方法論記事

原子間力顕微鏡を用いた剛性測定のためのマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの単離

DOI：

10.3791/66922

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2024年7月12日

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1Department of Ophthalmology, University of California, Los Angeles, 2Doheny Eye Institute, 3Molecular, Cellular, and Integrative Physiology Interdepartmental PhD Program, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは最近、糖尿病に関連する網膜機能障害の新しいパラダイムとして網膜毛細血管硬化を特定しました。このプロトコルでは、網膜内皮培養物からマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスを単離する手順を詳しく説明し、続いて原子間力顕微鏡を用いた剛性測定技術について説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

網膜毛細血管変性症は、糖尿病性網膜症 (DR) の初期段階の臨床的特徴です。私たちの最近の研究では、糖尿病誘発性網膜毛細血管硬化が、炎症媒介性網膜毛細血管の変性において、これまで認識されていなかった重要な因果関係を果たしていることが明らかになりました。網膜毛細血管の硬直の増加は、内皮下マトリックスを架橋して硬化させる酵素であるリシルオキシダーゼの過剰発現に起因します。DRを早期に解決することで、DRの進行やそれに伴う視力低下の予防や遅延が期待されるため、内皮下マトリックスや毛細血管の硬直は、早期のDR管理に適切で新しい治療標的となります。さらに、網膜毛細血管の硬さを直接測定することは、動物およびヒトの被験者における網膜毛細血管の硬直を非侵襲的に評価するための新しいイメージング技術を開発するための重要な前臨床検証ステップとして役立ちます。この見解を念頭に置いて、ここでは、原子間力顕微鏡を使用したマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの単離および剛性測定のための詳細なプロトコルを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

網膜毛細血管は、網膜の恒常性と視覚機能を維持するために不可欠です。実際、初期の糖尿病における彼らの変性は、糖尿病患者の全個人のほぼ40%が罹患している微小血管疾患である糖尿病性網膜症(DR)の視力を脅かす合併症の発症に強く関与しています1。過去の研究では、糖尿病誘発性網膜血管炎症における異常な分子的および生化学的手がかりに重要な役割があることが実証されています2,3。しかし、最近の研究では、網膜毛細血管硬化が網膜血管の炎症と変性の決定要因でありながらこれまで認識されていなかった重要であると特定するDR病因の新しいパラダイムが導入されました4,5,6。

具体的には、糖尿病による網膜毛細血管硬化の増加は、網膜内皮細胞(EC)におけるコラーゲン架橋酵素リシルオキシダーゼ(LOX)のアップレギュレーションによって引き起こされ、それが内皮下マトリックス(基底膜)を硬化させます4,5,6。マトリックスの硬化は、次に、その上にある網膜ECを硬化させ(機械的相互性による)、したがって、網膜毛細血管の剛性4の全体的な増加をもたらす。重要なことは、この糖尿病誘発性網膜毛細血管硬化だけで、網膜ECの活性化と炎症媒介性EC死を促進することができるということです。この網膜EC欠損の機械的調節は、内皮メカノトランスダクションの変化、すなわち機械的な手がかりが生化学的シグナルに変換されて生物学的応答を生じさせるプロセスに起因する可能性がある7,8,9。重要なことに、ECの機械的手がかりの変化と内皮下マトリックス構造の変化は、早期の加齢性黄斑変性症(AMD)に関連する脈絡膜血管変性にも関与しており10,11,12、これは、変性網膜疾患における血管メカノバイオロジーのより広範な意味を証明しています。

特に、網膜毛細血管硬化は糖尿病の早期に起こり、これは網膜炎症の発症と一致します。したがって、網膜毛細血管の硬直の増加は、DRの治療標的および早期診断マーカーの両方として機能する可能性があります。この目的のためには、網膜毛細血管と内皮下マトリックスの信頼性の高い直接的な剛性測定を得ることが重要です。これは、細胞、細胞外マトリックス、および組織の剛性を直接測定するための、ユニークで高感度、正確、かつ信頼性の高い技術を提供する原子間力顕微鏡(AFM)を使用することによって達成することができる13。AFMは、サンプルに微小(ナノニュートンレベル)のインデンテーション力を加え、その剛性によってインデントAFMカンチレバーの曲がり具合が決まります。サンプルが硬いほど、カンチレバーは曲がり、その逆も同様です。私たちは、培養内皮細胞、内皮下マトリックス、および単離されたマウス網膜毛細血管4,5,6,11,12の剛性を測定するために、AFMを広く使用してきました。これらのAFM剛性測定は、DRおよびAMDの病因の主要な決定要因として内皮メカノバイオロジーを特定するのに役立ちました。視覚研究におけるメカノバイオロジーの範囲を広げるために、ここでは、単離されたマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの剛性測定にAFMを使用するためのステップバイステップのガイドを提供します。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物処置は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明に従って実施され、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の動物およびケア委員会(IACUC;プロトコル番号ARC-2020-030)(OLAW機関動物福祉保証番号A3196-01)によって承認されました。以下のプロトコルは、体重が ~25 g (糖尿病マウス) および ~32 g (非糖尿病マウス;ジャクソン研究所)。

1. AFM剛性測定のためのマウス網膜毛細血管の単離(1-4日目)

注:このプロトコルは、最近の研究4で報告され、マウスの眼の摘出術と軽度の固定、網膜の分離、トリプシン消化、およびその後のAFM剛性測定のための顕微鏡スライド上の結果として生じる網膜血管系の取り付けについて詳しく説明します。

