方法論記事

フローサイトメトリーによるピロトーシスの検討

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DOI:

10.3791/66912

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2024年5月31日

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1National Key Laboratory of Veterinary Public Health Security, 2Animal Epidemiology of the Ministry of Agriculture, 3College of Veterinary Medicine, China Agricultural University

この記事について

サマリー

この記事では、ニワトリGSDMEのN末端フラグメント(chGSDME-NT)およびヨウ化プロピジウム(PI)に対する抗体による二重染色後のフローサイトメトリーを使用したピロトーシス細胞の同定について説明します。

要約

ピロトーシスは、主に切断されたガスデルミン(GSDM)ファミリータンパク質から生成されるN末端による原形質膜細孔の形成によって引き起こされる炎症性のプログラム細胞死です。ウェスタンブロットによるメンブレン付着GSDM-NTの検査は、ピロトーシスの評価に最も一般的に使用される方法です。しかし、この方法を用いてピロトーシスを有する細胞を他の形態の細胞死と鑑別することは困難です。本研究では、Infectious Bursal Disease Virus(IBDV)に感染したDF-1細胞をモデルとして、ニワトリGSDMEのN末端フラグメントに対する特異的抗体(chGSDME-NT)およびヨウ化プロピジウム(PI)染色を用いて、フローサイトメトリーによるピロトーシスを受ける細胞の割合を定量化しました。chGSDME-NT陽性細胞は、Alexa Fluor 647標識抗chGSDME-NT抗体を用いたフローサイトメトリーで容易に検出できました。さらに、IBDV感染細胞におけるchGSDME-NT/PI二重陽性細胞の割合(約33%)は、模擬感染対照群よりも有意に高かった(P < 0.001)。これらの知見は、フローサイトメトリーによる膜結合chGSDME-NTの検討が、細胞死を経験した細胞のうちピロトーシス細胞を決定するための有効なアプローチであることを示しています。

概要

ピロトーシスは、主に哺乳類のガスダーミン(GSDM)Dによる原形質膜細孔の形成に依存する炎症性のプログラム細胞死です1,2,3。ニワトリのGSDMDの遺伝的欠損4,5のために、ニワトリのピロトーシスのメカニズムはとらえどころのないままです。ガスデルミンファミリーは、GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME、およびDFNB59 3,6などの保存されたタンパク質で構成されています。研究によると、魚類やアヒル由来のGSDMEは、カスパーゼ-1/3/7またはカスパーゼ-3/7によって切断され、ピロトーシス細胞死を誘導することが報告されています7,8。しかし、ニワトリの病原性感染症に対する宿主応答におけるGSDME媒介性ピロトーシスの役割は、まだ解明されていません。

感染性滑液包疾患(IBD)は、IBDV9によって引き起こされる急性で感染力が強く、免疫抑制性の家禽疾患です。IBDVは、非エンベロープ二分節二本鎖(ds)RNAウイルスで、ビルナウイルス科のアビビルナウイルス属に属します10。他の研究者や当研究室によるこれまでの研究では、IBDV感染は異なる経路11,12,13,14を介して宿主細胞の細胞死を誘導することが分かっています。これまでの知見では、IBDV感染が溶解性細胞死の指標である乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出を引き起こすことが実証されており6,15、IBDV感染が宿主細胞の溶解性細胞死を誘導することが示唆されています。さらに、IBDVに感染した細胞は、原形質膜から大きな気泡が吹き出される細胞腫脹やヨウ化プロピジウム(PI)染色陽性など、ピロトーシス細胞死の形態学的特徴を示すことが示されており、IBDV感染が細胞内のピロトーシスを誘導することを示唆しています。

