方法論記事

#946;-1,3-グルカナーゼおよびペルオキシダーゼのジ ウラフィス・ノキサ 病侵入に対するコムギ細胞壁防御機構の物理化学的性質の解明

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DOI：

10.3791/66903

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2024年7月26日

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1Carbohydrates and Enzymology Laboratory (CHEM-LAB), Department of Plant Sciences, University of the Free State, 2Faculty of Natural and Agricultural Sciences, Department of Plant Science, Botany, Plant Biochemistry and Physiology, University of the Free State, 3Agricultural Research Council - Small Grain Institute

この記事について

サマリー

本プロトコルは、コムギ植物における細胞壁関連酵素、主にβ-1,3-グルカナーゼおよびペルオキシダーゼを研究し、特徴付けるために使用される手順を説明しています。それらの活性レベルは、コムギとRWAの相互作用中に増加し、アブラムシの摂食を阻止する細胞壁強化を通じて植物の防御応答に関与しています。

要約

ロシア産コムギアブラムシ(RWA)に感染したコムギ植物は、過敏反応(HR)やβ-1,3-グルカナーゼやペルオキシダーゼ(POD)などの病原性関連(PR)タンパク質の誘導など、一連の防御応答を誘発します。この研究は、細胞壁関連PODとβ-1,3-グルカナーゼの物理化学的特性を特徴付け、RWASA2-小麦相互作用中の細胞壁修飾に対するそれらの相乗性を決定することを目的としています。感受性Tugela、中等度抵抗性のTugela-Dn1、および抵抗性Tugela-Dn5品種は、温室条件下で事前に発芽および植え付け、植え付け後14日で施肥し、3日ごとに灌漑しました。植物には、3葉の段階で同じRWASA2クローンの単為生殖個体20人が感染し、葉は寄生後1〜14日で収穫されました。細胞間洗浄液(IWF)を真空ろ過を用いて抽出し、-20°Cで保存した。 葉の残渣を粉砕して粉末にし、細胞壁成分に利用しました。PODの活性と特性評価は、5 mMのグアイアコール基質とH2O2を使用して決定され、470 nmでの吸光度の変化をモニタリングしました。β-1,3-グルカンおよびβ β-1,3-グルカン基質および-1,3-1,4-グルカン基質を用いたDNS試薬による加水分解物中の総還元糖の測定、540nmでの吸光度の測定、グルコース標準曲線を用いて、-1,3-グルカナーゼ活性、pH、および温度の最適条件を実証した。最適pHはpH 4〜9、最適温度は25〜50°C、熱安定性は30°C〜70°Cの間で決定されました。β-1,3-グルカナーゼ基質の特異性は、カードランおよび大麦β-1,3-1,4-グルカン基質を使用して、25°Cおよび40°Cで決定されました。さらに、β-1,3-グルカナーゼの作用機序は、ラミナリビオースからラミナリペンタオースまでを用いて決定されました。オリゴ糖加水分解生成物のパターンを薄層クロマトグラフィー(TLC)で定性的に分析し、HPLCで定量的に分析しました。この研究で提示された方法は、RWAを小麦に寄生させ、細胞壁領域からペルオキシダーゼとβ-1,3-グルカナーゼを抽出し、それらの包括的な生化学的特性評価を行うための堅牢なアプローチを示しています。

概要

ロシア産コムギアブラムシ(RWA)は、小麦や大麦に蔓延し、大幅な収量減少や穀物品質の低下を引き起こします。コムギは、耐性品種のβ-1,3-グルカナーゼおよびペルオキシダーゼ活性レベルを増加させるなど、いくつかの防御応答を誘発することにより蔓延に応答しますが、感受性品種は、初期の蔓延期間1,2,3,4でこれらの酵素の活性を低下させます。コムギ植物におけるβ-1,3-グルカナーゼとPODの主な機能には、抵抗性品種におけるカロース蓄積の調節と、RWAの蔓延中に細胞壁とアポプラスト領域で消光する活性酸素種(ROS)が含まれていました1,3,5,6,7。Mafaら6は、RWASA2の蔓延時に、耐性コムギ品種のPOD活性の増加とリグニン含有量の増加との間に強い相関関係があることを示しました。さらに、リグニン含有量の増加は、感染した抵抗性コムギ品種の細胞壁が強化され、RWAの摂食が減少したことを示しました。

ほとんどの研究者グループは、小麦/大麦-RWA相互作用中のアポプラストβ-1,3-グルカナーゼとPODを抽出して研究しました。さらに、これらの研究のほとんどは、これらの酵素が細胞壁領域での酵素の存在を測定することなく、RWAが蔓延した小麦植物の細胞壁に影響を与えると主張していました。顕微鏡技術を使用して、β-1,3-グルカナーゼ活性レベルがカロース調節に関連していることを示したり、耐性6,10のPOD活性と細胞壁修飾との相関関係を実証するために主要な細胞壁成分を抽出したりした研究はごくわずかです。β-1,3-グルカナーゼとPODの細胞壁との会合を調査できていないことは、研究者が細胞壁に結合した酵素を直接測定できる方法を開発する必要があることを示しています。

現在の方法では、細胞壁結合酵素を抽出する前に、葉組織からアポプラスティ液を除去することが必要であると提案されています。アポプラスチック液の抽出手順は、細胞壁結合酵素の抽出に使用される葉組織から2回実行する必要があります。このプロセスにより、アポプラスト酵素と細胞壁領域に見られる酵素との汚染と混同が減少します。そこで、本研究では、細胞壁に結合したPOD、β-1,3-グルカナーゼ、およびMLG特異的なβ-グルカナーゼを抽出し、それらの生化学的特性評価を行った。

