方法論記事

人工呼吸器マウスにおける過分極 129Xe肺MRIおよび分光法

DOI：

10.3791/66924

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2024年10月11日

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1Center for Pulmonary Imaging Research, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Imaging Research Center, Department of Radiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 4Analytical Technology Group, Aurorium, 5Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Internal Medicine, University of Kansas Medical Center, 6Department of Bioengineering, University of Kansas, 7Hoglund Biomedical Imaging Center, University of Kansas Medical Center, 8Department of Pediatrics, University of Cincinnati, 9Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過分極キセノンMRIは、トランスレーショナルリサーチや臨床ケアにおいて、局所的な肺の微細構造(空域寸法)と生理機能(換気とガス交換)を定量化することができます。困難ではありますが、前臨床試験で同等の肺の洞察を提供することができます。このプロトコルは、マウスで定期的なキセノン肺MRIを実行するために必要なインフラストラクチャと手順を説明しています。

要約

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過分極(HP)キセノン-129(129Xe)は、換気、制限された拡散(肺胞-空域サイズ)、ガス交換などの肺生理学を定量化するために利用できる独自のスペクトルおよび物理的特性を持つ吸入磁気共鳴画像法(MRI)造影剤です。ヒトでは、さまざまな肺疾患の重症度と進行を評価するために使用されており、米国と英国で臨床使用が承認されています。 129Xe MRIは、その臨床応用だけでなく、肺の病態生理学を非侵襲的に評価し、空間的に解決された情報を提供する能力も、前臨床研究にとって価値があります。動物モデルの中では、遺伝子改変疾患モデルが利用できるため、マウスが最も広く使用されています。ここで、 129Xe MRIは、肺疾患の進行と治療反応を縦断的に監視するための低侵襲、放射線フリー、高感度の技術として有望です(創薬など)。この技術は、MRIトリガーの自由呼吸装置または人工呼吸器を組み込んでガスを供給することにより、前臨床アプリケーションまで拡張できます。ここでは、品質管理のための熱分極キセノンガスファントムの作成、分極の最適化、動物の取り扱い(鎮静、挿管、換気、マウスのケア)、換気、制限拡散、ガス交換データのプロトコルなど、堅牢なデータ収集と分析を確保するための手順とチェックリストを提供します。前臨床 の129Xe MRIは、さまざまな動物モデル(ラット、ブタ、ヒツジなど)に適用できますが、このプロトコルは、マウスの小さな解剖学的構造によってもたらされる課題のため、手頃な価格と多くの疾患モデルの利用可能性によってバランスが取れているため、マウスに焦点を当てています。

概要

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肺疾患は依然として世界的な罹患率と死亡率の主な原因ですが1、過去10年間で患者の転帰は劇的に改善しました。これらの改善は、部分的には2つの要因によって推進されています。まず、第III相臨床試験では、死亡率よりも肺機能の変化をエンドポイントとして優先するようになり、薬物試験が加速しています2,3,4,5。第二に、改良された動物モデルの進歩は、疾患のメカニズムに関する洞察を提供し、治療法の開発を支援しました6,7。マウスモデルは、ヒトと生理学的に類似し、手頃な価格で、疾患が急速に進行するため、トランスレーショナルリサーチに好まれることがよくあります。遺伝子工学により、利用可能なモデルの範囲と品質が拡大し、International Mouse strain Resourceは現在、ラット系統がわずか4,218系統であるのに対し、現在では32,000系統以上のマウス系統8を誇っています(Rat Genome Database9)。これらのモデルは、慢性閉塞性肺疾患(COPD)10、嚢胞性線維症(CF)11、肺線維症12,13、肺高血圧症14,15、喘息16など、さまざまな肺疾患のメカニズムドライバーと治療反応を調査するための新たな道を開きました。

残念ながら、マウスを用いた肺研究は、疾患の負荷を定量化するために利用可能な技術によって制限されています。研究は、1)全肺情報(生化学的アッセイ)または局所情報(組織学)を提供し、2)横断的デザインと大きなサンプルサイズを要求する最終手順に依存することがよくあります。したがって、彼らは空間的または時間的な疾患のダイナミクスを捉えません。対照的に、非侵襲的な3次元イメージングは、肺の構造、分子プロセス、および機能を経時的に評価できます。

肺の構造(気道異常や間質性線維症など)は、超短エコータイム(UTE)MRIとマイクロコンピューター断層撮影(μCT)で高解像度で視覚化できます。機能情報および機構情報(例、換気、灌流、腫瘍代謝、および炎症過程)は、外因性造影剤(例、キセノン増強CTおよび酸素増強UTE)および電離核医学アプローチ(すなわち、陽電子放出断層撮影法[PET]、および単一光子放出型コンピュータ断層撮影法[SPECT])を用いて取得できる。しかし、機能的なイメージングは、コントラスト対雑音比が控えめであるため(特に、前臨床MRIに使用される高い磁場強度で酸素増強UTEの場合、T1が長くなる)、正常レベルよりも高い放射線の電離モダリティを使用しないため、困難です。これらのモダリティによるイメージングは、従来の線量を用いた動物モデルでは忍容性が高いが、累積放射線は免疫学、炎症、および肺がんに関する研究で結果を混乱させる可能性がある17。しかし、過分極(HP)キセノン-129(129Xe)磁気共鳴画像法(MRI)は、低侵襲で、非照射性で、高感度の構造的および機能的情報を提供します。この技術は、肺気腫18,19、線維症20、肺がん21、COPD22、および放射線誘発性肺損傷23などの状態を単一または複数の時点で特徴付けるために前臨床研究で採用されてきましたが、前臨床設定では十分に活用されていません。

ルーチンの前臨床 129Xe MRIを可能にするには、施設の規制サポート、過分極デバイス、129Xeで調整された高周波(RF)コイル、多核対応スキャナーなど、いくつかの前提条件が必要です。高度なアプリケーション24、25、26、27、28、29、30、31、32、33 は、このプロトコルの範囲外のベンダー固有のパルスプログラミングを必要としますが、基本的なアプリケーションは、適度なソフトウェア変更で実現できます。そのため、私たちは、前臨床の129Xe MRIに特有の品質管理、磁化処理、データ収集、および動物処理手順(人工呼吸器を含む)に焦点を当てています(図1)。

現在までに、小動物用129Xe Imagingは、自由呼吸、ピストン駆動、圧力損失という3つのMRセーフガス供給アプローチを採用してきましたが、それぞれに長所と短所があります。自由呼吸は、挿管や気管切開による怪我のリスクなしに自発的な吸入を可能にしますが、大幅に多くのHPガスを消費し、モーションアーティファクト34,35を導入する可能性があります。市販のピストン駆動デバイスは、自己校正機能を備えており、箱から出してすぐに使用できますが、法外に高価になる場合があります36。ここで使用されている圧力損失ベースのアプローチは、文献に詳しく説明されており、モジュール式でカスタマイズ可能で、オープンソースコード37、38、39、40によって実行されます。さらに、費用対効果が高く、通常、合計で$10k未満で、数週間の専用ビルド時間で済みます。圧力降下型人工呼吸器は、挿管されたマウスの気道圧を監視しながら、加圧キャニスター内のドーズバッグから129Xeを供給します。

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図1:マウスの日常的なキセノン-129(129Xe)磁気共鳴画像法(MRI)を収集するためのプロトコルの概要(A)初期設定の手順。(注: スキャナーのプログラミングは各ベンダーに固有であり、このプロトコルでは説明されていません)。(B)日々の品質保証(QA)および動物データを収集するための手順。(C)実験の結論とデータ解析を成功させるためのステップ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ここでは、129Xe MRIデータの3つの一般的なクラス、換気、拡散強調イメージング(肺胞空域サイズ)、およびガス交換を収集して分析します。換気画像は、吸入された129Xeガスの分布を示しています。HPのガス画像では、空気の流れが減少した肺の領域が暗く見え、病理は換気不良の量によって定量化されます。ヒトでは、換気欠陥率(VDP)は、COPD43,44,45や喘息46,47などの疾患における肺閉塞に対する高い再現性41,42と高い感受性を示しています。

空域内の129個のXe原子の制限拡散は、見かけ拡散係数(ADC)を介して測定でき、空域サイズの代用として機能します。ADCは、拡散重み付けなしのベースライン画像(b0)と、バイポーラ勾配誘起拡散重み付けの存在下で取得された1つ以上の画像(bN)を取得することによって計算されます。ADCの上昇は、老朽化または気腫性改造による空域サイズの増加を反映しています18,48。さらに、複数のb値画像(≥4)を使用すると、より詳細な形態計測情報(例えば、平均線形切片)を計算することができる49,50。