  1. 摘出術と軽度の固定(1日目)
    1. マウスを二酸化炭素曝露とそれに続く頸部脱臼で安楽死させた後、眼球の後ろに微小鉗子を挿入し、筋肉の付着部をつかみ、視神経を切断する可能性のある微小鉗子を強くつまむことなく慎重に眼を引き出します。
    2. 除核した眼をPBS中の5%(v / v)ホルマリンに4°Cで24時間置き、軽度の固定を行います。.
      注:経験4に基づくと、固定されていない、またはより穏やかに固定された目は、AFMサンプルの準備と剛性測定中に断片化する壊れやすい毛細血管を生成します。
  2. 網膜分離(2日目)
    1. 固定された目をパラフィン紙の上に置きます 解剖顕微鏡下。次に、マイクロ鉗子を用いて、後眼の外側に付着した筋肉と視神経の残骸を持ち、角膜が片側を向くように眼を向けます(図1)。
    2. 外科用ブレードを使用して、輪部(角膜-強膜接合部)の後ろに平行に1〜2 mm切開します。次に、マイクロ鉗子で目を固定しながら、ブレードで下向きの力を加え、目の前部が後端から完全に分離するまで押し続けます(図1)。前眼部とレンズを捨てます。網膜の損傷を引き起こす可能性があるため、前後に見ないでください。
    3. 後部セグメント(強膜、脈絡膜、網膜)をPBS(pH 7.4)で満たされた6cmの皿に移します。
    4. マイクロスパチュラを使用し、同時にマイクロ鉗子で視神経を優しく保持し、網膜をすくい取ります。網膜をPBSを含む2mLの微量遠心チューブに4°Cで保存し、毛細血管が分離されるまで保存します。
       
  3. レチナールリンス
    1. 1つの網膜をすすぐには、12ウェルプレートの6ウェルに1 mLの再蒸留H2O(ddH2O)を充填します。次に、倒立パスツールピペットを使用して、2 mLの微量遠心チューブから網膜を最初のウェルに移します。
    2. 眼窩シェーカーで網膜を120 RPMで室温(RT)で30分間すすぎます。
    3. P1000ピペットを使用して、網膜に隣接して水を慎重に上下にピペットで動かし、網膜に水を吹き付けて穏やかに攪拌します。
    4. 倒立ガラスピペットを使用して、網膜を2番目のウェルに移し、ステップ1.3.2と1.3.3を4回繰り返し、各すすぎは新しい(ddH2Oを含む)ウェルで行われます。
    5. 最後に、網膜を6番目のウェルに移し、100RPMに設定されたオービタルシェーカーのRTで一晩(O / N)すすぎ、トリプシン消化中の血管からの網膜神経膠細胞の分離を促進します。
  4. レチナールトリプシン消化(3日目)
    1. トリプシン 1:250 粉末をトリス緩衝液 (pH 8; 0.1 M) に溶解して、10% (w/v) トリプシン溶液を調製します。円錐管を数回反転させて穏やかに混合し、トリプシンの溶解性を確認するのを難しくする気泡の形成を最小限に抑えます。
    2. 10%トリプシン溶液を37°Cの水浴中で10〜15分間平衡化します。トリプシン粉末が完全に溶解したら、0.2μmシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。
    3. 12ウェルプレートに、ろ過した10%トリプシン溶液の2 mL/ウェル/網膜を加えます。隣接するウェルにトリプシン溶液を追加します(後続のステップのためにガラスピペットの壁を平衡化するため)。
    4. 6ウェルプレートの3つのウェルに3mLのddH2Oを添加します(これらの3つのウェルを1つの網膜専用にします)。
    5. 15 mLのコニカルチューブにP200チップを挿入してから、ろ過した10%トリプシン溶液を4 mL加えます。この円錐管を37°C浴に移し、先端をトリプシンに2〜3分間浸すと、後のステップで網膜が先端壁にくっつくのを防ぐことができます。
    6. 網膜のO / Nすすぎ(ステップ1.3.5から)後、P1000ピペットを使用して、網膜に隣接する水を慎重に上下にピペットで動かし、網膜に水を噴射して穏やかに攪拌します。
    7. 倒立ガラスピペットを使用して、すすぎた網膜を12ウェルプレートのトリプシン含有ウェルに移します(ステップ1.4.3から)。トリプシン溶液が大幅に希釈されないように、網膜が最小限の残留ddH2Oで転写されていることを確認してください。37°Cで3時間インキュベートします。
    8. トリプシンに浸したP200チップ(ステップ1.4.5から)を視神経領域の中央に置き、血管ネットワーク全体を上下に静かにピペットで動かして、非血管組織14を解離させる。
    9. トリプシンで事前にすすいだ倒立ガラスピペットを使用して(トリプシンを5回上下にピペッティング)、網膜血管系を6ウェルプレートの最初のddH2O含有ウェルに移します(ステップ1.4.4から)。
    10. プレートを回転させ、逆トリプシンすすぎガラスピペットを使用して血管系を上下にピペットで動かし、残留した非血管組織を除去します。
    11. ガラスピペットを使用して、網膜血管系を6ウェルプレートの2番目のddH2O含有ウェルに移し、AFM剛性測定のためにスライドに取り付けるまで4°Cで保存します。
      注:水和網膜血管系(PBS中)は、4°Cで最大2週間構造的に無傷です。ただし、定期的な剛性測定は、新たに分離された毛細血管から行う必要があります。
  5. AFM剛性測定のための網膜血管系の装着(4日目)
    1. 倒立トリプシン洗浄ガラスピペットを使用して、網膜血管系を6ウェルプレートの3番目のddH2O含有ウェルに移し、残留トリプシン溶液を除去します。
    2. AFM剛性測定のための血管ネットワークの取り付けに使用する帯電表面顕微鏡スライドを(ddH2Oとワイパー組織を使用して)完全に洗浄します。
      注:スライドの帯電した表面は、AFM測定中に血管ネットワークに強力な結合を提供します。
    3. スライドにラベルを付け、疎水性ペンで中心の周りに4〜5 cmの円形の領域を描き、後続のステップで水がこぼれないようにします。
    4. 逆トリプシンすすぎガラスピペットを使用して、網膜血管系をマークされた領域の中心に慎重に移します。
    5. P200ピペットを使用して、誤って血管系を先端に吸引しないように、片方の端からできるだけ多くの余分な水分を慎重に取り除きます。
    6. スライドを前面(ろ過されたメッシュ)に近いバイオセーフティキャビネット(BSL-2フード)に置き、残留水を蒸発させます。
    7. 血管系がほぼ乾いたら、位相差顕微鏡(4倍倍)で、P200ピペットでddH2Oをマークされた領域の片側にゆっくりと追加することにより、血管系を慎重に再水和します。ddH2Oを血管系に直接加えると、血管系が剥離します。
    8. 再水和した血管系の位相コントラスト画像を4倍および20倍の倍率で撮影し、構造的完全性が良好で、信頼性の高いAFM剛性測定に不可欠な基準であるスライドガラスに適切に広がっている(それ自体が折りたたまれていない)ことを確認します。