プロトコル

この研究は、フリーステート大学の環境およびバイオセーフティ研究倫理委員会(UFS-ESD2022/0131/22)の承認と許可を得て実施されました。ここに掲載されている試薬と機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1.植物の成長条件

  1. 各小麦品種の250個の種子、すなわち、感受性ツゲラ、中等度耐性のトゥゲラ-Dn1、 および耐性ツゲラ-Dn5を別々のペトリ皿で発芽させます。
  2. 各シャーレに5 mLの蒸留水を加え、パラフィンフィルムで密封し、25°Cに設定した発芽チャンバーで2日間インキュベートします。
  3. 各品種の発芽種子を、制御された温室条件下で、1:1の土壌とピートモス(ポットあたり15植物)を含む15cmのポットに移植します。
  4. 温度レジームを夜間と昼間はそれぞれ18°Cと24°Cに設定します。
  5. 水道水を使用して3日ごとに植物を灌漑し、発芽後14日後に2 g / Lの肥料を供給します。
  6. 植物をネットで包まれたケージに入れ、第3葉のステージ2,6(各品種の4つの生物学的複製)まで成長させます。

2. RWASA2による小麦品種の蔓延

  1. Jimoh et al.11およびMohaseおよびTaiwe12によると、Tugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5小麦品種にRWASA2を寄生させます。
  2. 植物をケージ内の2つの別々のセットに保管します。ネットで覆われた成長チャンバーの各ポットに、植物ごとに同じRWASA2クローンの20人の単為生殖個体を1セット寄生させます。別の小麦植物のセットを、清潔なネットで成長チャンバーの下の別の部屋に保管し、それらをコントロールとして扱います。
    注意: 2つの処理を別々の部屋に保管し、ネットに包まれたケージで植物を覆います。また、研究で2つの異なるRWAバイオタイプを使用する場合は、1つのRWAバイオタイプが感染した植物と2つ目のバイオタイプが感染した植物をできるだけ遠ざけるか、RWASA2の相互汚染を避けるためにネットで覆われた成長チャンバーの下の別々の部屋に保管してください。
  3. 収穫は、短期給餌期間(1日、2日、3日)と長期給餌期間(7日、14日)の2つの異なる時間体制で2枚目と3枚目の葉を選び、湿らせたペーパータオルで包みます。
  4. 収穫した葉をすぐに氷の入った箱に移し、細胞間洗浄液(IWF)抽出前に葉の代謝を減らします。

3. アポプラストからの細胞間洗浄液(IWF)の抽出

  1. 小麦品種3種ほどの収穫した葉を7cmに切ります。
  2. 葉片を蒸留水で2回すすぎ、切り口6,13から細胞質汚染を取り除きます。
  3. 葉片を厚肉ガラス管に挿入し、サンプルを抽出バッファー(50 mM Tris-HCl、pH 7.8)に浸します。
  4. ウォータージェットポンプを使用して5分間真空浸透させ、抽出バッファーを葉に含浸させます。
  5. その後、ガラス管から葉片を取り出し、ペーパータオルで拭き取り乾燥します。
  6. 乾燥させた葉片を、穴あきディスクを取り付けた予冷済みの遠心分離チューブに垂直に挿入し、500 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  7. 100 μLピペットを使用して、上清を予冷した1.5 mL微量遠心チューブに回収します。
  8. 同じ葉の材料で抽出手順全体を繰り返します。
  9. 採取した上清を混ぜ合わせ、-20°Cで保存します。
    注:上清アリコートは、アポプラスト含有量またはIWFの供給源として扱われます。今回の研究ではIWFは使用していませんが、細胞壁に結合したβ-1,3-グルカナーゼとペルオキシダーゼ(POD)を抽出する前に、葉の組織からIWFを除去することが重要でした。

4. 細胞壁関連β-1,3-グルカナーゼおよびPODの抽出

注:IWF抽出後に残った葉残基は、全細胞壁タンパク質を抽出するために使用されました。

  1. 乳鉢と乳棒を使用して、葉の残留物を液体窒素で微粉末に粉砕します。
  2. 約200 mgの粉末葉組織を4 mLの抽出バッファー(50 mMリン酸ナトリウムと1%(w / v)ポリビニルポリピロリドン(PVPP);pH 5.0)を含む乳鉢に移し、続いて乳棒で滑らかなペーストに粉砕し、マイクロ遠心チューブに移します。
  3. 混合物を微量遠心チューブ内で氷上で3分間インキュベートした後、10,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
  4. 上清(総タンパク質抽出物)を微量遠心チューブ(2 mLのアリコート)に収集し、研究全体のβ-1,3-グルカナーゼおよびPODの供給源として使用します。

5. タンパク質標準物質の測定

  1. Bradford法14に従って抽出物の総タンパク質濃度を決定します。
  2. 0.0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL の濃度のウシ血清アルブミン(BSA)溶液を調製し、50 mM リン酸ナトリウムバッファーに溶解してタンパク質標準品を調製します。
  3. 190 μL(0.25% v/v)のBradford試薬を含む96ウェルマイクロプレートに各BSA溶液10 μLを加えて、スタンダードを調製します( 材料表を参照)。
  4. 25°Cで20分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーを使用して595 nmの吸光度を測定し、吸光度の値を使用してタンパク質濃度を定量するための標準曲線を調製します。
  5. タンパク質濃度の定量化
    1. 抽出した酵素10 μL(ステップ4)を、190 μL(0.25% v/v)のBradford試薬をトリプリケートに入れた96ウェルマイクロプレートに加えます。
    2. 室温(25°C)で20分間インキュベートします。
    3. マイクロプレートリーダー付きの分光光度計を使用して595 nmでの吸光度を測定し、吸光度の値を使用して、BSAをタンパク質標準として使用してタンパク質濃度を決定します(ステップ5.4で調製)。

