方法論記事

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

DOI：

10.3791/66930

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2024年7月5日

 ,  ,  ,  , 
1University of Waikato, 2ArcticZymes Technologies ASA

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、核酸代謝酵素をアッセイするためのプロトコールを、リガーゼ、ヌクレアーゼ、およびポリメラーゼ酵素の例を用いて提示する。このアッセイでは、蛍光標識および非標識オリゴヌクレオチドを組み合わせて、RNAおよび/またはDNAの損傷または経路中間体を模倣した二本鎖を形成することができ、酵素の挙動の特性評価を可能にします。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

商業ベンダーからさまざまな修飾合成オリゴヌクレオチドが利用できるようになったため、核酸代謝酵素の多様な特性を特徴付ける洗練されたアッセイの開発が可能になり、標準的な分子生物学研究室で実行できます。蛍光標識の使用により、標準的なPAGE電気泳動装置と蛍光対応イメージャーを使用する研究者は、放射性物質を使用したり、放射性物質の保管と調製のために設計されたラボ(ホットラボ)を必要とせずに、これらの方法にアクセスできるようになりました。リン酸化などの標準的な修飾をオプションで追加することで、アッセイのセットアップを簡素化でき、DNA損傷や中間体を模倣する修飾ヌクレオチドを特異的に組み込むことで、酵素の挙動の特定の側面をプローブすることができます。ここでは、市販の合成オリゴヌクレオチドを用いた酵素によるDNAプロセシングのいくつかの側面を調査するアッセイの設計と実行を実証します。これには、リガーゼが結合する能力やヌクレアーゼが異なるDNAおよびRNAハイブリッド構造を分解する能力、DNAリガーゼによる補因子の異なる使用、および酵素のDNA結合能力の評価が含まれます。合成ヌクレオチド基質を設計する際に考慮すべき要素について説明し、さまざまな核酸リガーゼ、ポリメラーゼ、およびヌクレアーゼ酵素アッセイに使用できるオリゴヌクレオチドの基本セットを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての生命体は、複製、転写、DNA修復などの基本的な生物学的プロセスを実行するために核酸処理酵素を必要とします。これらの経路の主要な酵素的機能性は、RNA/DNA分子のコピーを生成するポリメラーゼ、ポリヌクレオチド基質を結合するリガーゼ、それらを分解するヌクレアーゼ、および核酸二本鎖を溶かしたり、そのトポロジーを変化させたりするヘリカーゼとトポイソメラーゼです1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 .さらに、これらの酵素の多くは、クローニング、診断、ハイスループットシーケンシングなどのアプリケーションに不可欠な分子ツールを提供します11,12,13,14,15。

これらの酵素の機能特性、速度論、および基質特異性は、オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって産生される標識DNA/RNA基質を用いて決定できます。基板および製品の追跡は、伝統的に、5'鎖端のいずれかに放射性標識(32P)を導入することによって達成され、これはその後、写真フィルムまたは蛍光体イメージングシステム16,17によって検出することができる。放射性標識基質は、実験感度の向上という利点を提供し、ヌクレオチドの化学的性質を変化させないが、放射性同位元素を扱うことによる潜在的な健康被害は、DNAおよびRNA検出のためのより安全な代替手段を提供するための非放射性核酸標識の開発を促進している18,19,20.これらの中で、直接蛍光検出、時間分解蛍光、エネルギー移動/蛍光消光アッセイなどの蛍光検出は、最も汎用性の高いアッセイとして際立っています21,22,23,24。広範な蛍光色素の配列により、各オリゴヌクレオチド25上に独自のレポーターを特徴とするDNA/RNA基質の異なる設計が可能になります。さらに、蛍光色素の安定性は、放射性同位元素と比較した場合、ユーザーは蛍光標識されたDNA基質を大量に生成し保存することができる19。これらの蛍光色素標識基質は、目的のタンパク質とインキュベートし、金属およびヌクレオチド補因子のさまざまな組み合わせとともに、結合活性や酵素活性を解析できます。結合または活性の可視化は、ゲルイメージングシステムを備えたさまざまな蛍光色素チャネルを使用して観察できます。この手法では蛍光標識されたオリゴヌクレオチドのみが見えるため、標識されたオリゴヌクレオチドのサイズの増減を容易に追跡できます。ゲルは、その後、核酸染色色素を使用してゲル上に存在するすべてのDNAバンドを視覚化することもできます。