ガス交換は、1)毛細血管膜組織、血漿、および赤血球(赤血球)における129Xeの溶解度、および2)これらのコンパートメントに溶解したときの129Xeの>200 ppmのダウンフィールド化学シフトにより特徴付けることができます。分光データと画像データの両方から、心肺疾患(肺高血圧症や左心不全など)に関する洞察が得られます51,52,53。多くの種(ヒト、イヌ、ラット)は各コンパートメントに由来する独自のスペクトルピークを示しますが、マウスはヘモグロビン-キセノン結合部位の相互作用の違いにより、独自のRBCシグナルを欠いています。代わりに、すべての溶解成分がマウス54の単一のシグナルに結合される。しかし、鎌状赤血球症54のモデルで使用されるような、ヒトヘモグロビンを発現するトランスジェニックマウスにおいて、明確なRBC共鳴を観察することが可能である。全体として、溶解した129Xe分光法とイメージングは、マウス55,56の心肺病態生理学に関する独自の洞察を提供します。

このプロトコルを試す前に、マウス研究に必要なMRIスキャナー、人工呼吸器、およびマウスの取り扱い技術に関する背景情報を理解する必要があります。動物実験を開始する前に、すべての手続きは、地元の動物施設管理および使用委員会(IACUC)によって承認されなければならない57。マウスの肺で利用可能な全磁気モーメントは本質的に低い(つまり、潮汐量~250μL)ため、解剖学的に同等の分解能を達成するためには、ボクセルサイズをヒトよりも1000倍小さくする必要があります。マウスの呼吸数も非常に速い(>100呼吸/分)。そのため、人間の画像診断に一般的に使用される一息止めの手順は実行可能ではありません。代わりに、各ブレス内で適用できる RF 励起は数個しかないため、 129個の Xe 画像を数十から数百のブレスでエンコードする必要があります。パルスプログラミングは、集録の外部トリガを可能にし、S/N比(SNR)、分解能、スキャン時間のバランスを取りながら、スライス、位相エンコード、および/または拡散強調画像を適切にループするために必要になる場合があります。ここでは、人工呼吸器は呼吸ごとに1回トランジスタトランジスタロジック(TTL)パルスを出力して、データ収集をトリガーします(図2)。

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図2:代表的な機械換気とデータ取得のタイミング。(A)ユーザー制御の換気は、エンドインスピレーション時、息止め中、または呼気終了時にデータ収集をトリガーできます。(B)この3D橈骨換気シーケンスでは、ユーザーは、取得された投影の総数と呼吸あたりの投影の数を定義します。(C)スライス選択的な2D拡散強調画像の場合、ユーザーはスライスの順序、b値画像、および位相エンコードを定義します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

信頼性の高い換気と129Xeの送達を可能にするには、しっかりとした鎮静と挿管の手順が必要です。各研究について、各麻酔薬の下流への影響を考慮する必要があります-分時換気、心拍数(HR)、および血圧58,59,60,61,62,63,64,65,66の変化を含む。前臨床のHPガスMRIにはさまざまな鎮静剤が使用されてきましたが、その入手可能性、費用対効果、信頼性、および持続時間67,68のために、ケタミン、キシラジン、およびアセプロマジンの混合物を使用しています。鎮静剤を投与された動物は、効果的な人工呼吸器のために挿管する必要があります。マウスの挿管は、解剖学的構造が小さいため難しいため、この技術を徹底的に訓練することが重要です。研究者には、公開されたビデオプロトコル69,70を確認することをお勧めします。ほとんどの市販の挿管カニューレにはステンレス鋼が含まれているため、気道の直径に合わせてカスタマイズしてマウスの気管壁と気密シールを作成できる、金属フリー(つまり、MRIおよびHPガス互換)のくさび形カニューレを作成する技術を紹介します。

129個の Xe 画像は多くの呼吸で収集されるため、人工呼吸器の設定は非常に重要です。肺の損傷を防ぐために、保護換気戦略を慎重に検討する必要があります71,72,73,74。特に、低潮汐量 (TV)、中程度の呼気終末陽圧 (PEEP)、および肺胞動員法 (RM) の使用は、ヒト患者および動物モデル75,76,77,78,79,80,81における人工呼吸器誘発性肺損傷のリスクを低下させる。ここでは、圧力損失型の 129Xe 機械換気と互換性があり、保護機能があり、十分な 129Xe イメージ SNR を提供する簡単な手法をお勧めします。具体的には、人工呼吸器の呼気ラインに市販のPEEPバルブを追加することでPEEPを適用します。RMを実行するには、呼気ラインを閉じて、目標の圧力と持続時間に達するまで動物が呼気なしで複数回吸入できるようにする必要があります。

全体を通して、一般的な換気設定を提供していますが、特定の研究目標82,83に対処するために文献を確認することをお勧めします。人工呼吸器中のピーク吸気圧のモニタリングに加えて、動物の体温のモニタリングも重要であり、これは標準的なマウスの温度モニタリング方法を用いて行うことができます。イメージングには必要ありませんが、心電図(ECG)による心拍数のモニタリングは有利です。心電図は、動物が鎮静から目覚めているか、過剰摂取しているか、または苦痛を感じているかを示すことができ、研究者が介入することができます。

我々が説明するプロトコルは、 129Xe 3Dラジアル換気データ61、2D GRE拡散強調データ76、および動的パルス取得分光法ガス交換データを収集するように設計されている。このプロトコルは、小動物モデルでの前臨床研究と 129Xe MRIの可能性との間のギャップを埋め、肺疾患の理解を深めることを目的としています。

プロトコル

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ここに記載されているすべての方法は、シンシナティ小児病院医療センターの動物施設管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 用地の初期準備

  1. 熱偏波 129Xeガスファントムを作成してテストします(図3)。
    1. ホウケイ酸ガラス容器(~60 mL)、フロントシーリングOリング付きプランジャーバルブ、および粉砕ホウケイ酸ガラスステム(すべて定格150 psig)を入手します。磁性部品がないことを確認してください。ガラスステムに圧縮フィッティングを取り付けます。締めると、気密シールになります。
    2. 図3Aに従って、容器を真空ポンプと酸素リザーバーに接続します。真空容器を100mTorrの絶対圧未満にします。
    3. 容器を 1.5 気圧の圧力で酸素で満たし、 129Xe T1 を > 30 分から ~2 秒 (7 T 磁場強度;9.4 Tスキャナーの場合は、1.6 atm酸素を使用してください)。シール容器。
      注:電界強度を高くするには、T1≤ 2 s84を達成するために、やや高い酸素分圧が必要になります。
    4. ガス不透過性のリザーバーに400 mLの同位体濃縮キセノン(85% 129Xe)を満たします。
      注:天然存在量のキセノン(26% 129Xe)も使用できますが、SNRの~3倍の低下を緩和するには、シグナルのタベレージングを増やす必要があります。
    5. 容器を 129Xeのリザーバーに接続します。真空チューブを100mTorrの絶対圧未満に。
    6. 口を開けたベンチトップ液体N2 Dewarを~90%まで充填します。容器の底(~5cm)を液体窒素に浸してO2 を凝縮させ、真空にします(図3B)。水中でバルブを開き、リザーバーからの 129Xeが容器に流れ込むようにします(図3C)。
    7. プランジャーの流入穴がOリングを越えて引っ張られるまで、ステムをゆっくりと引っ張って、プランジャーバルブをシールします。穴がOリングを通過した直後に、手で締めて容器を密封します。容器を液体窒素から取り出し、解凍します。
      注:解凍後、容器は~4.5気圧(2気圧O2 + 2.5気圧 129Xe)まで加圧されます。
    8. ガラス器具を保護します(例:パッド入りポリ塩化ビニル(PVC)パイプ容器に容器を挿入します、 図3D)。
      注意: 適切にメンテナンスされていれば、ファントムは10年以上圧力を維持できます。
    9. ファントムのT1 を測定します(たとえば、分光反転回復シーケンスを使用)。7 T スキャナーの場合は T1 < 2 s を確認します。品質保証(QA)のために、信号とT1 を経時的に追跡します。