6. β-1,3-グルカナーゼ活性のためのグルコース標準液を調製します

  1. 0.00 mg/mL から 1.0 mg/mL の濃度の標準溶液(0.0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL)の標準溶液を、グルコースを蒸留水に溶解して調製します。
  2. 各グルコース溶液300 μLと3,5-ジニトロサリチル酸(DNS)試薬600 μLを1:2の比率で1.5 mLの微量遠心チューブに加え、反応液を100°Cで5分間インキュベートします(DNS試薬の材料表を参照)(Miller et al.15)。
  3. 混合物を室温で冷ましてから、分光光度計を使用して540nmの吸光度を測定します。
  4. 平均吸光度値を使用して、β-1,3-グルカナーゼ酵素活性を決定するための標準曲線を作成します。

7. β-1,3-グルカナーゼ活性アッセイの測定

注:Tugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5から抽出された細胞壁結合β-1,3-グルカナーゼの酵素活性は、Millerらによって記述された修正された方法を使用して、0.5%(w / v)混合結合β-1,3-グルカン(MLG)および0.4%(w / v)β-1,3-グルカン基質の加水分解から放出される総還元糖の量によって決定されました。.タンパク質アリコートの入ったチューブは常に氷の上に置いてください。サンプルが凍結している場合は、氷上で解凍し、解凍後すぐに進めてください。

  1. 酵素抽出物200 μL(特に明記されていない限り、すべての反応でタンパク質濃度を20 μg/mLから90 μg/mLに保ちます)と50 mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH 5.0)に溶解した基質300 μLを1.5 mL微量遠心チューブに加えます。
    注:すべての基質に対して酵素抽出物なしで並列ブランク反応を実行し(最初のブランク)、酵素ブランクは基質を含まない酵素抽出物(2番目のブランク)で構成されます。基質および酵素抽出物の両方を、それぞれ第1および第2の黒の緩衝液で置換した。
  2. 反応液を37°Cで24時間インキュベートし、100°Cで5分間加熱して反応を終了し、次いで10,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  3. 上清300 μLと600 μLのDNS試薬(1:2の比率)を新しい1.5 mL微量遠心チューブに混合し、100 °Cで5分間煮沸します。
  4. 溶液を室温まで冷却し、分光光度計を使用して540nmで吸光度を測定します。
    注:混合物中の総還元糖の濃度が高いと、暗褐色の溶液になり、分光光度計を使用して読み取るのが困難です。したがって、吸光度を読み取る前に、サンプルをさらに希釈する必要があります。
  5. 上記のステップ 6.4 で作成したグルコース標準曲線を使用して、標準曲線の SI 単位で酵素活性を測定します。
  6. 活性をμmolグルコース/h/mgタンパク質で表される特定の活性に変換するには、以下の式を使用します。
    比活性=[(酵素活性/180.16)×1000]/時間/タンパク質濃度
    注:mg / mL単位の酵素活性をg / mLに変換します。180.16 g/molはグルコースの分子量、1000はMをマイクロモルに変換する因子、時間は反応期間、タンパク質抽出物の濃度はmg/mLで表されます。β-1,3-グルカナーゼ活性の1単位は、1時間の反応期間内に基質から放出される1μmolのグルコースとして定義されます。

8. ペルオキシダーゼ(POD)活性の測定

注:Tugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5小麦品種の細胞壁結合ペルオキシダーゼ活性は、グアイアコール16から単位時間あたりに産生されるテトラ-グアイアコールの形成を定量化することによって決定されました。

  1. 酵素抽出物30μL、1%(v/v)H2O230μL、 5mMグアイアコール970μLを25°Cのキュベットに加えます。
    注:酵素抽出物を含まないブランク反応(最初のブランク)と、基質を含まない酵素サンプル用の別のブランク(2番目のブランク)を行います。酵素サンプルまたは基質サンプルは、第1ブランクおよび第2ブランクでそれぞれ50 mMリン酸ナトリウム緩衝液に置換しました。
  2. 分光光度計の運動モードを使用して、470nmでの吸光度の変化を監視します。
  3. グラフが線形であった傾きを特定し、それを吸光度値として使用します。
  4. 平均吸光度を計算し、POD活性の計算に使用します。
  5. グアイアコールのモル吸光係数(26.6 mM-1 cm-1)を使用してペルオキシダーゼ活性を計算し、その活性をμmolテトラ-グアイアコール/min/mgタンパク質で表します。
  6. Mafa et al.6 で使用した式を使用して POD アクティビティを計算します。
    ポッド活性= [(ΔABS × DF) ÷タンパク質濃度] × 26.6 mM-1 cm-1 × 1 cm
    注:ここで、ΔABS =平均吸光度。DF = 希釈係数;26.6 mM-1 cm-1 = グアイアコールの吸光係数。

9. PODの特性評価

注:POD特性評価アッセイは、ステップ8で説明した同様の方法に従って、Tugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5の侵入後3日(dpi)酵素抽出物を使用して、反応バッファーと温度をわずかに変更して実施しました。実験が行われている間、酵素サンプルは常に氷上に保管されていました。平行ブランク反応を使用して、反応を四重化して実行します。