2. 網膜微小血管内皮細胞(REC)培養物からの内皮下マトリックスの取得(1-17日目)

注:このプロトコルは、Beachamらから適応されています。図15および最近の研究で報告された4,5,6は、改質ガラスカバースリップ上でのREC培養、続いて脱細胞化してその後のAFM剛性測定のための内皮下マトリックスを得ることを説明している。

  1. ゼラチンコーティングされたガラスカバースリップとセルプレーティングの調製(1日目)
    注:ゼラチンコーティングとその後のPBS ++すすぎステップを組織培養フードで実行してから、その後のグルタルアルデヒドとエタノールアミンの処理ステップのために化学ヒュームフードに移動します。
    1. 滅菌24ウェルプレートのウェルごとにオートクレーブ処理した直径12 mmの円形ガラスカバースリップを1枚置き、予熱した滅菌0.2%(w / v)ゼラチン(カルシウムとマグネシウムを含むPBSで希釈)500μLを追加します。PBS++)をカバースリップを含む各ウェルに貼り付けます。37°Cで1時間インキュベートします。
    2. ゼラチン溶液を吸引し、滅菌PBS++でカバーガラスを一度すすぎ、RTで500μLの1%(v / v)グルタルアルデヒドを30分間加えてコーティングされたゼラチンを架橋します。
    3. RTで100 RPMのオービタルシェーカーでPBS ++ でカバーガラスを5分間すすぐ前に、グルタルアルデヒド溶液を収集し、適切に廃棄します(機関のガイドラインに従って)。 このすすぎステップを5回繰り返します。最初の3回のすすぎでは、滅菌ピンセットを使用してカバーガラスを持ち上げ、グルタルアルデヒドを完全にすすぎます。残留量があると、細胞の生存率が低下する可能性があります。
    4. ゼラチン架橋カバースリップに800 μLの1 Mエタノールアミンを室温で30分間加え、ウェルに残っている微量のグルタルアルデヒドをクエンチします。
    5. エタノールアミン溶液を収集して(機関のガイドラインに従って)適切に廃棄し、RTで100rpmのオービタルシェーカーでPBS ++ で5分間カバーガラスを5回すすぎます。最初の3回のすすぎでは、滅菌ピンセットを使用してカバーガラスを持ち上げ、エタノールアミンを完全にすすぎます。.残留量があると、細胞の生存率が低下する可能性があります。
    6. 架橋されたカバースリップは、セルめっきの準備が整いました。
      注:カバースリップ調製直後に細胞をプレート化することは一般的ですが、PBS++ に4°Cで1〜2日間保存した架橋ゼラチンカバースリップの細胞プレーティングを比較する価値があるかもしれません。
    7. 組織培養フード内の無菌条件下で、500 μLの培地/ウェルで網膜微小血管内皮細胞(REC)を、位相差顕微鏡で確認されたように、24時間以内に100%のコンフルエンスを達成する密度でプレート化します。
      注:結果として生じるREC静止により、細胞がマトリックスを分泌する能力が増加するため、24時間以内にコンフルエンスに到達することが重要です(次のステップを参照)。ヒトRECでの経験では、4 x 104 細胞/cm2 のめっき密度は、24時間以内にコンフルエンスに達するのに十分です。ただし、RECサイズは種によって異なるため(たとえば、マウスRECは大幅に小さい)、初期めっき密度を最適化する必要がある場合があります。
  2. REC培養による内皮下マトリックス作製(2-16日目)
    1. 細胞がコンフルエンスに達した後(~24時間)、培地を滅菌ろ過されたアスコルビン酸(最終濃度200 μg/mL)を添加した新鮮な培地と交換します。
      注:病気の危険因子(例:.、高グルコース、進行糖化最終産物など)または薬理学的薬剤によるREC治療は、アスコルビン酸治療とともに今すぐ開始できます。.
    2. アスコルビン酸を添加した培地を15日間、1日おきに交換してください。
      注:アスコルビン酸は溶液中で不安定です。中程度のサプリメントのために、1日おきに新鮮な100倍ストック溶液を準備します。
  3. 内皮下マトリックスを得るためのREC培養物の脱細胞化(16日目)
    1. アスコルビン酸治療を15日間行った後、培地を取り出し、カルシウム/マグネシウムを含まないPBSで細胞をすすぎます。
    2. 温かい脱細胞化バッファー(20 mM水酸化アンモニウムと0.5% Triton X-100 in PBS)をウェルあたり250 μL/ウェルで2~3分間添加して、REC培養物を脱細胞化します。位相差顕微鏡(倍率10倍)で細胞の除去を確認します。
    3. REC分泌内皮下マトリックスを乱さずに脱細胞化バッファーを穏やかに除去し、各ウェルに0.5mLのPBSを添加します。
      注:このすすぎステップとその後のすすぎステップで内皮下マトリックスが剥がれないようにするには、P1000ピペットでのみ穏やかなすすぎを行ってください。.真空吸引は行わないでください。
    4. プレートを4°Cで一晩保存し、REC分泌マトリックスを安定させます。
  4. 細胞破片を除去するための内皮下マトリックスのDNase処理(17日目)
    1. ステップ 2.3.4 の内皮下マトリックスを 800 μL の PBS/ウェルですすぎます。
    2. PBSを静かに除去し、マトリックスを200 μLのRNaseフリーDNase I(30 Kユニット)と37°Cで30分間インキュベートして、細胞の破片の痕跡をすべて除去します。DNase処理の効率を確認するには、位相差顕微鏡で細胞の破片を注意深く探します。
    3. DNase I溶液を静かに除去し、800 μLのPBS/wellで内皮下マトリックスを2回すすぎます。
    4. マクロスケールの線維性内皮下マトリックスが位相差顕微鏡(10倍倍)で見えることを確認します。より微細なナノスケールのマトリックスファイバーを可視化するには、AFMトポグラフィースキャンまたは免疫標識マトリックスタンパク質の100倍倍率での高分解能共焦点イメージングが必要です。
    5. AFM剛性測定には、新鮮な(固定されていない)内皮下マトリックスをすぐに使用してください。
    6. AFM測定後、マトリックスサンプルを1%(v / v)パラホルムアルデヒドで固定し(室温で15分間)、4°Cで保存して、内皮下マトリックスタンパク質および/または架橋酵素に対する抗体による免疫標識を行います。