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図3:ステップ1.1で詳述したプロトコルに導かれた熱偏光 129Xeガスファントムの作成。 O2 および 129Xe分圧は、T1 をカスタマイズして、適切な 129Xe T1 倍および所与の電界強度84における信号強度を得るために変更することができる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 熱偏極ガスファントムで品質保証を行います(表1、図4)。
    1. 129Xeコイルを磁石のアイソセンタに配置し、129Xeガスファントムをコイルの中央に配置します。1 回のパルス アンド アクイジット シーケンス (「シングル パルス」) で、動作周波数をファントムの約 129Xe ガス周波数 (7T で ~83.07 MHz) と一致するように設定します。
    2. 取得周波数と励起周波数を 129Xe Larmor周波数の中央に置き、この周波数をすべてのファントムキャリブレーションと品質管理 129Xeスキャンに使用します。すべてのQAスキャンの実験パラメータについては、 表1 を参照してください。ファントムがファントムローカライザーで中央に配置されていることを確認します(図4A)。
    3. 回転角度を較正するための章動実験の実施:SNRが十分であると仮定して、繰り返し時間(TR)間隔が5 x T1>単一のRFパルスを使用します。集録ごとに、信号がゼロになって反転し始めるまで、RF電力を段階的に増やします。ここで使用される標準は、パルス数 = 65 です。TR = 10秒;パルス持続時間 = 125 μs;RF電力 = 1-13.8 W、0.2 Wずつ増加
    4. フーリエ変換と位相は、最初のスペクトル(つまり、最小のRF電力で取得したスペクトル)です。すべてのスペクトルに同じ位相を適用します。実際のスペクトルをRFパルス電力の関数としてプロットします(図4B)。
    5. ヌルピークを生成するパワー(つまり、最小ピーク高さ)は、180°のフリップ角度に対応します。180°のフリップ角度を生成するのに必要なパルス長の半分で同じ電力を使用して、90°のフリップ角度を達成します。スキャナーソフトウェアで許可されていると仮定して、この90°の基準電力とパルス長を後続のフリップ角度スケーリング用に設定します。
    6. 129Xeスペクトルの半値(TR ~ 1 s)で全幅を最小化することにより、単一のパルスを使用してシムします。必要に応じて、シム後に周波数を中央に戻します。全角半値を記録します。
    7. 129Xe QAスキャンを実行します(表1および図4C)。QAデータ(SNR、平均ファントム信号、ノイズの標準偏差)を記録します。

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図4:スキャン前の品質保証 (A) 低解像度の2D GREコロナルファントムローカライザは、ファントムが磁石の中心にあることを確認します。(B)90°パルスを設定する章動実験では、180°パルスにヌルピークが示されています。(C)フリップ角度をローカライズしてキャリブレーションした後、より高解像度の2D GRE QA画像を取得します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコルの短縮名シーケンスの説明TR (ミリ秒)TE (ミリ秒)平均/繰り返しフリップ角度 (°)マトリックスサイズまたはNpts視野角 (mm2)RF帯域幅(kHz)スライス/スラブの厚さ(mm)スキャン時間
シングルパルスパルス集録10001 / 1602048101秒
ファントムローカライザー2D GRE2003.720 / 14860×32120×483602分間
フリップ角度キャリブレーションパルス集録70001 / 652020485.127.5 min(英語)
129名Xe QAの2D GRE50003.38 / 19032232234021分

表1:ファントムキャリブレーション品質保証シーケンスパラメータ。 TR = 繰り返し時間、TE = エコー時間、Npts = ポイント数、FOV = 視野、BW = 帯域幅。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

  1. 偏光を計画します(図5A、B)。
    1. 偏光 129Xe の容量と蓄積時間を選択:このプロトコルには 15 分で 400 mL が最適です(図 5)が、他のアプリケーションや機器に合わせて簡単に調整できます。
    2. 過偏光子内の既知のデッドボリューム(例:Vデッドボリューム= 80 mL)を仮定して、必要な分注量V、129Xeガス分画f、および蓄積時間taccの流量(SLMのFXe)を計算します。
      figure-protocol-3(1)
      注:通常、作製時間が長いほど偏光が高くなりますが、 in vivo イメージングには実用的でない場合があります。過偏光子85、86、87、88 の適切なモデルを使用して、生産時間と偏光のバランスをとる流量を決定します。ここでは、J. W. Plummer et al.89 (図 5A) のモデルを使用しました。これは、連続フロー偏光子に適用され、ストップフロー超偏光子90には適用されません。
    3. これらのパラメータに従ってガスを分極し、商用または自作のデバイスで分極を測定し、QAの予測分極と比較します。
    4. 輸送中の偏光損失を測定します。偏光が十分に大きく減少する場合(例:>10%)、輸送中の偏光を保護するために磁気キャリングケースを構築します。 補足ファイル1:輸送中の偏波の管理および 補足図1を参照してください。

figure-protocol-4
図5:分極管理(A)分極と生産量は、蓄積時間と流量の関数です。400 mL のガス袋は、20 分間で高い初期分極率 (~35%) を提供します。1 L のガスを使用することは魅力的に思えるかもしれませんが、初期分極は低くなります (~20%)。(B)~15分間の換気後、HP 129Xeの1リットルバッチは<10%の分極まで減少するが、600mLのガスは116のままである。したがって、129Xe の 400 mL バッグを複数使用すると、送達分極の平均が高くなります。C) プライマリフィールドとアクティブシールドフィールドが交差する場所(位置(N、N、N)の赤いボックス)は、HP 129Xeの急速な緩和を引き起こす可能性があります。磁石のフリンジ磁場の特性評価は、HP 129Xeのリザーバーを急激な緩和なしに配置できる安全ゾーンを特定するのに役立ちます(位置(0,0,n)の緑色のボックス)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:輸送中の偏波の管理。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

  1. HP 129Xeの位置依存性T1をフリンジフィールド内で測定します(図5C)。
    1. X、Y、Z 寸法に沿って、磁石の等心を基準とした既知の距離と位置を持つ参照点を作成します。等角線にラベルを付け、他の位置に n から N にラベルを付けます。調査するポジションの数は、使用可能なスペースによって異なります。
    2. 少量の 129Xe (~250 mL) を過分極し、MRI 制御室に運びます。大型のシリンジ(50-100 mL)に129Xeを充填し、磁石内のアイソセンタ(図5Cの位置1)に置きます。~1°のフリップ角度パルスを再生して、信号を測定します。
    3. シリンジを所定の位置に ~10 分間置いてから、別のスペクトルを取得します。信号が少なくとも1 T1 減衰するまで(つまり、信号が初期値の~1/3に減衰するまで)、10分ごとに信号を再測定します。
    4. ステップ 1.4.2 を繰り返して、新しい 129Xe シリンジで新しい T1 実験を開始します。
    5. シリンジを新しい位置( 例:図5Cの位置n)に移動し、10分間そのままにしておきます。シリンジをアイソセンタに戻し、さらに~1°のフリップ角度スペクトルを取得します。
    6. このプロセスを繰り返します:シリンジを位置nに移動し、10分間待ってからアイソセンターに戻し、信号が少なくとも1 T1減衰するまで信号を再測定します。
    7. X、Y、Z方向をカバーする残りの参照位置について、手順1.4.4〜1.4.6を繰り返します。
    8. 初期信号(S0)は、θフリップ角度でn個のRFパルスにわたって単指数関数的に減衰します。信号 (S) を時間 (t) の関数としてフリンジ場に当てはめ、各位置の T1 を計算します。
      figure-protocol-5(2)
    9. 129Xe リザーバーの配置に十分な T1 (>20 分) の位置を特定します。
  2. メタルフリーの挿管カニューレを作成します(図6)。
    1. ルアーコネクタ付きの静脈留置ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)カテーテルを2本入手します。針は鋭利物処理容器に捨ててください。
      注:25 g>マウスの場合は、18 Gおよび20 Gのカテーテルを使用してください。小動物には、20Gと22Gのカテーテルを使用してください。
    2. ルアーコネクタをカテーテルから切断します。小さい方のカテーテルを大きい方のカテーテルの上端に送り込み、より鋭く先細りで長いカニューレを作成します。複合カニューレを、ルアーベースを含まない斜めの端で~4.6cmにカットします(図6A、B)。
    3. 200 μL ピペットチップの幅の広い方の端を ~2.6 cm の長さに切り取ります (図 6C)。
    4. ピペットチップの内側を一般的な離型剤でコーティングします。内部に挿入された別のピペットチップを使用して、潤滑剤を薄く分散させます。ピペットチップにアセトキシシリコーン加硫ペーストエポキシを充填します(図6D、E)。
    5. 両端から伸びる22Gワイヤーでカニューレを差し込みます。カニューレチューブをピペットチップのシリコンに通します。チューブをピペットチップの端から~7mm伸ばします(図6F、G)。
    6. ピペットチップの幅の広い側のカニューレチューブをプラスチック製のオススリップルアーコネクタに通し、ピースをエポキシで接着します。ルアーコネクタを越えて伸びるチューブをトリムします(図6H)。
    7. エポキシが乾くのを待って(>24時間)、シリコン挿管カニューレをピペットチップ型から慎重に取り外します。カニューレからワイヤーを取り外し、チューブが閉塞していないことを確認します(図6I)。
    8. 挿管を容易にするハンドルを作成するには、チューブ(1/16インチまたは1/8インチ)をメスのルアーコネクタに接続します。挿管の準備ができたら、このメス型ルアーコネクタをオス型ルアー挿管カニューレに接続します。この部品は、挿管後に簡単に取り外すことができます(図6J)。
    9. 動物に使用する前に毎回消毒してください:カニューレの外側を70%アルコールで拭いてください。20 Gワイヤーを消毒剤で拭き、カニューレにワイヤーを通して内部を消毒し、詰まりがないことを確認します。