  1. 最適なpHアッセイを行うには、以下の手順を実行します。
    1. グアイアコール基質を50 mMバッファー(クエン酸ナトリウム、pH 4および5)、リン酸ナトリウム(pH 6および7)、およびTris-HCl(pH 8および9)に溶解します( 材料表を参照)。
    2. ステップ8で説明したように、反応を25°Cで実行します。
  2. 最適な温度アッセイを行うには、以下の手順を実行します。
    1. 反応液をそれぞれ25°C、30°C、40°C、50°Cで分析します。
    2. 緩衝液pH 5(pH optimum)に溶解したグアイアコール基質を使用し、ステップ8で説明したように反応を実行します。
  3. 耐熱性アッセイの場合は、以下の手順を実行します。
    1. 反応を開始する前に、酵素を37°C、50°C、および70°Cで30分間インキュベートします。
    2. ステップ8で説明した方法に従って、50 mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH 5)を使用し、40°C(最適温度)で反応を実行します。

10. β-1,3-グルカナーゼの特性評価

注:ステップ7で説明した方法に従って、3 dpi酵素抽出物を使用し、反応バッファーと温度にいくつかの変更を加えながら、特性評価アッセイを実施します。反応を四重極で実行し、各基質に対して平行なブランク反応を行います。

  1. 最適なpHアッセイを行うには、以下の手順に従ってください。
    1. MLGおよびβ-1,3-グルカン基質を50 mMバッファー(クエン酸ナトリウム、pH 4および5)、リン酸ナトリウム(pH 6および7)、およびTris-HCl(pH 8および9)に溶解します。
    2. ステップ7の説明に従って反応を実行します。
  2. 最適な温度アッセイを行うには、以下の手順に従ってください。
    1. 反応液をそれぞれ25°C、30°C、40°C、50°Cで分析します。
    2. 50 mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 5)に最適なpH(ステップ10.1で取得)で溶解したMLGおよびβ-1,3-グルカン基質を使用し、ステップ7で説明したように反応を実行します。
  3. 熱安定性アッセイについては、以下の手順に従ってください。
    1. 反応を開始する前に、酵素を37°C、50°C、および70°Cで30分間インキュベートします。
    2. 50 mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 5)に溶解した基質を用いて反応を行い、25°Cおよび40°Cで24時間インキュベートします。

11. β-1,3-グルカナーゼの異なるグルカン基質に対する作用機序の評価

注:グルカン基質は、その骨格に同じグルコース残基を含んでいるが、グルコピラノースユニット間のグリコシド結合は多様であり、αまたはβ配向をとることができる17。グリコシド結合は、グルコース分子のいくつかの炭素原子間に形成され、それらの化学構造を定義することができます、例えば、β-1,3-グルカン、β-1,4-グルカン、および混合結合-β-1,3-1,4-グルカン(MLG)18,19,20。β-1,3-グルカナーゼの作用機序は、RWASA2に感染したTugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn 5サンプル(酵素源)と、次の基質β-1,3-グルカン(CM-カードラン)、MLG(大麦由来)、およびβ-1,4-グルカン(AZO-CM-セルロース)を使用して決定しました。作用機序は、0.1%(w/v)β-1,4-グルカン、0.4%(w/v)β-1,3-グルカン、または0.5%(w/v)MLG基質を使用して、最適なアッセイ条件(25°Cおよび40°C、pH 5.0)で決定します。

  1. 基質を50 mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 5)に溶解します。
  2. 酵素抽出物200μLと基質300μLを1.5mLの微量遠心チューブに加えます。
  3. 反応液を25°Cと40°Cの2つの別々の温度で8時間インキュベートします。
  4. 100°Cでの加熱による反応の終了。
  5. β-1,3-グルカンとMLGの反応混合物を10,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、ステップ7.3の説明に従って進めます。
  6. β-1,4-グルカンの場合、100°Cで反応を終了した後、混合物を800μLの無水エタノールで希釈し、4°Cで10,000 x gで10分間遠心分離します。
  7. 上清をカーブに移し、分光光度計で590 nmの吸光度を測定し、製造元の手順( 材料の表を参照)を使用してβ-1,3-グルカンのβ-1,3-グルカナーゼ活性を計算し、活性を単位/ mgタンパク質で表します。

12. β-1,3-グルカナーゼの作用機序の決定

注:RWASA2に感染したTugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5誘導されたβ-1,3-グルカナーゼの作用機序は、ラミナリンオリゴ糖(LAM)でアッセイされ、重合度(DP)は5〜2でした。薄層クロマトグラフィー(TLC)、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)、およびグルコースオキシダーゼペルオキシダーゼ(GOPOD)キットを使用して、β-1,3-グルカナーゼが基質を加水分解するために必要なDPを決定します。TLCは定性分析に、LC-MSは定量分析に用い、反応後の加水分解物中のオリゴ糖の濃度を決定した21。