切断されたGSDMのN末端フラグメント(GSDM-NT)によるピロトーシス細胞の膜孔の形成がピロトーシスの特徴であることを考えると、理論的には、特異的抗体を用いて細胞膜上のGSDM-NTを調べることにより、ピロトーシス細胞をフローサイトメトリーで検出できると考えられます。鳥類のピロトーシス細胞では、ニワトリガスデルミンE(chGSDME-NT)のN末端断片が膜孔を形成し、ヨウ化プロピジウム(PI)がDNAを通過して結合することを可能にします。したがって、ピロトーシス細胞の割合はフローサイトメトリーを用いて検出することができ、それによりピロトーシスを他の形態の細胞死、例えばアポトーシスおよび壊死と区別することができる。しかし、フローサイトメトリーによるピロトーシス細胞の検査法は報告されていません。本研究では、DF-1細胞にIBDVを感染させ、chGSDME-NTフラグメント(膜結合)に対するモノクローナル抗体(MCAB)を用いたピロトーシス細胞の検討とPI染色を行った。驚くべきことに、ピロトーシス細胞はフローサイトメトリーによって効果的に検出されました。さらに、ピロトーシス細胞の割合を定量化することができました。これらの知見は、発熱症を判定するための強力で効果的な手段を提供します。

本稿では、IBDV感染細胞のピロトーシスをフローサイトメトリーにより、抗chGSDME-NT McAbおよびPI染色を用いて検討する方法について述べます。この方法は、他の病原体感染細胞にも拡張でき、ピロトーシスを呈するさまざまな細胞タイプを調べるために適用でき、他の形態の細胞死と区別できます。

プロトコル

本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. サンプル細胞の調製

  1. DF-1(不死身のニワトリ胚線維芽細胞)細胞を6ウェルプレート(ウェルあたり5 x 105 細胞)で培養し、ダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)を添加し、38°Cの5%CO2 インキュベーターで培養します。
  2. 細胞が80%のコンフルエントに達したら、血清含有細胞培養培地を廃棄し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、各ウェルに2 mLの無血清細胞培養培地を添加します。
  3. IBDV ウイルス溶液(計算された MOI を含む)を各ウェルに追加し、ウイルス溶液と等しい量の DMEM を添加して模擬感染コントロールを設定します。
  4. ウイルス吸着の1時間後、培地を廃棄し、PBSで細胞を3回洗浄し、各ウェルに2%FBSを添加したDMEMを2mL加え、細胞培養を24時間継続します。
  5. IBDV 感染の 24 時間後に、トリプシン処理 (ウェルあたり 500 μL) を 1 分間行い、その後、10% FBS (ウェルあたり 2 mL) を添加した DMEM で中和します。その後、細胞を回収して、フローサイトメトリー用の単一細胞懸濁液を調製する必要があります。
  6. 細胞を400 x g で2〜8°Cで5分間遠心分離します。 ピペットを使用して上清を捨てます。
  7. 細胞ペレットをPBSに再懸濁し、チューブを3秒間穏やかにボルテックスします。
  8. ステップ1.6で説明したように細胞を遠心分離します(400 x g 、2〜8°Cで5分間)。
  9. ステップ1.7およびステップ1.8で説明したように、細胞の洗浄を繰り返します。
  10. 顕微鏡下で血球計算盤を使用して細胞カウントを行います。次に、細胞を適切な量のフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁します(最終細胞濃度が1 x 107 細胞/mLになるように)。サスペンションを静かに渦巻きます。