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図6:MRIおよびHP 129Xe互換のマウス挿管カニューレの作成。 これらのカニューレは、ステップ1.5で説明したように、静脈カテーテル、ピペットチップ、およびシリコンシーラントで構成されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 日々のデータ収集

注: 補足ファイル2:前臨床スキャンQAチェックリストを参照してください。

補足ファイル2:前臨床スキャンQAチェックリスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

  1. 毎日のスキャナーの品質管理と人工呼吸器のセットアップを完了します(図4)。
    1. ファントムを使用して、スキャナーでQAプロトコルを実行します(QAスキャンパラメータについては 表1 を、日常の品質管理手順についてはステップ1.2を参照してください)。
    2. J. Nouls et al.38の方法に従って人工呼吸器を校正します。 補足ファイル3:人工呼吸器のキャリブレーション、 補足図2、 および 補足図3を参照してください。
    3. エンド吸気時のイメージングの人工呼吸器を設定します(表2)。動物用ベッドをスキャナーラックに置き、生命維持モジュール(つまり、機械的な人工呼吸器部品)をスキャナーの隣のテーブルに置きます。
    4. サイトスペシフィックな動物暖房システムをアクティブにします。ヒーターを35.5〜40°Cに設定し、循環空気をオンにし、動物の頭が休む場所から~5インチ以内にエアホースを配置して、スキャナーの穴を事前に温めます。
換気設定HP 129Xe MRIの推奨事項筆記
潮汐量(TV)8〜10 mL/kgの理想的な体重モデレートテレビ;テレビが低いと、より高いBRが必要になり、画像にモーションアーチファクトが発生する可能性があります
呼気終末陽圧法(PEEP)2–6 cmH2O
呼吸数(BR)80〜120 br/min
リクルートマニューバー(RM)~35 cmH2Ω 6 秒、5 分間隔
換気時間;立場<6時間;仰臥 位胸の動きをよりよく見るための仰臥位
吸気酸素の割合(FIO2)0.3–0.5麻酔マウスの低酸素症を予防する
吸気と呼気の比率(I:E)1:2–1:4
総サイクル持続時間への吸気0.2–0.4
分単位の換気≥0.57 mL・g-1・min-1
私たちの基準:
BR = 80 br/min、吸気持続時間 = 200 ms、FIO2 = 0.3
エンドスピレーションでのイメージング: 息止め= 200ミリ秒、トリガー遅延= インスピレーション開始後200ミリ秒
息止め中のイメージング: 息止め= 250ミリ秒、トリガー遅延= 吸気開始後250ミリ秒
呼気終了時のイメージング: 息止め= 200ミリ秒、トリガー遅延= 吸気開始後650ミリ秒

表2:129Xeイメージングの推奨人工呼吸器設定。パラメータは、特定の研究目的および実験条件に合わせて微調整することができる 117,118,119,120,121,122,123,124。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:人工呼吸器のキャリブレーション。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

  1. 動物を落ち着かせて挿管します。
    1. インキュベーターを27.7°Cに、および/または電気加熱パッドを37.7°Cにオンにします。 動物の体重を測定して記録します。質量に基づいて鎮静剤の投与量を計算します。.典型的な投与計画については、 表3 を参照してください。.
    2. 鎮静剤を腹腔内に注射します。.注射の時間に注意し、鎮静剤の次の投与のタイマーを設定します。.
      注:セクション2(毎日のデータ収集)の残りの手順をできるだけ早く完了して、鎮静中の時間と過剰摂取のリスクを最小限に抑えます。.
    3. 動物の目に目の潤滑剤を塗布し、低体温症を防ぐために動物を加熱パッドのケージまたはインキュベーター内に置きます。
    4. 鎮静剤注射68の10〜15分後につま先つま先つまみテストを行うことにより、動物が完全に鎮静されていることを確認する。Das et al.69に概説されている手順に従って挿管します。.
      注:Das et al.69 による論文には、この手法の包括的なビデオデモンストレーションが添付されています。手順は次のとおりです。
    5. 動物を仰向けで、傾斜したボードの歯で吊るします。げっ歯類の舌圧子を使用して舌を引き出します。
    6. 声帯が見えるようにするには、挿管カニューレ内の光ファイバーケーブルまたは喉の外側に配置された明るい光を介して白色光を供給します。カニューレを声帯から5mm未満に挿入します。
    7. カニューレが食道ではなく気管にあることを確認し、カニューレを小さな水滴が入ったチューブに接続します。水滴が動物の呼吸に合わせて移動する場合、位置は正しい可能性があります。

エージェント用量ルート期間コメント
吸入剤
イソフルラン誘導:4%–5%
メンテナンス:1%–
3%または効果		吸入連続フロー中•校正済みの気化器の使用が必要です
注射剤
推奨:ケタミン+キシラジン+アセプロマジン90 + 9 + 3 mg / kg腹腔内20-60分•低体温症に対する感受性を作成します
•繰り返し投与する場合は、過剰摂取を防ぐためにケタミン+キシラジン混合物に切り替えることをお勧めします
•摩耗すると揺れを引き起こします。イメージングについては、投与スケジュールを厳守してください
•徐脈を引き起こす可能性があります
ケタミン+キシラジン90 + 9 mg / kg腹腔内20〜40分•上記参照(ケタミン+キシラジン+アセプロマジン)
ペントバルビタール50 - 70 mg/kg腹腔内20-60分•呼吸数と運動を抑制します
•費用が法外な費用になる場合があります
•医薬品グレードは利用できない場合があります
免責事項:これらは一般的なガイドラインです。実装する前に、獣医師に相談してください。

表3:マウスの一般的な麻酔薬処方。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

  1. 動物を換気します(表2)。
    1. 挿管カニューレのルアーコネクタを介して動物を人工呼吸器に取り付けます。横隔膜の動きとピーク吸気圧(一回換気量10mL/kgの体重に対して~10-12cmH2O)を監視します。圧力や呼吸の動きが異常な場合は、必要に応じてカニューレの首の角度と深さを慎重に調整してください。
    2. リクルート操作を実行して、挿管カニューレが気密であることを確認します:動物が息を吐かずに複数回吸い込むように、呼気を防ぎます(たとえば、指で呼気ポートを塞ぎます)。
      注:気道内圧が~6秒以上で35cmH2Oピーク吸気圧に達すると、気道シールは十分に締まります。そうでない場合は、トラブルシューティングの説明を参照してください。
    3. 通常の呼気が再開されるのを待ちます。スキャンの合間や、スキャンをしていないときは~5分ごとにリクルート操作を行い、肺のコンプライアンスを維持し、無気肺を予防します。PEEPバルブを呼気ラインに接続します。PEEPを4 cmH2Oに設定し、その量だけピーク吸気圧が上昇するのを観察します。
    4. 挿管が成功したら、スキャン中に動物が目覚めないように、鎮静剤の再投与スケジュールに合わせてHP 129Xeの生産を計画し、初期化します。実験全体を通して体温をモニターします。
  2. データ取得:換気画像を収集します。
    注:データ取得ステップ2.4、2.5、および2.6は、任意の順序で実行できます
    1. エンドインスピレーションでのイメージングのために 、表2 に従って人工呼吸器をセットします。
    2. 次のセットアッププロトコルをロードします:陽子動物ローカライザー、マウス肺のガス周波数を中心とする単一パルス、および 129Xe動物ローカライザー。スキャン・パラメーターについては、 表 4 を参照してください。
    3. 動物をアイソセンタに配置し、胸腔が陽子局在化を伴う視野の中心にあることを確認します。単一周波数のコイルを使用している場合は、プロトンコイルを 129Xe-tunedRFコイルに交換してください。
    4. 129Xe偏光を記録し、MRIスキャナーに転送します。補足ファイル4:キセノン分極QAチェックリストを参照してください。
    5. 129Xeの袋をベンチレーターキャニスターに入れ、密封します。キャニスターをベンチレーターと一直線に接続し、キャニスターを加圧します(3〜6 psig)。
    6. 129Xeの機械換気を開始します。129Xeベンチレーションが作動するたびに、スキャンを開始する前に動物が~5回の呼吸を完了させて、肺の機能的残存容量をターンオーバーさせます。
      注:過分極ガスを節約するために、129回のXeスキャン間でN2 / O2混合物に切り替えます。
    7. 1 つのパルスを使用して、気体 129Xe の in vivo 共振周波数 (7 T で ~83.07 MHz) に一致するように動作周波数を調整します。周波数を後続のすべての気相129Xeスキャンにコピーします。129Xe ローカリゼーションを行い、肺がアイソセンタにあることを確認します。
    8. 129Xe ラジアル換気シーケンスをロードして実行します。ピーク吸気圧を監視します。
      注:プロトコールが完了する前に 129Xeガスがなくなると、ピーク吸気圧は急速に低下します。 129Xe の 400 mL バッグは、 129Xe を 70% で 80 回/分、10 mL/kg の理想的な体重で換気すると、30 g マウスを ~24 分間換気できます。
    9. スキャンが終了したら、N2/O2 混合物による換気に切り替え、 129Xeの空の袋を取り出します。
    10. 呼気終了時のイメージングでは、 表2 に従って息止め時間とトリガー遅延を変更し、手順2.4.2〜2.4.9を繰り返します。
    11. スキャナーから生データをエクスポートします。
プロトコルの短縮名シーケンスの説明トリガーTR (ミリ秒)TE (ミリ秒)繰り返しフリップ角度 (°)マトリックスサイズまたはNpts視野角 (mm2)RF帯域幅(kHz)スライス/スラブの厚さ (mm)スキャン時間
シングルパルスパルス取得(気相)随意10001602048101秒
動物ローカライザー2D GREはい501.716064232232560秒
ラジアルベンチレーション3Dマルチエコーラジアルはい20キャプションを参照13061322332.053016分
溶解相シングルパルスパルス取得(溶解相)いいえ8019051210.3580ミリ秒
溶解相動的仕様。パルス取得(溶解相)いいえ5010009051210.550秒
拡散加重2D GREはい12.28.144564232231.518分