  1. β-1,3-グルカナーゼの作用機序の反応を準備します
    注:濃縮タンパク質抽出物を10 kDa遠心分離機濃縮膜フィルターで調製し、実験用の濃縮および非濃縮のRWASA2感染タンパク質抽出物を用意します。
    1. 各品種から抽出した酵素を濃縮するには、抽出物5 mLを10 kDa遠心濃縮メンブレンフィルターに移します。
    2. 抽出物を含むメンブレンフィルターチューブを15,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。
    3. ラミナリペンタオース(LAM5)、ラミナリテトラオース(LAM4)、ラミナリトリオース(LAM3)、およびラミナリビオース(LAM2)( 材料表を参照)を50 mMクエン酸ナトリウム(pH 5)に溶解して、10 mg/mLにします。
    4. 反応を開始するには、タンパク質抽出物20 μLとラミナリペンタオース(LAM5)、ラミナリテトラオース(LAM4)、ラミナリトリオース(LAM3)、およびラミナリビオース(LAM2)40 μLを加えます。
    5. 反応を40°Cで16時間インキュベートし、100°Cで5分間煮沸して終了します。
  2. 薄層クロマトグラフィー(TLC)の実施
    1. シリカ板4枚を10cm2枚に切り、片方の端の底から1cmのスペースを残して、プレートの表面に1本の線を引きます。
    2. 線の上にドットをマークし、ラミナリンオリゴ糖のさまざまな品種とDPに従って、1 cm間隔でマークします。濃縮タンパク質抽出物用に2枚のシリカプレートを取り、他の2枚を非濃縮抽出物用に取ります。
    3. 反応混合物3μLをシリカプレート上の対応するマークされたスポットに3〜5倍加え、プレート上のスポットを完全に乾かしてからプロセスを繰り返します。
    4. n-ブタノール:酢酸:水(2:1:1 v/v/v)の移動相が入ったTLCタンクにシリカプレートを静かに入れ、サンプルのスポットがある側を底に置きます。
    5. 移動相をプレートの下から上に移動するのを待ちます。
      注: この手順には約 2 時間かかる場合があります。サンプルが分離している間は、タンクを動かしたり邪魔したりしないでください。
    6. プレートを移動相から取り出し、室温で乾燥させます。
    7. 小さな容器に染色液を加え、シリカプレートを0.3%(w / v)ナフトールの染色液に95%(v / v)エタノール、5%(v / v)硫酸を使用して5秒間静かに沈め、取り出してから室温で乾燥させます。
      注意: このステップでは、加熱ブロック/オーブンのスイッチを入れ、温度を100°Cに設定します。
    8. 乾燥シリカプレートを加熱ブロックに置き、100°Cで7〜10分間、または青紫色の斑点が現れるまで加熱します。青紫色の斑点を示すシリカプレートの写真を撮り、それらを記録します。
  3. ラミナリン-オリゴ糖加水分解物の濃度を定量化
    注:LAM加水分解物の濃度は、濃縮タンパク質抽出物と非濃縮タンパク質抽出物の両方について定量化されます21。
    1. C18(炭水化物4.6 × 250 mm)カラムに各サンプル20 μLを添加し、水(溶媒A)とアセトニトリル(溶媒B)のグラジエントを使用して500 μL/minの流速で100% Bから60% Bまで10分間で分離し、その後、合計実行時間20分のカラム再平衡化ステップを行い、カラムの再平衡化を可能にします。
    2. 溶出する分析種を、400°Cのヒーター温度で質量分析イオン源の負エレクトロスプレーモードでイオン化し、余分な溶媒、30 psiネブライザーガス、30 psiヒーターガス、および20 psiカーテンガスを蒸発させます。
    3. クラスタリング解除電位を 350 V に設定します。
    4. 質量分析計で溶出する分析種を、150 Daから1000 Daの範囲で3秒の滞留時間でQ1スキャンモードで分析します。
    5. スプレッドシートに分析物の濃度を記録します。
  4. グルコース濃度の定量化
    1. メーカーの指示に従って、GOPOD試薬を使用してラミナリン加水分解によって生成されたグルコース濃度を分析します22,23。
    2. 分光光度計の固定モードで510nmの吸光度を測定します。

13. データの収集と分析

  1. 蔓延またはサンプル収集中のバイアスを避けるために、すべての実験をランダム化し、4倍で分析を実施します。
  2. 特に明記されていない限り、平均±標準偏差を使用して、収集された実験データから生成されたグラフや表の値を表します。
  3. Microsoft Excel を使用して、すべてのデータを分析し、グラフを生成します。
  4. 互換性のあるソフトウェアで統計分析を実行します。
    注:多因子分散分析(ANOVA)を実行して、治療とフィッシャーLSDとの間の有意性を検定し、アルファ値0.05で均質なグループを検定します。

結果

コムギ品種の4つの生物学的複製物(Tugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5)は、3葉の成長段階でRWASA2に感染しました。蔓延後、葉は1、2、3、7、および14dpiで収穫されました。対照処理にはRWASA2が寄生していなかったため、実験結果はストレスにさらされていない小麦植物と同等になりました。実験は四重極で行われ、結果は平均値として提示されました。

RWASA2 に感染した抽出物と対照抽出物の両方のタンパク質濃度は、BSA をタンパク質標準として使用して定量しました。これは、β-1,3-グルカナーゼとPODの酵素活性を決定し、すべての反応で使用されるタンパク質濃度がすべてのサンプルで既知であることを確認するのに役立ちました。その差はごくわずかでした。データは、グラフ形式または表形式で表示できます。最初のグラフ形式は、酵素活性と特性評価アッセイ結果の両方について、侵入後日数(x軸)に対してプロットされた酵素特異的活性(y軸)を表すために使用されました。RWASA2に感染した耐性Tugela-Dn5 サンプルにおけるβ-1,3-グルカナーゼ、MLG特異的β-グルカナーゼ、およびPODの比活性の増加は、酵素が防御応答に関与していることを示しました(図1 および 図2)。さらに、両方の酵素は、RWASA2が感染した感受性ツゲラで時間の経過とともに活性を有意に失いました。