ポリ核酸リガーゼは、DNA/RNAの断片を結合する酵素であり、5'リン酸化DNA末端とDNAの3'OHとの間のホスホジエステル結合の形成により、切断のシーリングを触媒します。それらは、ヌクレオチド基質の要件に応じて2つのグループに分けることができます。高度に保存されたNAD依存性リガーゼはすべての細菌に見出され26、構造的に多様なATP依存性酵素は、生命の全ての領域を通じて同定することができる8,27。DNAリガーゼは、複製中の岡崎フラグメントプロセシングに重要な役割を果たすとともに、自発的な傷や修復後に残る傷の封鎖を通じて、ヌクレオチドや塩基除去修復などのさまざまなDNA修復経路に関与しています8,10。異なるDNAリガーゼは、二本鎖のニック、二本鎖切断、ミスマッチ、ギャップ、ならびにRNAおよびDNAハイブリッド28,29,30を含む、DNA切断の異なるコンフォメーションを結合するさまざまな能力を示す。オリゴヌクレオチドを5'リン酸でアニーリングすることにより、多様な結合性基質を組み立てることができ、核酸二本鎖31,32,33に並置された5'末端と3'末端を生成します。最も一般的な分析方法は、エンドポイントアッセイ形式での尿素PAGEによる分離です。しかし、最近の技術革新には、ハイスループットを可能にするキャピラリーゲル電気泳動34、質量分析プロファイリング35、および時間分解モニタリング36を可能にする均質分子ビーコンアッセイの使用が含まれる。

ライゲーション反応の最初のステップは、アデノシン三リン酸(ATP)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)によるリガーゼ酵素のアデニル化であり、共有結合酵素中間体が得られます。反応の第2ステップは、ニック部位の5'末端の核酸基質のアデニル化であり、続いて核酸ニック鎖のライゲーションが行われます。 大腸菌 で組換え発現する多くのリガーゼ酵素は、アデニル化形態で精製されるため、ヌクレオチド補因子を添加することなく核酸をうまくライゲーションすることができます。これにより、核酸のライゲーションに必要な特定のタイプのヌクレオチド補因子を決定することが困難になります。DNAリガーゼ活性を評価するためのアッセイについて説明するだけでなく、非標識基質を用いて酵素を脱アデニル化することにより補因子の使用量を確実に決定する方法も提示されます。

ヌクレアーゼは、DNA/RNA修飾酵素および触媒RNAの大規模で多様なグループであり、核酸間のホスホジエステル結合を切断する37。ヌクレアーゼ酵素の機能は、DNAの複製、修復、およびRNAプロセシングに必要であり、DNA、RNA、またはその両方に対する糖特異性によって分類できます。エンドヌクレアーゼはDNA/RNA鎖内のホスホジエステル結合を加水分解し、一方、エキソヌクレアーゼはDNA/RNA鎖を3'または5'末端から一度に1ヌクレオチドを加水分解し、DNA38の3'末端から5'末端または5'末端から3'末端のいずれかから加水分解することができる。

多くのヌクレアーゼタンパク質は非特異的であり、複数のプロセスに関与している可能性があるが、他のタンパク質は特定の配列またはDNA損傷に対して非常に特異的である6,39,40。配列特異的ヌクレアーゼは、クローニング、突然変異誘発、ゲノム編集など、幅広いバイオテクノロジー用途で使用されています。これらのアプリケーションのための一般的なヌクレアーゼは、制限ヌクレアーゼ41、ジンクフィンガーヌクレアーゼ42、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、そして最近では、RNA誘導改変CRISPRヌクレアーゼ43である。最近、損傷特異的なヌクレアーゼが同定されており、例えばEndoMSヌクレアーゼは、ミスマッチ特異的なRecB様ヌクレアーゼドメイン5,44を通じてDNAのミスマッチに対して特異性を有する。ヌクレアーゼ活性アッセイは、歴史的に、放射性標識基質を用いた不連続アッセイとして行われてきました。しかしながら、それらの他の欠点に加えて、これらは、蛍光標識基質45,46を使用する場合に可能なヌクレアーゼタンパク質によって切断された部位の同定を可能にしない。最近では、さまざまな状態でDNAと相互作用するさまざまなDNA色素を使用して機能する連続ヌクレアーゼアッセイが開発されました。例えば、dsDNAと相互作用するとき、その非結合状態よりも高い蛍光シグナルを放出するか、または短いRNAに特異的に結合する47。他の連続ヌクレアーゼアッセイでは、5'にフルオロフォア基、3'末端にクエンチャーを持つDNAヘアピンを使用し、フルオロフォアとクエンチャー48の分離によりオリゴヌクレオチドが分解されるにつれて蛍光が増加するようにします。これらのアッセイでは、DNA分解タンパク質の動態を特徴付けることができますが、酵素の機能と基質に関する事前の知識が必要であり、また、DNAコンフォメーションを変化させて色素結合に違いを引き起こす酵素に限定されます。このため、個々のヌクレアーゼ産物を分離するエンドポイントアッセイは、タンパク質活性によって引き起こされるDNA修飾に関する洞察を得るために依然として望ましいです。