表4: in vivo 配列パラメータ。 前述の3Dマルチエコー放射状換気シーケンス39 は、6エコー時間で画像を取得する。最初のエコー画像(TE = 1.12 ms、 図7)の結果を示します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル4:キセノン偏光QAチェックリスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

  1. データ取得:動的溶解相分光法を実行します。
    1. 息止め中のイメージングのために 、表2 に従って人工呼吸器を設定します。BRを100呼吸/分に設定します。手順2.4.2〜2.4.5のように 、129Xeの新しいバッグを準備します。
    2. 129Xeの機械換気を開始します。1 つのパルスをロードして実行し、ディゾルブ周波数 (7 T で ~83.084 MHz) に一致するように動作周波数を調整します。動作周波数を溶存位相動的分光法にコピーします。
      注:これは、野生型ヘモグロビン54を持つマウスのシングルピークになります。
    3. 動物の肺の溶解頻度を中心とした動的分光法シーケンスをロードして実行します。スキャンが終了したら、N2/O2 混合物による換気に切り替え、 129Xeの空の袋を取り出します。スキャナーから生データをエクスポートします。
  2. データ取得:拡散強調された画像を収集します。
    1. 息止め中のイメージングのために 、表2 に従って人工呼吸器を設定します。手順2.4.2〜2.4.7のように 、129Xeの新しいバッグを準備します。
    2. 拡散加重シーケンスを読み込んで実行します。スキャンが終了したら、N2/O2 混合物による換気に切り替え、 129Xeの空の袋を取り出します。スキャナーから生データをエクスポートします。

3. 実験のまとめ

  1. 動物を回収します。
    1. 挿管カニューレを動物の口からまっすぐ引き出します。動物がすぐに自発的に呼吸を始めない場合は、軽い胸骨圧迫を行ってください。可能であれば、動物の顔の近くに医療グレードの酸素を軽く流して、鎮静の回復をサポートします。
    2. 動物が自力で安定して呼吸するようになったら、動物が>2時間鎮静された場合は、脱水を防ぐために0.5〜1mLの生理食塩水を皮下に投与します。
    3. 動物を一人でケージに戻します。ケージをインキュベーターまたは加熱パッドの上に置きます。
      注:鎮静状態の動物は共食いに対して脆弱であり、完全に回復するまで(つまり、独立して歩き回る)まで、ケージメイトと一緒にケージに入れることはできません。鎮静剤を投与された動物は体温を調節できません。手の甲を使って、数分ごとに動物の体温を感じます。
    4. 動物が立ち直り反射に戻るまで(つまり、仰臥位から腹臥位に独立して反転できる)まで、動物を注意深く監視します。
    5. 動物が独立して歩行できるようになると、動物を熱サポートから外します。動物をケージの仲間と一緒にケージに戻します。
      注:ケージメイトがいない動物は、鎮静誘発性低体温症にかかりやすくなります。動物に予備の寝具を提供し、利用可能な場合は、動物をインキュベーターに一晩置いておきます。
    6. 動物の健康状態を監視するために、週に一度、2週間にわたって動物の体重を記録します。
      注:挿管により動物が口や食道に損傷を負った場合、食事をやめることがあります。動物が最初の体重の>20%を失った場合は、安楽死について獣医師に相談してください。
  2. 換気画像を解析します(図7)。
    1. 生データをプログラミングプラットフォームにロードします。非デカルト画像91のオープンソース再構築フレームワークをダウンロードしてください。
    2. オープンソースのフレームワークの指示に従ってイメージを再構築します。各放射状投影39上の最初の点を正規化する。
    3. 画像内の肺実質を、 129Xeシグナルが低いまたはまったくないボクセルを含むセグメント化します。大きな気道は含めないでください。画像内のバックグラウンドノイズをセグメント化します。肺、気道、画像アーティファクトを除外します。
      注:プロトンローカライザー画像は、実質境界の決定に役立ちます。
    4. 次の式を使用して SNR を計算します。
      figure-protocol-7(3)
    5. 換気不良を定量化します。
      注:小動物モデルにおける換気障害を定量化するために、さまざまな方法が提案されています。分析方法は依然として未解決の検討領域であるが、容易に実施できるアプローチには、(i)半定量的手動セグメンテーション92、(ii)気管からの信号を使用して実質信号を正規化するヒストグラムアプローチ47、および(iii)総肺活量(TLV)をセグメント化し、信号閾値(例えば、全肺平均の<60%)を定義して、肺を欠陥容積と換気肺活量(VV)に分割する。VDP 93,94 を次のように定量化します。
      figure-protocol-8(4)
  3. 溶存相動的分光法を解析します(図8)。
    1. 生データをプログラミングプラットフォームにロードします。高速フーリエ変換を実行し、スペクトルを位相化します(このアプリケーションには、スペクトルの同時手動ゼロ次位相化で十分です)。
    2. 標準的な核磁気共鳴(NMR)データ95,96を計算します:SNR、全幅半値、積分面積、化学シフト、および両方のピークの位相。
    3. 振幅データから、各繰り返しの溶解スペクトルの信号振幅をガススペクトルの信号振幅で除算して、時間の経過に伴う溶解とガスの比率を求めます。
  4. 拡散強調画像を解析します(図9)。
    1. 生データをプログラミングプラットフォームにロードします。ステップ 3.2.3 のように b0 画像の肺実質をセグメント化します。各 b 値イメージの SNR を計算します。
    2. 信号値対雑音比 SVNR0 は、 b0 イメージの各ボクセルの信号をイメージ ノイズの標準偏差で割ることにより計算します。SVNR0 <イメージ ノイズ97 の 2.5 倍のボクセルを除外します。
      注:SVNR0 は個々のボクセルメトリックであり、実質SNRは全肺メトリックです。
    3. 式 598,99 に従って、信号減衰を b 値 (bi) に合わせることにより ADC を計算します。
      figure-protocol-9(5)

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

換気イメージ

動物の準備と換気手順が適切に実施されていれば、吸気時または呼気時にデータ取得を行ったときに、3D放射状イメージングで換気パターンをうまく捉えることができます(図7)。これらの画像は何度も呼吸して収集されますが、ここで説明する方法は、人間で使用される 1 回の呼吸イメージング方法と似ています。これは、k空間のすべての線が呼吸サイクルの特定の時間(たとえば、すべてのエンド吸気)に収集され、累積的に1回の吸入を表す画像が作成されるためです。これらの画像では、主要な気道 (気管と気管支) がはっきりと見え、明らかな画像アーティファクトは存在せず、肺実質は高い SNR (初期偏光に応じて ~15 以上) で完全に膨らんでいるように見えます。直感に反しますが、吸気時に取得された画像(図7A、SNR = 15)は、呼気時に取得された画像(図7B、SNR = 27)よりも低いSNRを示します。これは、このマウスを換気するときに使用される適度な駆動圧力とゆっくりとした流れに関連しています。吸気画像としては、HPガスはまだ肺の実質に完全には洗い流されていなかったため、 129Xe(したがって信号)がより大きな気道に集中していました。この効果は、高気道信号がデータのダイナミックレンジを支配するため、画像再構成中のk空間スケーリングによって視覚的に悪化します。それにもかかわらず、大きな気道が省略されるように実質がセグメント化されている場合、分析は単純であるべきです。

figure-results-1
図7:以前に発表された方法を使用して取得した成体C57BL/6Jマウスの代表的な3D放射状換気画像39。 どちらの画像もSNRは比較的高いですが、(A)吸気の画像は(B)呼気の画像よりもSNRが低くなっています。これは主に 、129Xeガスがまだ肺に流れ込む時間がなかったためです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