細胞壁に関連するβ-1,3-グルカナーゼとPODの生化学的特性は、活性を相対活性または特異的酵素活性のパーセンテージで表すことによって決定され、それぞれ折れ線グラフと棒グラフで表されます(図3)。その結果、β-1,3-グルカナーゼとPODは、酸性細胞壁条件に対応するpH類似の最適条件(pH 5)を持つことが示されました(図3)。MLG特異的なβ-グルカナーゼもpH 5で特異的な活性を示したことに注意することが重要です。しかし、同じ条件で最大80%の相対活性を失ったβ-1,3-グルカナーゼよりも塩基性条件で安定していました。その結果、MLGとβ-1,3-グルカン基質を触媒する2つの酵素が、最適なpHに基づいて細胞壁領域から正常に抽出されたことが確認されました。この主張は、β-1,3-グルカナーゼが50°Cまでの温度にのみ耐え、70°Cで80%以上の相対活性を失うことが確認された熱安定性アッセイの結果(図4)によって検証されました(PODは同じプロファイルを持っていました)。対照的に、MLG特異的なβ-グルカナーゼ酵素は、25°Cで最も高い活性を示し、その後徐々に活性が低下しましたが、この酵素は50°Cおよび70°Cで50%以上の相対活性を保持しました。 その結果、MLG特異的なβ-グルカナーゼは、Tugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5から抽出されたβ-1,3-グルカナーゼおよびPODと比較して、独特の生化学的特性を示すことが確認されました。

β-1,3-グルカナーゼの作用機序は、DPが5〜2のラミナリンオリゴ糖(LAM5〜LAM2と呼ばれる)で実証されました。TLCの結果は、寄生したTugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5がβ-1,3-グルカナーゼ酵素を持っており、短いオリゴ糖(LAM3)と比較して、主に長いオリゴ糖(LAM5およびLAM4)を加水分解することを示しました。TLCプレート上に視覚化された青紫色の斑点の強度は、LAM5とLAM4のバンドの強度が低く、耐性と中程度の耐性の品種でLAM3がそれに続くことを示しました(図5)。感受性の高いツゲラ品種は、β-1,3-グルカナーゼが他のオリゴ糖(LAM4-LAM2)よりもLAM5を加水分解し、より強いバンドを示したことを示しました。作用機序は、加水分解物の濃度としても表され、より短いオリゴ糖(LAM3およびLAM2)の加水分解中に、より高いDPと中程度の活性を持つラミナリンオリゴ糖の効率的な加水分解を示すヒートマップの表に示されています(表1)。

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図1:RWASA2に感染したTugela(A)、Tugela-Dn1(B)、およびTugela-Dn5(C)から抽出されたペルオキシダーゼの比活性(感染後14日)。実験は四重で行われました。値とエラーバーは、それぞれSD±平均を表します。U/mgタンパク質中のUはμmolテトラ-グアヤコール/分を表し、この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。

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図2:RWASA2に感染したTugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5の品種で測定されたβ-1,3-グルカナーゼ特異的活性。酵素活性は、化学的に異なる2つのグルカン基質、すなわち混合結合β-1,3-1,4-グルカン(A-C)とカードラン(D-F)を用いて行った。実験は四重で行われました。値とエラーバーは、それぞれSD±平均を表します。U/mgタンパク質中のUはμmol/hを表します。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図3:RWASA2から抽出したβ-1,3-グルカナーゼ酵素のpH最適アッセイでは、感染後3日目にTugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5が感染しました。実験は、混合結合-β-1,3-1,4-グルカン(A-C)およびカードラン(D-F)基質を用いて行った。実験は四重で行われました。値とエラーバーは、それぞれSD±平均を表します。U/mgタンパク質中のUはμmol/hを表します。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図4:耐熱性アッセイ。RWASA2に感染したTugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5に由来するβ-1,3-グルカナーゼの熱安定性アッセイは、寄生の3日後に、β-1,3-1,4-グルカン(A-C)およびβ-1,3-グルカン(D-F)で調査されました。実験は四重で行われました。値とエラーバーは、それぞれSD±平均を表します。U/mgタンパク質中のUはμmol/hを表します。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図5:ラミナリンオリゴ糖に対するβ-1,3-グルカナーゼの作用機序の解析。 ラミナリンオリゴ糖はL5、L4、L3、L2で表され、それぞれラミナリペンタオース(LAM5)、ラミナリテトラオース(LAM4)、ラミナリトリオース(LAM3)、ラミナリビオース(LAM2)と同等であった。赤い矢印はグルコース(GLU)を示し、青い矢印はオリゴ糖を含まない酵素のプロファイルを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:RWASA2が3日間寄生したコムギ品種から抽出された濃縮β-1,3-グルカナーゼで製造されたラミナリン-オリゴ糖。 加水分解物中のオリゴ糖の濃度は、LC-MSで測定しました。LAM5、LAM4、LAM3、LAM2、およびGLUは、それぞれラミナリペンタオース、ラミナリテトラオース、ラミナリトリオース、ラミナリビオース、グルコースを表します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