ここでは、新規ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、およびリガーゼ酵素の活性を試験するための基質を生成するために混合および適合させることができる蛍光標識DNA/RNAオリゴヌクレオチドの設計に関する詳細な手順を示します。このオリゴヌクレオチド配列の基本セットの検証により、実験デザインが簡素化され、特注の基質を大量に購入することなく、幅広い酵素機能の経済的なプロファイリングが容易になります。DNAリガーゼ活性の例を用いて、これらの基質を用いて標準的なDNAプロセッシング酵素アッセイを実行するための詳細な手順が提供され、ヌクレアーゼおよびポリメラーゼ酵素をアッセイおよび分析するための修飾が説明されている。さらに、DNAリガーゼ酵素の補因子特異性を高精度で決定するための修正アッセイが提供され、二重標識プローブを使用して多成分ライゲーションの集合が評価されます。最後に、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によって同じ基質とのタンパク質-DNA相互作用を決定するために使用できるようにするための基本的なアッセイフォーマットの変更について説明します。

プロトコル

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1. オリゴヌクレオチドの設計と購入

注:一本鎖オリゴヌクレオチドを設計し、アセンブルして目的の二本鎖にアニーリングします。二本鎖中の1本以上の鎖は、目的の酵素によるオリゴヌクレオチドプロセシングを追跡するための蛍光部分を有していなければならない。さまざまな活動に対してアセンブルできる一本鎖配列の基本セットを 表1に示します。