2. フローサイトメトリーのための細胞染色

  1. ステップ1.10のシングルセル懸濁液100μLを5mLの丸底ポリスチレンチューブ(12 mm×75 mm)に加えます。抗chGSDME-NT/CT 抗体染色用の模擬細胞およびIBDV感染細胞を調製し、アイソタイプコントロールとして正常なマウスIgGを使用します。その間、ブランクコントロールとIBDV感染細胞で染色したシングルチューブを調製します。
  2. Alexa Fluor 647標識抗chGSDME-NT McAb、抗chGSDME-CT MCAB、または正常マウスIgG(アイソタイプコントロールとして)のいずれかを、IBDV感染チューブおよび模擬コントロールチューブにそれぞれ1 μg加えます。その後、チューブを3秒間静かにボルテックスします。
  3. 染色した細胞を2〜8°Cで、または氷上で暗所で30分間インキュベートします。10分ごとにチューブを優しくボルテックスします。
  4. 1 mLのフローサイトメトリー染色バッファーで、400 x g 、2-8°C、5分間遠心分離して細胞を洗浄します。 ピペットを使用して上清を捨てます。
  5. ステップ2.4で説明したように、細胞の洗浄を繰り返します。
  6. ペレットを100 μLのフローサイトメトリー染色バッファーに再懸濁します。
  7. IBDV感染群と模擬感染群の細胞、およびPIシングル染色チューブを10 μg/mLのPIで室温で10分間染色し、続いてフローサイトメトリーアッセイ用のフローサイトメトリー染色バッファー400 μLを添加します。

3. フローサイトメトリーアッセイの実施

  1. フローサイトメーターの電源を入れて装置を初期化し、ソフトウェアを起動します。
  2. まず、ブランクコントロールチューブを動かし、次に1本の染色チューブを動かして、フローサイトメーターの電圧と補正パラメータを調整します。635 nm で発光する FL3 および FL4 蛍光チャネルを使用して、PI および Alexa Fluor 647 蛍光色素をそれぞれ検出します。
  3. すべてのパラメーターを構成したら、すべてのサンプルを順番に実行します。

4. フローサイトメトリーデータの解析

  1. FL4チャンネルヒストグラムで各サンプルのAlexa Fluor 647染色を解析します。
  2. 各サンプル中のダブルポジティブセルの割合を評価するには、FL3/FL4の4象限ドットプロットを利用します。
  3. アイソタイプコントロールのIgG/PIデュアル染色サンプルに基づいて陽性の閾値を設定し、ダブルポジティブ細胞の割合が1%未満に保たれるようにします。このアプローチにより、すべてのサンプル中のダブルポジティブ細胞の割合の測定が容易になります。

結果

IBDV感染したDF-1細胞の膜上のchGSDME-NTは、フローサイトメトリーで容易に検出できる
ピロトーシス細胞の最も重要な特徴の一つは、ガスダーミン切断から生成されるGSDM-NTフラグメントによる膜孔の形成です。したがって、ピロトーシス細胞は、特異的抗体を用いて細胞膜上のGSDM-NTを調べることにより、理論的にはフローサイトメトリーによって検出できる可能性があります。したがって、DF-1細胞をIBDVに感染させ、ピロトーシス細胞をAlexa Fluor 647標識抗chGSDME-NT MCABおよびPI染色を用いたフローサイトメトリーで調べました。IBDV感染後に、かなりの数のchGSDME-NT陽性細胞がフローサイトメトリーによって検出されました(図1)。対照的に、模擬感染コントロールまたはアイソタイプコントロールIgGで染色された細胞は、最小限のAlexa Fluor 647陽性細胞を示しました。これらの知見は、フローサイトメトリーによる膜結合chGSDME-NTの効果的かつ特異的な検出を示しています。注目すべきは、切断されたchGSDMEのC末端断片(chGSDME-CT)がchGSDME-NTのように細胞膜に移されるのではなく、細胞質内に保持されていたため、膜表面抗原染色を用いたフローサイトメトリーではchGSDME-CT断片はほとんど検出できず、これはピロトーシスが膜結合性chGSDME-NT断片と関連しているという事実と一致していました。