3. AFM剛性測定

注:このプロトコルは、標準的なAFMユーザーマニュアルから採用され、最近の研究4,5で報告されており、AFMおよびデータ分析ソフトウェアを使用して、網膜毛細血管および内皮下マトリックスからの剛性データの取得と分析を詳しく説明しています。以下に概説する手順は、特定のAFMモデルに基づいていますが(資料の表を参照)、基本原理は一般的にすべてのAFMモデルに適用できます。

  1. カンチレバープローブの選択
    注:柔らかい生物学的サンプルには、サンプルの寸法に合わせてプローブの寸法が選択されている間、サンプルのくぼみで曲がる可能性のある柔らかいカンチレバーが必要です。
    1. 直径5〜8μmのマウス網膜血管の剛性測定には、スプリング定数(k)が0.2〜0.3N / mの半径1μmのカンチレバープローブを使用します。ナノスケールの繊維で構成された内皮下マトリックスの剛性測定には、ばね定数(k)が0.06-0.1 N / mの半径70 nmのカンチレバープローブを使用します。
  2. カンチレバー取り付け
    1. AFMコンピュータで、AFMユニットを制御するソフトウェアと、カンチレバーとサンプルを視覚化するために使用される位相差顕微鏡に取り付けられたカメラを開きます。
    2. カンチレバーホルダーをカンチレバー交換スタンドに固定し、カンチレバーを物理的に損傷することなく、ステレオスコープの下で時計メーカーの鉗子を使用して選択したカンチレバーをホルダーに取り付けます。ホルダーのネジを締めて、カンチレバーを固定します。
    3. スタンドに置かれているAFMヘッドにカンチレバーホルダーを置き、ロックします。
    4. AFMソフトウェアのステップモーター機能を使用して、AFMヘッドを最高点まで引き出し、その位置をソフトウェアでポイントゼロに設定します。このステップにより、AFMヘッドの取り付け中にAFMカンチレバーが誤ってサンプルステージにぶつかるのを防ぎます(次のステップ)。
    5. AFMヘッドをスタンドから慎重に持ち上げ、脚をそれぞれのスロットに配置してAFMサンプルステージに取り付けます。
  3. レーザーアライメント
    注:最初のレーザーアライメントは、カンチレバー先端上のレーザービームのより正確なアライメントを保証するため、サンプルなしで(つまり、エアモードで)実行されます(液体中のレーザー屈折を防ぐことにより)。ただし、生体サンプルは空気とは異なる屈折率を持つ媒体に浸漬されるため、剛性測定の前にレーザーを媒体内で再調整することが重要です。
    1. 空中でのレーザーアライメントを行うには、AFMヘッドをサンプルステージに置き、10倍対物レンズと付属のカメラを使用して、ライブモードでモニター上のカンチレバーを視覚化します。赤外線レーザーはユーザーの視界から隠されていますが、CCDカメラで見ることができます。
    2. ソフトウェアで接触モード力分光法機能を選択し、レーザーアライメントというタイトルのウィンドウを開きます。
    3. AFMヘッドのレーザー横方向にマークされた2本のネジを使用して、レーザーアライメントウィンドウのSUM値が最大になるようにレーザービームをカンチレバーに集束させます。これを実現するには、カンチレバーの中心またはその周囲にレーザーを集束させます。
    4. 検出器調整ネジを使用して、レーザースポットがレーザーアライメントウィンドウの中心に来るように光検出器を調整します。
    5. ミラー調整ネジを使用して、ミラーを調整し、SUM値が可能な限り高い値になるようにします。
      注:SUM値が高いと、サンプルの剛性を高感度かつ正確に評価できます。したがって、レーザーアライメントとミラー調整の両方のステップを実行して、最高のSUM値を取得する必要があります。
    6. 次に、液体中でのレーザーアライメントのために、サンプルのインデント中に測定アーチファクトを引き起こす振動やドリフトを防ぐために、必要な培地をディッシュに入れ、ステージにしっかりと取り付けます。
    7. カンチレバーにピントを合わせたライブカメラ映像を見ながら、ステップモーター機能を使って液中に沈めます。
    8. 手順3.3.4と3.3.5を繰り返して、SUM値が最大に保たれ、レーザースポットがレーザーアライメントウィンドウの中心にあることを確認します。
  4. カンチレバースプリング定数の校正
    注:カンチレバープローブにはメーカーが校正したスプリング定数(k)が付属していますが、測定を開始する前にその値(液体中)を個別に確認することをお勧めします。カンチレバープローブとガラス表面との間の相互作用を最小限に抑える清潔なガラス表面を使用してください。
    1. カンチレバーによって加えられる設定点の力は、力のインデントに許容されるカンチレバーからの最大レーザーたわみを設定します。最初は 1.5 V に設定します。カンチレバーがこの特定の設定値力で接近できない場合は、サンプルがインデントして力のインデント曲線が生成されるまで、カンチレバーを段階的に増やします。
    2. Z長さは、サンプルのインデンテーション中にカンチレバーが設定値に達した後にZピエゾが引き抜かれる最大距離を示します。Zの長さは、少なくともカンチレバープローブがサンプルからきれいに分離するのに十分な長さである必要があります。ガラス表面のばね定数を校正するには、Z長さを1 μmに設定します。
    3. Z速度とは、力の押し込み中にZピエゾがカンチレバーをサンプルに向かって垂直に下降させる速度を指します。非常に低速は主にサンプルの粘性挙動を捕捉し、非常に高速は主に弾性挙動を捕捉するため、最適化する必要があります。最適な速度は、生物学的サンプルの真の粘弾性特性を捉えることが期待されます。粘弾性生体サンプルのZ速度を2μm/sに設定します。
    4. Z範囲のターゲット高さは、力曲線を測定した後、サンプル上の別の場所に移動する前に、Zピエゾが静止するサンプルからのおおよその距離を示します。Z 範囲のターゲット高さは、サンプル フィーチャの高さよりも大きくする必要があります。Zレンジの目標高さを7.5μmに設定します。
