿させたDNAを1%アガロースゲルにロードして、DNAを可視化します。

  

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結果

廃水サンプルからのDNAの高収率抽出のためのプロトコルの確立
以前に確立されたプロトコルの修正版を、水サンプル17からの高品質のDNAおよびRNAの抽出に使用した。サンプルは、北インドのデリー首都圏にあるオープンドレーンと下水処理場から供給されました。PEGとNaCl(図1)を使用して前処理を行った後、サンプルをキットで処理し、土壌と水からDNAを抽出しました。いずれの場合も、細胞内細菌のDNAに対応すると思われる顕著な高分子量バンドと、環境サンプル37に典型的なバックグラウンドスメアが観察された(図2)。

下水処理場(STP)の排水からの効率的なDNA抽出の欠如...

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ディスカッション

AMRは、WHOがリストアップした今日の健康上の脅威のトップ10の1つであり、AMRの環境監視は世界中で重要なツールとして認識されています。冒頭で述べたように、環境AMRの包括的な記録には、低分子量、断片化、および細胞外DNAが含まれます。ここで報告されている高濃度のPEGと塩(30%PEGおよび1.2 M NaCl)を組み合わせた前処理プロトコルは、高分子量画分(主にゲノムおよびプラスミドDNA)の抽出に影響を与えることなく、低分子量DNAの割合を濃縮することにより、この結果を達成します。これは、低PEGおよびダイレクトキットプロトコル(前処理なし)を使用した以前の濃縮方法とは対照的に、大量の処理が必要なために面倒でした。低分子量DNAの回収には、低PEG濃度での前処理は非効率的でした(ここでは「低」とは600 bp未満のDNAバンドを指します)。前処理でPEGを使用しない場合、DNA抽出は不十分で、PEGとNaClを使用した場合の70%に対して、インプットDNAの10%しか回収されません(図8)。PEGとNaClの添加に加えて、もう1つの重要なステップは、キットから残留エタ...

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

私たちは、APSI Indiaチーム(Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/)の一部として、ロックフェラー財団(Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018)からの資金援助に感謝します。また、この研究を支援するためにAxis Bankと、アショカ大学のTrivedi School of Biosciencesが機器やその他の支援を提供してくれたことにも感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
24人用微量遠心機Eppendorf Centrifuge 5425 REP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag.Ph Eur エタノール絶対 分析用)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
ベンチトップ冷蔵遠心分離機Eppendorf Centrifuge 5920 R EP5948000131
ChemiDoc Imaging SystemBioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro KitQiagen47014
DNeasy PowerWaterPro KitQiagen14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µL + 10x DreamTaq バッファー*ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA LadderInvitrogen10488091
Maxiamp PCR チューブ 0.2 mLターソン510051
分子生物学グレードの PCR 用水HiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC 微量 UV-Vis 分光光度計Thermo Scientific13400519
パラフィルムビーミスS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR &ゲルクリーンアップキットQiagen28506
Qubit 4 蛍光光度計 (Wi-Fi 付き)ThermofisherQ33238
Qubit Assay TubesThermofisherQ32856
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad rangeThermo ScientificQ32853 (500 assays)塩化
ナトリウムHiMediaTC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102
T100 ThermalCycler BioRad1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System)Applied Biosystems4484073
Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1125

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