DF-1細胞のピロトーシスは、フルオレセイン標識抗chGSDME-NT MCABおよびPIを用いた細胞の二重染色を用いたフローサイトメトリーにより測定できます
Alexa Fluor 647標識抗chGSDME-NT MCABおよびPIで細胞を二重染色した後、FL3およびFL4蛍光チャネルでフローサイトメトリー解析を行ったところ、chGSDME-NTおよびPI染色が陽性であることでピロトーシス細胞を測定できました。図2A,Bに示すように、フローサイトメトリーアッセイでは、IBDV感染のchGSDME-NT陽性細胞が相当数検出され、IBDV感染細胞におけるchGSDME-NT/PIダブル陽性細胞の割合(約33%)は模擬感染対照群(P < 0.001)よりも有意に高かったことから、chGSDME-NTによる膜細孔の形成が示唆された細胞膜の破壊と同期していたため、これらのIBDV感染細胞はピロトーシス細胞死を起こしました。これらのデータは、IBDV感染が宿主細胞にchGSDME媒介性ピロトーシスを誘導することを明確に示しています。一方、PI単一陽性細胞は、IBDV感染によって誘発される他の形態の細胞死を表している可能性があります。したがって、フローサイトメトリーによる細孔形成chGSDME-NTの試験は、ピロトーシス細胞を他の形態の細胞死を受けた細胞と区別するための貴重な方法を提供します。

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図1:フローサイトメトリーによるchGSDME-NT結合細胞の検査。 DF-1細胞を模擬感染させたか、MOI1でIBDVに感染させた。感染から24時間後に細胞を回収し、Alexa Fluor 647標識抗chGSDME-NT/抗chGSDME-CT McAbまたはアイソタイプコントロールIgGで染色し、フローサイトメトリーで解析しました。フローサイトメトリーアッセイで陽性のchGSDME-NT染色は、IBDV誘発性ピロトーシスを伴う膜結合chGSDME-NT細胞を示しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:chGSDME-NTとPIのデュアル染色を用いたフローサイトメトリーによるピロトーシスの検討。 (A)フローサイトメトリーによるピロトーシス細胞のドットプロット解析。DF-1細胞は、MOI1でIBDVに感染しました。感染から24時間後に細胞を回収し、Alexa Fluor 647標識抗chGSDME-NT/抗chGSDME-CT MCABおよびPIで染色し、フローサイトメトリーで解析しました。(B)(A)の各群におけるピロトーシス細胞の割合をプロットし、統計解析した。統計的有意性を分析するために、二元配置分散分析が使用されました。このデータは3つの独立した実験を表しており、SD±平均値として提示されました<。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この記事では、Alexa Fluor 647 標識抗 chGSDME-NT MCAB と PI による感染細胞の二重染色により、フローサイトメトリーを使用してピロトーシスを調べる効果的な方法について説明します。このアプローチは、ピロトーシスをアポトーシスや壊死などの他のタイプの細胞死と区別するために、さまざまな細胞タイプにも適用できます。

ピロトーシスは、哺乳類1,2,3におけるガスデルミン(GSDM)D誘導性原形質膜細孔形成に主に依存する炎症性プログラム細胞死の一種であり、従来、LDH放出6,15、形態学的特徴16、ウェスタンブロットまたはIFAアッセイ17によるGSDM-NT/GSDM-CTフラグメントの検出などの方法によって評価されてきました.しかし、これらの方法のいずれも、ピロトーシス細胞の割合を正確に定量化することはできません。この研究では、GSDM-NTフラグメントによって形成されたピロトーシス細胞の特徴的な原形質膜細孔を利用して、それらの決定のためのフローサイトメトリーベースの戦略を開発します。

細胞をchGSDME-NT-Alexa Fluor 647とPIで二重染色し、続いてFL3およびFL4蛍光チャネルのフローサイトメトリーで解析したところ、切断されたchGSDMEのN末端フラグメントによる原形質膜細孔形成を示すchGSDME-NT-Alexa Fluor 647染色と、原形質膜破裂を示すPI染色の2つのパラメーターでピロトーシスが同時に観察されました。このデータは、IBDV感染細胞におけるchGSDME-NT/PI二重陽性細胞の割合(約33%)が、模擬感染対照群(P < 0.001)よりも有意に高かったことを示しています。