    5. ステップモーター機能を使用して、カンチレバーをサンプル表面にかなり近づけてから(10倍率の位相差画像の焦点から判断)、接触モード力分光ウィンドウでアプローチ機能を選択してカンチレバーを15 μmの小さな増分で下げます。
    6. Acquireをクリックして、フォースカーブをキャプチャします。
    7. フォースカーブを選択してキャリブレーションマネージャーウィンドウで開き、メソッドセクションで接触ベースのモードを選択します。
    8. Select-fit Range 関数を使用して、線形カーブ フィットのカンチレバー リトラクション カーブを選択します。次に、 感度 チェックボックスを使用して、力の単位をVからNに変換します。
    9. 液体中でカンチレバーを100〜200μm持ち上げ、 サーマルノイズ 機能を選択します。再度、[ Select Fit Range] を使用して、熱雑音ベル曲線をローレンツ曲線にフィットさせます。カーブフィット後、 スプリング定数(k) ボックスを選択します。ばね定数(k)がメーカーの値に近いことを確認し、後で参照できるようにメモしておきます。キャリブレーション後、設定値の単位はmVからnNに変わります。
      注:熱雑音は、特定の温度でのカンチレバーの固有振動数です。正確なばね定数測定には、熱雑音の補正が必要です。
  5. 力-距離曲線の取得
    1. スライドマウントしたサンプル(網膜血管または内皮下マトリックス)をAFMステージに置き、ソフトウェアの実験セクションで Contact Mode Force Spectroscopy を選択します。
    2. 設定値力を 0.5 nN に設定し、[ アプローチ]をクリックします。これは、SAA-SPH 1 μm および PFQNM-LC-A 70 nm カンチレバープローブの熱たわみよりも大幅に高く、サンプルへのスムーズなカンチレバーアプローチを実現します。
    3. カンチレバーが表面を検出し、静止目標の高さに戻ったら、より硬い SAA-SPH 1 μm カンチレバープローブの場合は 0.2 nN に、より柔らかい PFQNM-LC-A 70 nm カンチレバープローブの場合は 0.1 nN に設定します。このセットポイント調整により、サンプルのインデント中に硬いカンチレバーと柔らかいカンチレバーの両方が容易に曲がるようになります(セクション3.1を参照)。
    4. Z Lengthを~2.5 μmに設定して、リトラクション中(ステップ3.4.2を参照)、Z速度を2 μm/s(ステップ3.4.3を参照)でカンチレバープローブを生物学的サンプルからきれいに分離します。
    5. AFMステージのステージネジを使用して、カンチレバープローブをサンプル上の目的の場所に慎重に配置します。
      注:キャピラリーは常にスライド上に平らに広がるとは限らないため、ステージを移動する前に、カンチレバーを静止目標高さからさらに10〜20μm引き出すのが安全です。
    6. 「アプローチ」をクリックして、まずカンチレバーをサンプルに近づけてから、「取得」をクリックして、目的の位置の力曲線をキャプチャーします。解析のためにすべてのフォースカーブを保存します。
  6. データ分析
    1. データ処理ソフトウェアで力曲線を開きます。
    2. データ分析のために Retraction Force Curve を選択します(手順3.4.8と同様)。
    3. データ平滑化機能を使用して、ガウスフィルターで力曲線を平滑化し、取得したデータの不要なノイズを除去します。
    4. 基線減算機能を使用して、力曲線の(非接触)基線部分の傾きと大きさの値をゼロに調整します。
    5. Contact Point機能をクリックすると、フォースカーブの接触点がX軸とY軸の(0,0)座標に自動的に移動します。
    6. Vertical Tip Position関数を使用して、サンプルのくぼみを補正することにより、Y軸上のカンチレバーの実際の垂直位置を計算します。
    7. 処理されたフォースカーブに、最初に先端の形状と半径(選択したカンチレバープローブに基づく)を選択して 弾性フィット 機能を適用し、次にヘルツ/スネドンモデルを使用してフォースカーブフィッティングを適用します。
      1. 半径70 nmのプローブによるマトリックスのくぼみが70 nmを超える場合(通常はこれにあたります)、 パラボロイド 先端の形状を選択します。キャピラリー剛性の測定では、半径1 μmのプローブによるサンプルのくぼみが1 μmを超えないようにするため、 球 体先端形状を選択します。さらに、フィット曲線の接触点が実際の収縮曲線の接触点と一致しない場合は、 シフト曲線 チェックボックスを選択します。
    8. ヤング率(剛性)の値をメモして保存します。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マウス網膜毛細血管
孤立した網膜毛細血管のAFM剛性測定には、その機構的完全性を損なう可能性のあるサンプルの取り扱い手順が含まれます。これを防ぎ、AFM測定の実現可能性、信頼性、再現性を確保するために、除核眼を5%ホルマリンに4°Cで一晩固定してから、血管を分離します。ホルマリン濃度の低下、固定温度の低下、固定時間の制限、角膜穿刺の欠如を伴うこの穏やかな固定プロトコルは、化学的固定によって引き起こされる潜在的な架橋/硬化アーティファクトを最小限に抑えるために開発されました。図2B、Cに示すように、この比較的穏やかな固定により、孤立した網膜血管系が構造的に堅牢で、AFM測定に十分な耐久性を持つことができます。対照的に、固定されていない眼から分離された網膜血管(低張法を使用)4または短時間固定された眼(8時間)は断片化または崩壊するため、AFM測定には適しなくなります(図2B)。