小麦と大麦は、ロシアのコムギアブラムシ(Diuraphis noxia)7,24を含むアブラムシ種が頻繁に蔓延する穀物作物です。抵抗性コムギ植物は、カロースとリグニンの蓄積を調節することにより、細胞壁を修飾するために、蔓延期間を通じて防御応答としてPODおよびβ-1,3-グルカナーゼ活性のアップレギュレーションを誘導します6,25,26,27。ほとんどの研究では、アポプラスト3,12,28からPODおよびβ-1,3-グルカナーゼ酵素が抽出されており、それらの細胞壁機能は非常に推測的であることに注意することが重要です。本研究では、細胞壁に結合したβ-1,3-グルカナーゼ、MLG特異的なβ-グルカナーゼ、および全タンパク質の一部としてPODを抽出する方法を開発しました。これらの酵素は、対照群と比較して抵抗性コムギ品種で非常に活性が高かったが、感受性品種では活性が遅れていた。実験でコントロールを使用することで、壁に結合した酵素の活性レベルに対する蔓延の影響を理解するのに役立ちました。3番目と2番目の葉組織をサンプリングして、感染したサンプルまたは対照サンプルにすることは、一貫性をもたらすため重要です。また、POD、β-1,3-グルカナーゼ、およびMLG特異的なβ-グルカナーゼ活性が小麦の苗の成長を増加させるため、感染した個体と対照を同じ期間でサンプリングします。

この研究で使用されたカードラン基質は、小麦-RWA相互作用7,24の間に細胞壁領域に堆積したポリマーであるカロースと同様の化学構造を持っています。オオムギMLG基質は、ほとんどの単子葉植物においてキシランと比較して低い割合で存在する細胞壁ヘミセルロースの一部を表しています。基質をクエン酸ナトリウムpH5緩衝液に溶解して、植物細胞壁領域29の酸性状態を模倣した。β-1,3-グルカナーゼとMLG特異的β-グルカナーゼをIWFで除去した場合、残りの葉組織から抽出された全タンパク質は、MLGおよびカードラン基質上で活性を持たなくなります。また、タンパク質抽出物が細胞質領域から供給された場合、それらは中性pH範囲で活性を示します。興味深いことに、両方の酵素が全タンパク質抽出物に存在していたのは、MLGおよびカードラン基質の加水分解に成功していたためです。それぞれの酵素によるMLGとカードランの加水分解により還元糖が生成され、Mafaらによる改変された方法に従ってDNS試薬によって検出されました6。サンプルの総還元糖濃度が高い場合、還元糖濃度が低いと、DNS試薬の色が黄色から暗褐色に変わるか、黄色から淡褐色に色が変わります(濃いオレンジ色に見えます)。

Guaiacol基質は、POD活性の測定に使用されました。PODは触媒効率が高いため、分光光度計の運動モードを使用してその活性を測定しました。PODは、基質(Guaiacol)の存在下での低濃度のH2O2によって活性化されます。この酵素の活性により、グアイアコールが変換され、茶色 - オレンジ色の化合物であるテトラグアイアコールが形成されます。テトラ・グアイアコールの製造により、PODがフェノール化合物を架橋してオリゴマーを生成するか、フェノール化合物をリグニンに組み込むことが確認されています。PODは、RWASA2に感染した耐性Tugela-Dn5でより高い活性レベルを示し、続いて中等度の耐性Tugela-Dn1が対照と比較して示されました。しかし、PODの活動レベルは、感染した感受性ツゲラでは時間の経過とともに大幅に減少しました。この研究の結果は、RWASA2に感染した耐性コムギ品種がPODを使用してリグニンまたはリグニン-ヘミセルロース結合を架橋することにより細胞壁を強化するという主張によって支持されました6。PODが機能するためにはH2O2が必要であり、これは、細胞壁領域のH 2O2のレベルを調節することにより、細胞壁構造炭水化物の酸化または漂白を減少させたことを示しています。

さまざまなpHおよび温度条件を使用して、これらの細胞壁結合酵素の生化学的最適条件を決定しました。最適条件は、酵素が酸性pH範囲(pH 5)で最適な活性を持つことを示し、これは酵素が細胞壁領域と関連していることを示唆しています。β-1,3-グルカナーゼの最適温度は、β-1,3-1,4-グルカン基質およびβ-1,3-グルカン基質をそれぞれ加水分解するときに、25°Cおよび40°Cで得られました。この観察により、β-1,3-グルカナーゼとMLG特異的β-グルカナーゼは、RWASA2の蔓延中に抵抗性コムギ品種の細胞壁領域に誘導された2つの異なる酵素であることが確認されました。生化学的特性評価は、類似した基質を持つさまざまな酵素を発見または同定するための有望な方法ですが、ウェスタンブロッティングやザイモグラムアッセイなど、他の面倒で正確な方法を使用することをお勧めします。最後に、MLG特異的なβ-グルカナーゼの酵素活性の様式は、MLGオリゴ糖が不足しているため定量化できませんでした。しかし、RWASA2に感染したTugela-Dn5およびTugela-Dn1から抽出されたβ-1,3-グルカナーゼは、LAM5、LAM4、およびLAM3に対して高い活性を示し、感受性Tugelaから抽出されたグルカナーゼは、LAM5およびLAM4に対して高い活性を示しました。このことから、酵素活性の様式を研究することで、RWAに感染した耐性品種と感受性品種に誘導されるβ-1,3-グルカナーゼの微妙な違いも検出できることが確認されています。

現在の研究では、コムギの葉組織から細胞壁に結合した酵素を抽出するための詳細な手順が示されています。抽出後、細胞壁に結合した酵素、すなわちβ-1,3-グルカナーゼ、MLG特異的β-グルカナーゼ、PODの3つを同定しました。これらの酵素の活性レベルは、RWASA2に感染した中等度の耐性Tugela-Dn1および耐性Tugela-Dn5品種で、対照群よりも有意に高かった。これらのことから、細胞壁に結合した酵素が耐性品種の防御応答に寄与していることが確認されました。この特性評価の結果は、細胞壁PODとβ-1,3-グルカナーゼが同じ条件下で機能することが示唆されており、コムギとRWASA2の相互作用中に細胞壁を相乗的に強化することが示唆されています。