病理学的に閉塞した換気と低SNRの他の原因を区別することが重要です。 図7Aでは、動物が健康な野生型マウスであったため、換気の障害は予想されません(つまり、VDPが低い)。換気が妨げられると、通常、 欠陥は 129Xe 信号が低いかまったくない領域として現れます。低信号の非病理学的原因には、一般的に次のものがあります。

(i) 129Xe 分極が低い: これにより、アーチファクトを伴わない肺実質および気道の SNR が低下します。低偏光は、通常、偏光手順の誤った実行、輸送中の脱分極、またはHP 129Xeデリバリーチューブの過剰なO2ガス含有量(誤って校正された人工呼吸器など)に起因する可能性があります。 

(ii)挿管カニューレが深すぎる: 気管に深く挿入されすぎると、カニューレが左右の気管支に偏向する可能性があります。十分にしっかりと固定されている場合、肺全体の一回換気量は少数の葉と気道のみに限定され、肺の残りの部分は何も受け取らない可能性があります。これが発生すると、過度に膨らんだ葉が損傷する可能性があり、動物を安楽死させる必要があるかもしれません。あるいは、カニューレの先端が組織に直接接触することもあります。この場合、 129Xeは主にカニューレの内部に限定されるため、目に見えるまっすぐなチューブからの明るい信号が得られ、実質内の信号は最小限に抑えられます。この場合、カニューレの位置を速やかに修正し、動物に苦痛の兆候がないか監視する必要があります(例:.、人工呼吸器と比較して異常な、存在しない、または非同期の胸の動き)。

(iii)挿管カニューレが浅すぎる: ガスのボーラスが中咽頭に浅すぎると、肺に流れ込むボーラスに対する抵抗は、カニューレの外側を流れて口から出るボーラスに対する抵抗よりも強くなる可能性があります。これにより、肺の膨張が悪くなる可能性があります。気管SNRは高いかもしれませんが、実質SNRは低くなります。データ取得中に気管を流れるガスにより、モーションアーチファクトが存在する可能性があります。アーティファクトの特性は、シーケンスタイプ(GRE、ラジアルなど)によって異なります。

(iv)誤った取得タイミング: 吸気または呼気ガスの流れの期間中にRFパルスとデータ取得が発生した場合、特にデカルトシーケンスを使用する場合、通常は深刻なモーションアーチファクトが発生し、実質SNRは低くなります。

(v)自発呼吸: データ取得中に動物が十分に鎮静されていない場合、自発的な呼吸運動は、機械的換気パターンの上に非同期的に重ね合わせられます。これにより、呼気から呼気までの 129Xe 送達が変動し、中等度から重度の運動アーチファクトが発生し、実質 SNR が低下します。鎮静剤の投与量とタイミングを注意深く追跡することが重要です。

(vi)動物の死亡: まれに、マウスが死亡する可能性があります(例:.、カニューレの位置が正しくない、O2 送達が不十分である、鎮静剤の過剰摂取、または重度の実験的病理が原因)。これが発生すると、肺組織は急速に硬化し、肺実質は不十分に膨らみます。上部気管は明るいままかもしれませんが、肺実質の信号は非常に低くなります。

ガス交換分光法

ヒト被験者では、分光法から導出されたパラメータ(例えば、信号強度、スペクトル幅、化学シフト、および位相)は、心肺動態および疾患状態に関する洞察を提供する52,53。ヒト86、イヌ100、およびラット20,101とは異なり、129Xe磁化が肺実質に限局しているときに得られたマウスの全肺スペクトルは、毛細血管膜組織、血漿、およびRBCs54に溶解した129Xeに対応する単一の広範な溶解相共鳴を示す(図8A、197ppm)。血流によってより遠位の組織に輸送されると、129Xeは、脂肪組織54、筋肉、灰白質、および白質102,103を含む様々な組織から明確な共鳴周波数を生じる。しかし、通過時間が比較的長く(数秒)、溶解度が控えめな104(オストワルド溶解度= 0.1 - 0.3)のため、これらの信号は通常弱く、専用の慎重な実験中にのみ観察されます。例外は、脂肪組織に溶解した 129Xe です(図 8A、189 ppm)。これらの組織から、129Xeシグナルが数秒以内に現れることがあります(例:動物のセットアップ中の最初の数回の呼吸で)。さらに、129Xeのオストワルド溶解度は、血漿よりも脂肪組織で約20倍大きいため、シグナル強度が高くなる可能性があります(つまり、37°C104でそれぞれ1.7対0.094)。縦方向の緩和時間も比較的長くなると予想される(in vivo T1は脂質105で~20秒であるのに対し、血液106では3-8秒)。その結果、脂肪組織からの129Xeシグナルは、他の組織と比較して比較的高くなる可能性があります。

シグナルダイナミクスが異なるため、129Xe分光法実験は、脂肪組織を調べる(例えば、褐色脂肪組織温度測定107を標的とする)または正しい取得パラメータを選択することにより、肺内のガス取り込みに合わせて調整することができる。表4に示す設定(TR=50 ms、溶存相ピークを中心とするフリップ角90°)で肺から129Xeスペクトルを取得すると、気相と溶存相の両方のピークが観察されます(図8A、B)。特に、マウス肺のガス量は組織体積の2〜3倍であり、この組織への129Xeの溶解度はわずか~104,108,109,110,111です。それにもかかわらず、ガス相の励起は大きく共振するため(7 Tで~15 kHz;図8B、SNR = 102 対 43)。したがって、気相の20倍から30倍大きい磁化プールは、呼吸サイクルの静的な部分におけるディゾルブフェーズ信号の安定した(すなわち、枯渇していない)リザーバーとして近似することができます。

~600 ms ごとに新たな磁化の息吹が入り、TR が 50 ms になると、気相と溶存相 129Xe の両方からの信号強度が振動します。ガス信号の場合、これは総ガス量の変化に起因します(つまり、吸気時に高く、呼気時に少なくなります)。インフレーション状態によってソースガスの磁化、T2*、毛細血管の血液量が変動する可能性があるため、溶解した信号の状況はより複雑になります。その結果、溶存とガスの信号振幅比も呼吸サイクルに対して振動します(図8C、平均溶存:ガス比= 1.9 ± 0.39)。

figure-results-2
図8:成人C57BL/6Jマウスの代表的な動的分光法 (A)単一のパルススペクトルは、気相の 129Xeから発信され、脂肪組織に溶解し(189 ppm)、毛細血管膜と血液組織の両方に溶解した(197 ppm)信号を示しています。(B)溶解した129 Xeと気体した 129Xe(繰り返し時間=50 ms)の時間変化する信号強度を示す動的分光法。視覚化を容易にするために、5 つのスペクトルのみが表示されます。時間軸上の対角線はスケールの区切りを表します。(C)2秒間隔での溶存信号とガス信号の振幅の比率(パネルBの赤いスケールのブレークに対応)は、呼吸サイクル(呼吸あたり0.6秒)による明確な変動を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

以下は、 129Xeガス交換分光法の結果を損なう可能性のある要因のリストです。いずれの場合も、SNRが低くなる可能性が高く、スペクトルフィッティングと結果として得られるメトリクス(溶存とガスの信号振幅比、化学シフト、スペクトル幅、位相など)が不正確になる可能性があります。

(i)動作周波数が間違っている:ガス量が大幅に多く、組織溶解度が低いため、ガス相周波数を中心としたRFパルスは溶解相信号を生成しません。RFパルスは、溶解した位相周波数またはその近くを中心とする必要があります。

(ii) 帯域幅が広すぎる: 励起帯域幅は、溶存信号とガス信号の振幅の比率を測定するために、一部の気相 129Xeが励起されるほど十分に広くなければなりません。しかし、帯域幅が広すぎると、励起パルスは組織に溶解する前に気相の磁化を破壊します。これは、パルスが溶存位相周波数を中心としているにもかかわらず、非常に高いガス信号と、溶存位相信号が低いかまったくないと見なすことができます。