網膜内皮下マトリックス
血管の硬さは、血管細胞と基底膜(内皮下マトリックス)の複合的な硬さを反映しています4。細胞は、自身の剛性に同様の変化を経験することによってマトリックス剛性に適応するため、機械的互恵性9、内皮下マトリックス剛性と呼ばれるプロセスが、全体的な血管剛性の重要な決定要因となる。マトリックス剛性の測定では、均一に密度の高い内皮下マトリックスを得ることが重要です。アスコルビン酸添加培地で増殖したヒト網膜ECの場合、これには通常10〜15日かかります(図3A)4,5,6。この培養期間の違いは、市販の初代レチナールECのロット間の違いから生じる可能性があります。さらに、一般に、C57BL/6マウスの市販の網膜ECは、初代ヒト網膜EC培養物と比較して、より密度の高いマトリックスを沈着させることがわかり、種特異的な違いが示されています。図3Aに示すように、位相コントラスト画像は、マクロスケールでのマトリックスの全体的なビューのみを提供します。しかし、より微細なナノスケールからマイクロスケールの線維性構造は、マトリックス構造タンパク質であるコラーゲンIVおよびフィブロネクチンに対する抗体で免疫標識されたマトリックスの高解像度共焦点蛍光画像で明らかになります(図3B)。これらのマトリックスタンパク質は、特定のインテグリン受容体9に結合することにより、内皮細胞に有益な手がかりを提供することにも注意すべきである。

AFM剛性測定
適切なカンチレバー剛性(スプリング定数、k)とプローブ寸法の選択は、信頼性と感度の高い測定に不可欠です。これらのパラメータは、生体サンプルの剛性と寸法に一致するように選択する必要があります。選択したカンチレバーをAFMに取り付けた後、赤外線レーザービームをカンチレバーの先端に集束し、反射レーザースポットを光検出器の中心に集束する必要があります。このレーザーアライメントにより、カンチレバーのたわみを正確かつ高感度に検出し、その結果、剛性測定を実現します。AFM剛性測定は、Zピエゾがカンチレバーをサンプルに向かって垂直に下降させることから始まります。このとき、カンチレバーのたわみはなく、アプローチ曲線の基線が平坦になります (図4A)。カンチレバープローブがサンプルに接触してインデントすると、カンチレバーが曲がり、光検出器にレーザーたわみが生じ、これはアプローチ曲線の垂直方向のたわみによって表されます。サンプルにあらかじめ設定された押し込み力(セットポイント力)を適用した後、カンチレバーはサンプルから離れた開始位置(Z目標高さ)まで後退します。次に、偏向した収縮曲線をヘルツ/スネドンモデルに当てはめて、サンプルのヤング率(剛性)を計算します。

図4に示す代表的なフォースインデント測定から、糖尿病マウスから単離された網膜毛細血管から得られたアプローチ曲線と収縮曲線(図4B)は、非糖尿病マウスから得られた曲線(図4A)よりも大幅に急勾配であることが明らかです。フォースインデント曲線の傾斜が急であることは、フォースインデントに対するサンプル抵抗が高いためにカンチレバーのたわみが大きいことを示しており、これはサンプル剛性が高いことを反映しています13。実際、その後の複数の力のインデンテーション曲線のデータ解析により、マウスの網膜毛細血管は糖尿病で著しく硬くなることが明らかになりました4。また、カンチレバープローブと生体サンプルとの接触は、しばしば非特異的な表面接着を引き起こし、ベースラインを超えて収縮曲線が伸びることからわかるように、収縮中のカンチレバーの変形が負になることにも注意する必要があります(図4B)。さらに、細胞、マトリックス、血管などの生体サンプルは本質的に粘弾性があるため、フォースインデント後に恒久的な変形や見かけの剛性の変化を受ける可能性があります。その場合、これはアプローチ曲線とリトラクト曲線のミスアライメント(ヒステリシス)に反映されます。実際、図4Aと図4Bを比較すると、非糖尿病マウスの柔らかい毛細血管の力のくぼみが、硬いマウスで見られるヒステリシスよりも大きなヒステリシスを引き起こすという予想される傾向が確認されます。以前に報告した5,6ように、網膜EC培養から得られた内皮下マトリックスの剛性(ヤング率)も前述の方法で計算されます。