現在説明されているプロトコルに干渉するいくつかの制限が特定されています。コムギの不足により、酵素サンプルの抽出に利用できる葉の材料が制限される可能性があります。細胞壁酵素を抽出する前に、アポプラスト由来のIWFが葉サンプルからうまく抽出されない場合、アポプラスト酵素と細胞壁酵素の両方が組み合わされる可能性があります。IWFと細胞壁領域酵素の組み合わせにより、細胞壁に結合した細胞壁結合酵素の研究が困難になります。現在のプロトコルでは、他の制限は確認されていません。

開示事項

著者は、この作品に関与する利益相反を宣言しません。

謝辞

M.マファはNRF-Thuthuka(参照番号:TTK2204102938)から資金提供を受けました。S.N. Zondoは、修士号を取得するために国立研究財団大学院奨学金を受け取りました。著者らは、この研究で使用された種子を提供してくれた農業研究評議会-小粒穀物(ARC-SG)研究所に感謝しています。この資料で表明された意見、調査結果、および推奨事項は著者のものであり、したがって、資金提供者はそれに関していかなる責任も負いません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 kDa遠心分離機濃縮膜装置Sigma-AldrichR1NB84206研究専用です。診断手順には使用できません。生物学的溶液の濃縮と精製に。
2 g LaminaribioseMegazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM2研究、生化学酵素アッセイ、体外診断分析で使用する高純度ラミナリビオース。
3 g LaminaritrioseMegazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM3研究、生化学酵素アッセイ、体外診断分析で使用するための高純度ラミナリトリオース。
3,5 ジニトロ サリチル酸Sigma-AldrichD0550還元糖の比色測定に使用
4 g Laminaritetraose Megazyme (ウィックロー、アイルランド)O-LAM4研究、生化学酵素アッセイ、体外診断分析で使用するための高純度ラミナリテトラオース。
5 g LaminaripentaoseMegazyme (Wicklow, Ireland)O-LAM5研究、生化学的酵素アッセイ、体外診断分析で使用するための高純度ラミナリペンタオース。
95% 無水エタノールSigma-Aldrich107017分析用エタノール絶対
酢酸Sigma-AldrichB00063Acetc 酸 氷河 100% 分析用(酢酸含有)
Azo-CM-CelluloseMegazyme (アイルランド・ウィックロー)S-ACMC多糖類は、糖残基20個につき約1分子の程度まで、レマゾルブリリアントブルーRで染色されています。
ベータグルカン(大麦) Megazyme (Wicklow, Ireland)G6513水に溶けにくい粉末状の基質。β-1,3-グルカナーゼ活性の測定に使用されます。
Bio-Rad Protein Assay DyeBio-Rad Laboratories, South Africa500-0006比色アッセイ色素、濃縮液、Bio-Rad Protein Assay キット I および II 用  
ウシ血清アルブミン (BSA)Gibco Europe810-1018ラボ用のみ
クエン酸Sigma-AldrichC0759ライフサイエンス研究用のみ。診断手順には使用できません。
CMカードラン Megazyme (Wicklow, Ireland)P-CMCURβ-1,3-グルカナーゼ活性を測定するための粉末基質。水に不溶です。
D-GlucoseSigma-AldrichG8270ライフサイエンス研究専用です。診断手順には使用できません。
GuaiacolSigma-AldrichG5502酸化インジケーター。ペルオキシダーゼ活性の測定に使用されます。
過酸化水素BDHラボ用品、イギリス10366酸化剤。
Mikskaar Professional SubstarteMikskaar (エストニア)NI泥炭苔ベースの苗基質。
マルチフィード肥料 (5.2.4 (43))マルチフィードクラシックB1908248最適な根の発達を確保するための高リン(P)要件を持つ若い発育中の植物や苗木用の水溶性肥料です。
ナフトールメルク、ドイツN2780の存在下で水素化を受けます。
フェノールSigma-Aldrich33517感光性。R&の場合Dのみ使用します。薬物、家庭、またはその他の用途には使用しないでください。SDS利用可能な
酒石酸カリウムナトリウム四水和物(ロシェル塩)Sigma-AldrichS2377還元糖の測定に使用される3,5-ジニトロサリチル酸溶液の調製に使用されます。
シリカプレート(TLCシリカゲル60 F254)Sigma-Aldrich60778-25EAシリカゲルマトリックス、蛍光インジケーター付き 254 nm
水酸化ナトリウムSigma-AldrichS8045R&Dのみ使用します。薬物、家庭、またはその他の用途には使用しないでください。
メタ重亜硫酸ナトリウムSigma-Aldrich314483,5-ジニトロサリチル酸溶液の調製中に酸化防止剤として添加されます。
リン酸ナトリウム二塩基性七水和物Sigma-AldrichS9390pHを一定に保つための生物学的研究の緩衝液として使用されます。
リン酸ナトリウム 一塩基性七水和物Sigma-Aldrich71500水に溶ける無機化合物。ケイ酸塩ベースのグラウトの開発における試薬として使用されます。
統計分析ソフトウェアTIBCO Statisticaバージョン 13.1
硫酸メルク、ダルムシュタット、ドイツ30743硫酸 95-97% Hg、ACS 試薬の分析用。
Tris-HClSigma-Aldrich10812846001インキュベーション混合物中の緩衝剤 また、溶解およびTE(Tris-EDTA)バッファーの成分としても使用されています。ライフサイエンス研究専用です。診断手順には使用できません。
UV–可視分光光度計GENESYS 120 
 NI = 特定されていません。
強力な触媒は、

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