(iii) 最適化されていない TR: Nyquist-Shannon サンプリング定理では、ブレス中の信号ダイナミクスを調べるために、信号をその周波数の少なくとも 2 倍でサンプリングする必要があります (ここでは、1 分あたり 100 ブレスが 50 ミリ秒ごとにサンプリングされ、1 ブレスあたり ~12 回サンプリングされています)。実験条件によっては、より速いサンプリングレートで心肺シグナルダイナミクスをさらに調査することが可能です。これらの実験の結果は、興奮帯域幅、呼吸数、心拍数など、多くの要因に依存します。キセノン交換時間(すなわち、キセノンが組織に溶解する時間;~56 ms54)および肺通過時間(すなわち、血液が右心室から左心室に流れる時間;~436拍/分112の心拍数に対して~830ミリ秒)も考慮する必要があります。サンプリングの頻度が高すぎると、磁化が早期に破壊され、信号が小さくなりますが、血流の影響も減少します。サンプリングの頻度を少なくすると、磁化がさらに溶解し、より多くの信号が蓄積されますが、血流への依存度が高くなり、肺胞のガス交換領域に局在しなくなります。

拡散強調画像

拡散強調画像は、肺胞空域のサイズを定量化するために使用され、従来の組織形態測定法98,113,114を通じて小動物モデルで厳密に検証されています。ここでは、2Dのスライス選択的イメージングに限定して、スキャン時間とガス使用量を最小限に抑えながら、以前に検証されたプロトコル98を一致させました。ADCの計算には最低2枚のb値画像で十分であり、高度な形態計測計算(平均線形切片など)には4枚以上のb値画像が必要です。複数のb値画像の取得は、計算の精度を向上させるという大きな利点を提供します。1回の息止めでヒトをイメージングするのとは異なり、前臨床では何度も呼吸をすることで、継続的に補充されたシグナルが得られます。このため、利用可能なHPガスの量と動物の鎮静時間によってのみ制限される、多くの高SNRb値画像を取得することが可能です。ここでは、129Xeガス400 mLを18分間のスキャン時間で使用し、それぞれSNR>15の7つのb値画像を取得しました(図9)。各画像の信号は、拡散勾配強度(b値)の増加とともに減衰します。この信号減衰は、肺内の129XeのADCに比例します。大きな気道は、b0 と b6 の画像を比較することにより、腺房組織と区別できます。解剖学的に気道が含まれている可能性が高い領域では、ピクセルは b0 画像では非常に明るく表示されますが、b6 画像では暗く表示されます (赤い矢印、図 9)。これらのピクセルは、肺実質の解析から除外する必要があります。

figure-results-3
図9:成人用C57BL/6Jマウスの代表的な拡散強調画像。 酸素で希釈された状態で 129Xeが自由に拡散する大きな気道(赤い矢印)は、肺実質に比べて信号の減衰が増加しています。これにより、b0 画像では気道が明るくなり、b6 画像では信号量が少ない気道が得られます。マウスとラットのADC値は、人間に比べて同様に小さいですが、値は年齢、潮汐量、圧力、拡散パラメータなどの生物学的および実験的要因に依存します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

この健康な成体野生型マウスのADCは、文献、年齢、SNR、取得パラメータなどに基づいて期待される結果に従います。ADCの結果の精度と確度に悪影響を与える可能性のある要因には、次のようなものがあります。

(i)SNRが低い:重要なのは、画像のSNRが低いと、ADCの計算が99,115の低い値に偏ることです。このため、SVNR0 <画像ノイズ97 の 2.5 倍のボクセルは除外します。

(ii)不適切なセグメンテーション: 不適切なセグメンテーション(品質管理のために目視検査を行わずに信号しきい値を使用するなど)は、結果を歪める可能性があります。画像にアーティファクト(動きによるものなど)が含まれている場合、それらはしきい値を超え、実質として誤って分類される可能性があります。さらに、大きな気道の近くのピクセルを除外することが特に重要です。これは、部分的な体積の影響により、ADCがより高い値に偏る可能性があるためです。

(iii)誤校正された人工呼吸器: 一般に、 129Xeを軽いガス(O2 やN2など)で希釈すると、ADCがより高い値にシフトする可能性があるため、定量的な比較には既知のガス混合物を使用した換気が必要です。 129Xe/O2 混合物で換気する場合、送達前に酸素濃度を上昇させると、T1 の緩和が促進され、ガス送達チューブの 129Xe磁化が減少するため、SNRが低下します。

(iv) 肺のリクルート解除: 麻酔をかけられ、機械的に換気された動物では、時間の経過とともに肺胞虚脱(無気肺)が発生する可能性があります。これが一定量の換気中に発生すると、同じ潮汐量が必然的に動員されたままの肺胞に再分配されます。中等度から重度の無気肺が発症すると、肺の残りの部分が過度に膨らみ、それらの領域で損傷やADCの増加を引き起こす可能性があります。定期的なリクルート操作とPEEPは、肺胞の虚脱を防ぎ、肺のコンプライアンスの低下を回避し、ADCの結果を歪める可能性のある肺損傷のリスクを最小限に抑えます。

(v)データフィッティングが不十分:ADC推定の方法を考慮する必要があります。対数線形フィッティングは最も計算効率が高くなりますが、低SNRイメージではバイアスが生じます。したがって、SNRの高い画像(>20)に最適です。重み付け線形法は、このバイアスを低減し、SNR > 15 の画像に適しています。ベイズ推定は、SNR<10でも不確実性の低いADCの推定値を得ることができますが、計算コストが高くなります99。

(vi)最適でない拡散時間:最適な拡散時間は、MRIスキャナーの最大勾配強度とマウスの腺房気道半径(半径~100μm49)の影響を受け、ヒトの約3倍です。最適な条件を確保するために、拡散時間は、平均歯槽半径よりも大きく、歯槽管の平均長さよりも小さい拡散長を達成するように設定されます。サイトスペシフィックな最大グラジエント強度の最適な拡散時間は、SukstanskiiとYablonskiy49によって概説された方法を使用して決定できます。最適でない拡散時間を使用すると、129Xe ADCが非線形に減少し、結果の解釈が複雑になる可能性があります。

(vii) 最適でない b 値: SNR の最大化と、b 値画像全体で生成されるコントラスト対ノイズ比 (CNR) の最大化との間にはトレードオフがあります。低いb値のみを使用してCNRが犠牲になると( つまり、図9の最初の3つのb値画像のみを取得するかのように拡散信号が減衰する)、ADCの推定は不正確になり、フィッティングが不十分になります。拡散の重み付けが強すぎると、結果として得られるSNRが不十分になり、ADCはより低い値にバイアスされます。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過分極 129Xe MRI は、小動物モデルで肺の微細構造と機能を研究するための洗練された強力な技術として浮上しています。このプロトコルは、HP 129Xeを使用したマウス肺の換気、拡散、およびガス交換を定量化するために必要な実験手順を説明し、初期部位の準備をガイドすることを目的としています。実験の主な前提条件には、129Xeガスファントムの確立と、高いガス分極が動物に確実に送達されることが含まれます。後者では、偏光パラメータの慎重な計画、ガス輸送中の偏光損失の軽減(例えば、磁気キャリングケースの構築)、および前臨床MRI磁石116,125のフリンジフィールド内でのT1緩和を特徴付ける(そして理想的には回避する)必要があります。必要なHP 129Xeインフラストラクチャの開発と並行して、堅牢な動物取り扱いプロトコルと手順を確立することが不可欠です。これには、堅牢な機械換気を可能にする効果的な鎮静法、縦断的研究を可能にする無害挿管、および高い129Xe磁化を提供する必要性と安全で生理学的に関連性のある換気条件とのバランスをとる換気戦略が含まれます。

ここで説明する方法、手順、および結果は、使用する特定のハードウェア(人工呼吸器、偏光子、MRIスキャナーの種類など)によってある程度異なります。代替機器が利用可能な場合、実験技術は比較的簡単に変更できます。さらに、日常の品質保証手順を最適化することができます(ステップ1.2、 図4、および 表1)。QAの~30分間の細心の注意を払って記録を保持することは、新しいサイトの設立時に重要です。これにより、ハードウェアの問題を早期に検出し、トラブルシューティング中にそれらを除外することができます。QAメトリクスの日々の変動が十分に特徴付けられたら、フリップアングルのキャリブレーションと~21分のQAスキャンを効率化するために縮小することができます。さらに、一般的なアプローチは、麻酔薬の投与量、人工呼吸器の設定、および取得パラメータを調整することにより、他の一般的な小動物種(ラットやウサギなど)に拡張できます。基本的なプロトコルは、呼吸数、呼吸量、PEEPレベルがガス交換や肺胞動員に与える影響など、人工呼吸器に依存する生理機能を調査するために使用できます。縦断的データが必要ない場合、または縦断的研究が完了した場合、挿管カニューレは、従来の分析(組織学や形態測定など)のための気管支肺胞洗浄または迅速な肺固定および収穫を可能にします。さらに、このプロトコルの変更の可能性は、MRIの配列とパラメータにまで及び、 129Xe MRI研究のダイナミックな側面を表しています。