この実験方法では、精度と信頼性を確保するためにいくつかの考慮事項が必要です。まず、フロー分析に使用される各サンプルチューブには、フロー分析の精度を維持するために、1 x 106 セル以上が含まれている必要があります。プロトコールにおける複数の洗浄ステップを考慮すると、ステップ2.1の各チューブ内の細胞の初期数を、例えば、2×106 細胞にそれに応じて増加させることが望ましい。細胞の洗浄と移し替えは、細胞の完全性が意図せずに損なわれないように、細心の注意を払って取り扱うことが重要です。さらに、細胞密度、抗体濃度、および操作の期間はすべて、最適なパラメーター設定に影響を与える可能性があることに注意してください。そのため、フローサイトメーターのパラメータや設定は、特定の実験条件に基づいて調整する必要があります。この研究では、FSC AmpGainを1.40に、SSC電圧を490Vに設定したパラメータを使用しました。FSC/SSCプロットのゲートは、その後のFL3/4チャネル解析のために、すべての細胞集団をカバーするように設定されました。蛍光電圧は、FL3チャンネル(PI)で600V、FL4チャンネル(Alexa Fluor 647)で600Vに設定しました。補正は、FL4チャネルとFL3チャネル間で38.0%に設定しました。流量は 200 イベント/秒に設定され、イベントしきい値は 10,000 に設定されました。

新しいアプローチに支えられて、ニワトリの病原性感染に対する宿主応答におけるGSDME媒介性ピロトーシスの役割とその根底にあるメカニズムのこの理解は大幅に進歩しました。特異的抗体を用いることで、フローサイトメトリーによる細孔形成chGSDME-NTの検討が可能となり、ピロトーシス細胞と他の細胞を区別し、ピロトーシスを起こした細胞の割合を決定することに成功しました。その結果、この方法は、ピロトーシス細胞の検出において、ウェスタンブロットまたはIFAアッセイよりも明確な利点を提供します。

しかし、このプロトコルの限界は、IBDV感染細胞におけるニワトリGSDMEのN末端フラグメントをピロトーシスを研究するための実験モデルとして使用することにあります。それにもかかわらず、この研究は、ピロトーシスを決定するためのフローサイトメトリーの最初の成功した利用を示しています。

要約すると、ピロトーシスを調べるためにここで説明するフローサイトメトリー法は、哺乳類と鳥類の両方におけるピロトーシスの背後にあるメカニズムの理解を深める大きな可能性を秘めています。この手法は、生命科学における細胞死研究に貢献する有効なツールとして位置付けられています。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

ジュエ・リュウ博士のご協力に感謝いたします。本研究は、中国国家重点研究開発プログラム(No.2022YFD1800300)、中国国家自然科学基金会(No.32130105)、現代農工業技術研究システム予算基金(No.CARS-40)、中国。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5 mL 丸底ポリスチレンチューブ (12 回; 75 mm)Corning Falcon352052
6 Well Cell Culture PlateCorning3516
Alexa Fluor 647 抗体ラベリングキットThermo Fisher ScientificA20186
Anti-chGSDME-CT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)EU0228
Anti-chGSDME-NT MCABSAE Biomedical Tech Company (中国、中山市)EU0227
CellQuest softwareBD Biosciences
CO2 incubatorThermo Fisher Scientific3100
Cryogenic Freezing CentrifugeEppendorf5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco by Life TechnologiesC11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF0193-500ML
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCalibur
Flow Cytometry Staining BufferThermo Fisher Scientific00-4222-26
血球計算盤Qiu-jing Biochemical Reagent &Instrument Company (Shanghai, China)YX-JSB52
IBDV Lx strainIBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China
倒立顕微鏡重慶光電機器会社XDS-1B
Normal Mouse IgGSanta Cruz Biotechnologysc-2025
Phosphate Buffer Saline (PBS)エム&C 遺伝子テクノロジーCC017
ウ化プロピジウム(PI)Sigma-AldrichP4170
トリプシンEDTA、0.25%M&C ジーンテクノロジーCC008
ボルテックスオシレーターMIULABMIX-28+
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参考文献

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