figure-results-1
図1:網膜分離のためにマウスの眼に施された切開切開の概略図。 ピンセットを使用して視神経を保持し、メスを使用して輪部の後方に完全に切開し、マウスの網膜を水晶体と前房から分離します。紫色の破線は、垂直切開の位置を示しています。この概略図は、科学的な画像とイラストレーションのソフトウェアを使用して描かれました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:AFM測定のための無傷のマウス網膜血管の単離のためのプロトコルの最適化 (A)ステレオスコープ画像は、毛細血管単離ステップの前に、軽度に固定されたマウスの眼から単離された無傷の網膜を示しています。スケールバー:2 mm. (B) 4倍倍率での代表的な位相コントラスト画像は、異なる分離法を使用して得られたマウス網膜血管を示しています。分離された血管の構造的完全性と耐久性を比較すると、除核眼からの網膜のトリプシン消化を5%ホルマリンで4°Cで24時間固定(赤枠)すると、AFM剛性測定に最も適した網膜血管系が得られることがわかりました。この方法を用いて単離された網膜血管は、ガラス表面に沿って均一に広がる明確な血管網を示した。スケールバー:500μm.(C)無傷の網膜毛細血管網の高倍率(20倍)ビューは、(B)に示されているものと同様に、穏やかに固定された眼から得られる毛細血管の高い構造的完全性を確認します。スケールバー:100μm。この数値は4から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:ヒトおよびマウスの初代REC培養物から得られた脱細胞化マトリックス。 (A)ヒトまたはマウスRECsの10日間(10d)または15日(15d)培養の脱細胞化後のガラスカバーガラス上の内皮下マトリックス凝集体を示す20倍率の代表的な位相コントラスト画像 スケールバー:100μm.(B)15日間のヒトREC培養物から得られた脱細胞化マトリックスの代表的な高倍率(100倍)共焦点蛍光画像は、抗コラーゲンIVおよび抗フィブロネクチン抗体で標識した、密度の高いナノフィブリルコラーゲンIVを明らかにします。およびフィブロネクチンマトリックス。スケールバー:20μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:マウス網膜毛細血管のAFM剛性測定による力距離曲線。 折れ線グラフは、(A)非糖尿病マウスまたは(B)糖尿病マウスから単離されたマウス網膜毛細血管の1つの位置での単一の力圧痕測定からの代表的なアプローチ(明るい色)と収縮(暗い色)曲線を示しています。SAA-SPH 半径 1 μm の半球カンチレバープローブを使用して得られた力曲線は、カンチレバーとサンプルの距離 (z-ピエゾで制御) とカンチレバーのたわみを引き起こす加えられた垂直方向の力との関係をプロットします。(A)黄色の矢印はZピエゾ駆動のカンチレバーによる試料へのアプローチ、白矢印はカンチレバープローブが試料に接触する接触点、緑の矢印は設定値(ピーク)までのカンチレバーのたわみ(※)を示します。(B)糖尿病マウスから分離された網膜毛細血管から得られたアプローチ曲線と収縮曲線は、非糖尿病マウスのもの(Aに示す)よりも著しく急な勾配を示し、糖尿病マウスの毛細血管剛性が高いことを示しています。矢印は、ベースラインより下の収縮曲線のくぼみを示しており、これは、インデンテーション中のプローブとサンプル間の接着によって引き起こされるカンチレバープローブの負のたわみを反映しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AFMは、大動脈や動脈などの大きな血管の硬直の疾患関連の変化を測定するために広く使用されています16。これらの知見は、アテローム性動脈硬化症などの心血管合併症における内皮メカノバイオロジーの役割を確立するのに役立ちました17。これらの発見に基づいて、私たちは、早期のDRにおける網膜微小血管病変の発症における内皮メカノバイオロジーのこれまで認識されていなかった役割の調査を開始しました。近年の研究では、大きな血管と同様に、網膜毛細血管や網膜EC分泌下皮マトリックスの硬さも、AFM 4,5,6を用いて直接、正確、かつ確実に測定できることが明らかになっています。

このアプローチでは、トリプシン消化を使用して、軽度に固定された眼からマウスの網膜毛細血管を分離します。経験から、固定されていない眼から分離された毛細血管(hypotonic法を使用)は壊れやすく、断片化するため、AFM剛性測定には適さないため、この軽度の固定ステップが必要です4。逆に、より強い固定およびそれに続く広範なトリプシンの消化のための必要性は、他の網膜トリプシン消化のプロトコル18で報告され、また堅い接合部の破壊によって判断されるように毛細血管の構造完全性を損なうかもしれない。したがって、ここで採用されている穏やかな毛細管固定と穏やかなトリプシン消化は、過剰なホルマリン誘発架橋から生じる剛性アーチファクトを減らし、信頼性の高いAFM剛性測定のための毛細血管の構造的完全性を確保するのに役立ちます。

別のアプローチとして、最近の研究では、軽く固定された網膜フラットマウント19からの網膜毛細血管のAFM剛性測定が報告されました。このアプローチでは、無傷の網膜内の網膜毛細血管にAFMフォースインデントを行うことで、 in situ 剛性測定が可能になります。ただし、これらの毛細管剛性の測定には、内部制限膜の剛性が含まれている可能性があります。さらに、このアプローチは、網膜フラットマウントでアクセス可能な表在性毛細血管のみの測定に限定され、初期のDR20で特に影響を受けるより深い毛細血管神経叢は除外されます。これらの問題は、すべての網膜層から血管をきれいに(残存網膜組織がない)抽出するこのアプローチを使用して対処できます。現在、このプロトコルを最適化して、初期のAMDの動物モデルから脈絡膜血管を分離しています。とは言うものの、プロトコルで採用されている軽度のホルマリン固定は、AFM測定で架橋関連の硬化アーティファクトを引き起こす可能性があることを認識しています。したがって、このアプローチを使用して得られた血管剛性の値は、絶対的な剛性ではなく、(異なる実験グループ間の)剛性の相対的な変化の観点から解釈するのが賢明です。

軽度の固定が必要な網膜毛細血管とは対照的に、網膜EC培養物から得られる内皮下マトリックスは、何も変更せずに評価できます。これは主に、培養培地へのアスコルビン酸の添加(コラーゲン合成を促進する15)、脱細胞化中のマトリックスの剥離を防ぐガラスカバースリップの化学修飾、および培養期間の延長(10〜15日)など、いくつかの要因の組み合わせから生じる堆積マトリックスの堅牢性によるものです。重要なことに、in vitroでの高血糖による内皮下マトリックスの硬直の増加は、in vivoで見られる糖尿病による網膜毛細血管の硬直の増加と一致していることを示しました4。マトリックス剛性の増加は、その上にある網膜ECの剛性を増加させると予想され(機械的相反性による)、それが一緒になって、全体的な毛細血管の剛性を増加させることが予想されるため、これは驚くべきことではありません。実際、我々は最近、糖尿病条件下で成長すると網膜ECが硬くなることを示しました4、これはおそらくRho/ROCK依存性のアクチン細胞骨格張力の増加によるものです21。これらの知見は、初期のAMDのアカゲザルモデルに見られる脈絡膜ECの硬化が、脈絡膜内皮下マトリックスと無傷の血管12の硬直の増加を反映していることも示唆しており、この考えは現在進行中の研究で検証されている。全体として、固定されていない網膜内皮下マトリックスとECの硬さの変化が、軽度に固定された無傷の網膜血管に見られる傾向を反映しているという事実は、穏やかな固定アプローチの有効性を証明しています。