カニューレの配置は、動物の安全と画質にとって重要です。挿管カニューレは、気管の周囲に縫合するなどしてしっかりと固定されていないため、比較的小さな変位(生理学的モニタリング機器を接続するときの動きなど)で、気管との気密シールが壊れる可能性があります。この気密シールは、肺のコンプライアンスを維持し、無気肺を予防するために重要なリクルート操作(~35 cm H2Oピーク吸気圧)に必要です。リクルート操作が目標圧力に達しない場合、研究者は研究目標のコンテキストで修正戦略を比較検討する必要があります (例: 拡散強調イメージングと換気イメージング、単一時点と縦断)。緩和戦略には、1)カニューレを取り外して再挿管する、2)挿入したままの状態で気管壁との接触を増やすためにカニューレの位置を調整する、3)気密シールを取得せずに実験を進める、などがあります。データの忠実性の観点からは、再挿管は最も堅牢なオプションですが、時間がかかり、望ましくない 129Xe磁化減衰につながる可能性があります。カニューレの位置の調整はより迅速ですが、怪我のリスクが高いため、慎重に行う必要があります。RMなしで実験を続けることは、マウスが<20分間換気され、肺動態の無気肺誘発性変化を避けるために最もよく使用される117。

安全な動物の取り扱いに対する明らかな必要性を超えて、堅牢で信頼性の高いHP 129XeマウスMRIプログラムを開発し、その課題をトラブルシューティングするための鍵は、細心の注意を払った記録管理です。HP 129Xeの生産では、レーザー出力、蓄積時間、流量、偏光を追跡することをお勧めします。ファントムイメージングや分光法では、画像のSNR、ピーク位置、スペクトル線幅、および90°のパルスを得るために必要なRF電力を記録するのが最善です。 in vivo イメージングでは、生理学的モニタリングパラメータ(ピーク吸気圧、体温など)と動物の取り扱いイベントの詳細なタイムラインとともに、同様のQAデータを記録する必要があります。いくつかの重要な機器を使用すると、人工呼吸器のトラブルシューティングが容易になります。これらには、O2 センサー、小動物用肺活量計、および換気とPEEP圧力を校正するための圧力計が含まれます。オシロスコープと電圧計は、人工呼吸器のタイミングが正確で、MRIスキャナーのゲーティングと一致していることを確認するのに役立ちます。最後に、ハンドヘルドガウスメーターは、輸送に必要な磁気キャリングケースの完全性を確認するために不可欠です。MRIシーケンスのトラブルシューティングに関しては、このプロトコルに記載されているガスファントムとHPガスで満たされたシリンジの両方を使用することをお勧めします。HP 129Xe ガスを含むシリンジの使用は、既知のグラウンドトゥルース、つまりシリンジ内の純粋な 129Xe の自由拡散係数を反映しているかどうかに基づいてデータの精度を評価できるため、拡散強調シーケンスのトラブルシューティングに特に有益です。

このプロトコルを適用する際には、いくつかの制限を認識する必要があります。まず、特殊な機器や専門知識に依存しているため、新しいサイトへのアクセスが難しくなります。しかし、近年の米国での臨床承認取得により、 129Xe MRIの能力を持つ施設は増加すると予想されています。また、この手法は、比較的短い分極寿命や迅速なデータ取得の必要性など、過分極ガスの固有の制限によっても制約されます。機械式人工呼吸器を使用すると、通常、画像のSNRが向上し、モーションアーチファクトが本質的に回避されますが、自由呼吸ガス供給デバイスを使用することでキャプチャできる自然な呼吸ダイナミクスが隠されます。さらに、このプロトコルを使用した小動物モデルからの知見は、ヒトの生理学に外挿する際には、有意な種の変動を考慮して慎重に解釈する必要があります。また、経口挿管や人工呼吸器は、体重が25g未満のマウスでは難しいという課題があります。これは、専用の機器と手順が使用されない限り、~8 週未満の男性と ~20 週未満の女性を除外する場合があります。このプロトコルの最も明白な制限は、パルスプログラミングと高度な画像再構成技術がないことです。このような方法を一般化されたプロトコルに含めることは、その複雑な技術的詳細と専門知識のために実用的ではありません。最後に、このプロトコルでは、SNR、VDP、ADCなどの基本的な定量的指標について説明しますが、局所フラクショナルベンチレーション、拡散形態計測、ガス交換イメージングなどのより高度な測定値は説明しません。これらの高度なメトリックは、ここで説明する基本的なインフラストラクチャが設定されると、より簡単に実装できます。

HP 129Xe ガス MRI は、小動物のリソースを大量に消費し、実験的に困難ですが、前臨床肺研究を大幅に前進させる可能性を秘めています。これは、地域の換気、肺胞空域のサイズ、およびガス交換のダイナミクスを定量化するための低侵襲で高感度の手段を提供します。そのため、肺の生理機能、疾患の進行、および治療介入を経時的に評価するための独自の手段を提供できます。したがって、これは、組織学、生化学的分析、イオン化イメージングモダリティ、侵襲的肺力学測定などの従来の前臨床技術よりも改善されています。さらに、小動物 129Xe MRIは依然として活発に発展している研究分野であり、関連するイメージング物理学と前臨床要件とのバランスをとることは、それ自体が大きな研究機会を表しています。最後に、臨床 129Xe MRIが広く受け入れられ、臨床で使用されるようになるにつれて、マウスからヒトへのトランスレーショナル研究やバックトランスレーショナル研究の機会は時間とともに増え続けるでしょう。

補足図1:磁気キャリングケースの回路図。 エナメル銅線で作られたソレノイドL1は、12ボルトの充電式密閉型鉛蓄電池であるV1と並列に接続されています。抵抗R1の抵抗は、V1とL1を流れる電流を制御するために選択できます。パネルインジケータLEDランプR2とD1もV1と並列に配線されています。トグルオン/オフスイッチS1は、V1と直列に接続されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:窒素の人工呼吸器の校正結果。 30回の呼吸からの体積出力は、トリプリケートで測定されました。線形回帰を実行して、関連するガス量を生成するために必要な駆動圧力を決定しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:人工呼吸器の圧力設定チートシート。 各ガスの線形回帰による傾きと切片の結果は、式 S1 で使用されます。この式は、70% N2 + 30% O2 および 70% 129Xe + 30% O2 のガス混合物に対して、適切な動物の体重で 10 ml/kg の理想的な体重の潮汐量を生成するために必要な駆動圧力を決定するために使用されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peter Niedbalskiは、Polarean Imaging, Plcのコンサルタントです。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、人工呼吸器製造の指針となるジェリー・ダルクに心から感謝します。HP 129Xeガスを醸造してくれたCarter McMasterに感謝します。また、Matthew Willmering博士とJuan Parra-Robles博士の示唆に富む科学的な議論に感謝します。BioRender.com で作成されたフィギュア。この研究は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)から資金提供を受けました(助成金番号:NHLBI R01HL143011、R01HL151588)

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
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ガラス容器(ファントム)エースガラス8648-24https://aceglass.com/results.php?t=8648-24&t=8648-24
暖房パッドオフィスデポ9206211    ピュアエンリッチメント ピュアリリーフエクスプレスデザイナーシリーズ加熱パッド12 x 15パームアクア - オフィスデポ
超偏光子Polarean9820https://polarean.com/xenon-mri-platform/
挿管ボードHallowell EMC000A3467
https://hallowell.com/product/rodent-tilting-workstand/ 挿管用品他の場所で公開されている部品リストNAhttps://app.jove.com/t/50318/a-simple-method-of-mouse-lung-intubation
同位体濃縮キセノンシリンダーリンデ同位体 XE-129(1%)N2(10%)HE CGMP 302SZNA
液体窒素LindeNI LC160-22https://www.lindedirect.com/store/product-detail/nitrogen_n2_nitrogen_liquid
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Minivent 人工呼吸器ハーバード大学装置73-0044 https://www.harvardapparatus.com/minivent-ventilator-for-mice-single-animal-volume-controlled-ventilators.html
マウス イヤー パンチャーフィッシャー scientific13-812-201https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-animal-ear-tag-punch/13812201
マウス舌圧子医療ツールVRI-617https://medical-tools.com/shop/rodent-tongue-depressor.html
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プランジャーバルブ エースガラス8648-20https://www.aceglass.com/results.php?t=8648
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肺活量計ADInstrumentsFE141https://www.adinstruments.com/products/spirometer
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キセノン偏光測定ステーションPolareanNAhttps://polarean.com/xenon-mri-platform/
ファントム

参考文献

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