DRの動物モデルからの網膜毛細血管の直接剛性測定は、DR管理の新たな治療標的としての内皮メカノバイオロジーの確立に役立つだけでなく、将来、DR患者の網膜毛細血管の硬さを非侵襲的に評価するための新しい高感度イメージング技術を開発するための強力な理論的根拠を提供します。このような非侵襲的な技術は、糖尿病誘発性心血管疾患で一般的に検出される動脈脈波速度の変化と同様に、毛細血管硬化から生じると予想される血流の微妙な変化を検出できる可能性があります。糖尿病ドナーの死後ヒトの目から分離された網膜毛細血管のAFM剛性測定は、この点で重要な概念実証を提供します。網膜毛細血管の硬さが 1 型糖尿病4 の (ストレプトゾトシン) マウスモデルで早期に増加することを考えると、AFM を剛性測定イメージングモダリティの検証に成功裏に使用すると、網膜毛細血管の硬さが早期の DR 病因の臨床バイオマーカーとして特定される可能性があります。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、National Eye Institute/NIH grant R01EY028242 (K.G.へ)、Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD (K.G.へ)、W.M. Keck Foundation から The Stephen Ryan Initiative for Macular Research (RIMR) Special Grant (Doheny Eye Institute へ)、Ursula Mandel Fellowship and UCLA Graduate Council Diversity Fellowship (I.S.T. へ) の支援を受けました。この研究は、Research to Prevent Blindness, Inc.からUCLAの眼科への無制限の助成金によっても支援されました。この記事の内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
網膜毛細血管分離
0.22 µm PVDF シリンジフィルターメルク ミリポアSLGVM33RS低タンパク質結合 デュラポア
10X ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 カルシウム % マグネシウムコーニング20-031-CV最終濃度 1X、pH 7.4
12ウェルプレートファルコン コーニング353043
15 mL 遠心チューブコーニング430791Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic
20 mLLuer-Lok TIPシリンジBD302830
5 3/4インチ使い捨てホウケイ酸ガラス/非滅菌パスツールピペットッシャーブランド13-678-20A
60x15 mm組織培養ディッシュファルコンコーニング353002
6ウェルプレートファルコンコーニング353046
アクアホールド2パップ-13mLペン科学機器研究所9804-02
ブレードホルダーX-ACTO
炭素鋼外科用ブレード #10バードパーカー371110
歯科用ワックス電子顕微鏡 科学50-949-027
解剖顕微鏡Am-scope
ホルマリン溶液、中性緩衝液、10%ミリポア シグマHT501128-4L最終濃度 5% (v/v)
Kimwipes - ワイパーティッシュKimtech Science34133
マイクロスパチュラFine Science Tools10089-11
Orbital ShakerLab GeniusSK-O180
PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm ピンセットテッド・ペラ5667
位相差顕微鏡ニコン TS2
清浄機 Logic+ クラス II, タイプ A2 バイオセーフティキャビネットLabconco302380001
Safe-Lock 微量遠心チューブ 2 mLエッペンドルフ22363352
ステレオスコープAmScopeSM-3 シリーズ ズーム 三眼実体顕微鏡 3.5X-90X
Superfrost Plus顕微鏡スライド - ホワイトタブ - 洗浄済み - 25x75x1.0 mmFisherBrand1255015
トリスバッファー、0.1M溶液、pH 7.4 - バイオテクノロジーグレードVWRE553-500MLpH 8 トリプシン溶液
トリプシン1:250粉末 組織培養グレードVWRVWRV0458-25G10% (w/v) トリプシン溶液
水分子生物学グレードコーニング46-000-CM
Subendothelial Matrix
10X PBSコーニング20-031-CV
1X PBS カルシウムとマグネシウムサーモフィッシャーサイエンティフィック14040-117pH 7.4
水酸化アンモニウムSigma-Aldrich338818
アスコルビン酸Sigma-AldrichA4034
コラーゲン IV抗体Novus BiologicalsNBP1-26549
DNase IQiagen79254
エタノールアミンSigma-Aldrich398136
フィブロネクチン抗体Sigma-AldrichF6140
FluoromountInvitrogen-Thermo Fisher Scientific00-4958-02
ゼラチンSigma-AldrichG1890
ガラスカバースリップ(12mm)Fisher12-541-000
Glutaraldehyde電子顕微鏡科学16220
ヒト網膜内皮細胞(HREC)Cell Systems CorpACBRI 181
MCDB131培地コーニング15-100-CV
マウス網膜内皮細胞(mREC)Cell BiologicsC57-6065
トリトン X-100サーモフィッシャーサイエンティフィック BP151-100
トリプシンGibco-Thermo Fisher Scientific25200-056
AFM測定
1 & micro;m プローブBrukerSAA-SPH-1UMA 高さ 19 ミクロンの半球状プローブ、端径 1
ミクロン、スプリング定数 0.25N/m
70 nm LC プローブBrukerPFQNM-LC-V2高さ 19 ミクロンの半球形プローブ、端径 70nm、
 ばね定数 0.1N/m
 カメラXCAMファミリーToupcam1080P HDMI
デスクトップ カメラを実行するAsusAsusデスクトップIntel i5-6600 CPU、8GB RAM
カバースリップ用ディッシュホルダーCellvisD29-14-1.5-N29mmガラスボトムディッシュ with
 14mmマイクロウェル
Nanowizard 4ブルカーNanowizard 4バイオサイエンス原子間力顕微鏡を光学顕微鏡に搭載し、軟質生体試料の機構構造特性(剛性とトポグラフィー)を高感度に測定
位相差マイクロスコープZeissAxiovert 20010倍対物レンズ付き倒立顕微鏡
フィ

参考文献

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