  1. 以下に説明するように、目的の酵素に必要な特定の修飾を組み込みます。
    1. DNAリガーゼ基質(図1)の場合:3つのオリゴヌクレオチド(5'リン酸化ドナー鎖(NL2)、5' FAM標識アクセプター鎖(NL1)、および2つを架橋する補体(NL3)から最も単純な基質を組み立てます。
      1. ステップ2で基質マスターミックスを組み立てる前に、結紮可能なニックの5'末端を提供するストランドがリン酸化されていることを確認してください。これをNL2の修飾として注文するか( 表1を参照)、またはオリゴヌクレオチドを再懸濁した後、T4ポリヌクレオチドキナーゼによる酵素的リン酸化を使用してください。
      2. 図1A(NL6/NL7およびNL8/NL9)に示されている二本鎖切断の補体を含むNL6およびNL8の5'末端リン酸化を含む、これは制限エンドヌクレアーゼから産生される天然基質に最も近い。二重標識基板を使用して、マルチパートアセンブリのライゲーションの相対的な範囲を決定します(ステップ6を参照)。
      3. 補数ストランドを変更して、ミスマッチ (NL10) とギャップ (NL11) を生成します。
        注意: 単純な傷のある基板のバリエーションを 図1Aに示します。他のシーケンスを使用して、下線の位置を変えることにより、さらに広い範囲の不一致またはより長いギャップを生成することができます。
      4. RNAオリゴヌクレオチドの代わりにDNAオリゴヌクレオチドを添加します。
        注:単純な傷のある基板のバリエーションを 図1Bに示します。より広範なDNA/RNA二本鎖は、例えば、RNAとDNAの両方を含む二本鎖切断を生成するために、ここで与えられた基底セットの追加の組み合わせによって生成することができる。このバリエーションの例を、デュアルラベル方式を使用する以下のステップ 6 に示します。
    2. DNAポリメラーゼ基質の場合: 表1 にリストされているオリゴヌクレオチドNL1およびNL3を組み立てて、簡単なプライマー伸長アッセイを行います。NL1(プライマー)またはNL3(テンプレート)鎖に修飾を導入することにより、ポリメラーゼ活性のさらなる側面を調査します。
      1. 損傷した塩基類似体を位置20の前にNL3オリゴヌクレオチドに組み込み、テンプレート鎖上の損傷した病変を回避する能力を判断します。
      2. 損傷した塩基アナログをNL1オリゴヌクレオチドの20位に組み込み、損傷したプライマーを伸長する能力を判断します。
      3. 二本鎖でRNL1またはRNL3のいずれかを使用して、RNAプライマーの伸長またはRNAテンプレートの使用を調査します。
    3. ヌクレアーゼ基質(図2)の場合:オリゴヌクレオチドをアセンブルして、非網羅的な範囲の二本鎖および一本鎖基質(図2Ai)、フラップおよび拡散した接合部(図2Aii)、および損傷した基質(図2B)を生成します。
      1. リボヌクレアーゼ活性を調べるには、NL1、NL2、NL3をRNL1、RNL2、RNL3に繰り返し置換します。HJ5およびHJ6の追加のRNAバージョンを使用して、このセットをさらに拡大します。
      2. 酸化的損傷を模倣する修飾が中央に配置されたオリゴヌクレオチド、非塩基性修復中間体、または脱アミノ化生成物であるオリゴヌクレオチドMD5、MD6、およびMD9を使用してください(図2B)。基板は、この位置でのストランドの切断を検出します。補体NL3鎖をTAMRAなどの直交蛍光色素で標識し、二本鎖切断を検出します(ステップ6を参照)。
      3. 補体の直交標識を使用して、プローブ(NL5およびND9)と補体(MD10およびNL10)の両方のストランドの不一致部位での二本鎖切断を検出します。
  2. 関連する蛍光色素やその他の修飾を組み込んだ合成オリゴヌクレオチドを商業ベンダーに注文してください。
    注:100 nMの合成スケールおよび合成後のHPLC精製は、記載されているアッセイに適しています。

2. 核酸二本鎖の組み立てとアニーリング

  1. オリゴヌクレオチドの再懸濁と希釈
    1. 開封する前に、凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを2 mLチューブに入れ、卓上型遠心分離機で2〜5分間全速力で遠心分離し、核酸がチューブの底にあることを確認します。
    2. オリゴヌクレオチドをTEバッファー(10 mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)、1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA))に再懸濁することにより、100 μMのマスターストックを調製します。オリゴヌクレオチドが、穏やかなボルテックスと短時間の遠心分離を全速力で繰り返して、完全に再懸濁されていることを確認します。
    3. 10 μM ストックを調製するには、マスターストックのアリコートを TE バッファーで希釈します。表2に示すように、10 μMのストックを超純水(MQ水)で希釈して、 0.5 μM、0.7 μM、または2.5 μMの濃度のワーキングストックを調製します。
  2. 反応マスターミックスの組み立てとアニーリング
    1. ワーキングストックを使用して、 表2 に示す組み合わせと 表3に示す容量を使用して反応マスターミックスを調製します。標準的なDNAリガーゼアッセイおよびここで説明する他のほとんどのアッセイでは、最終的な緩衝液組成は50 mM Tris pH 8.0、50 mM NaCl、10 mMジチオスレイトール(DTT)、10 mM Mgを二価カチオンとします。
    2. PCRチューブまたは微量遠心チューブ内で、加熱ブロックまたはサーモサイクラーを使用して95°Cで5分間加熱することにより、オリゴヌクレオチドをアニーンします。室温で30分間(容量<1 mL)から1時間(容量>1 mL)冷まします。.オリゴヌクレオチド(>40 nt)を長時間使用する場合は、95 °Cから25 °Cの下降ランプを持つサーモサイクラーを使用して45分間ゆっくりと冷却するか、アニーリング混合物の入ったチューブを沸騰水の入った1 Lビーカーに浮かべて室温まで一晩冷却します。
    3. ヌクレオチド補因子およびその他の熱に弱い緩衝成分を、室温まで冷却した後、マスターミックスに加えます。最終反応混合物を酵素を添加してアッセイに直接使用するか(下記のステップ3を参照)、または将来の使用のために-20°Cで保存してください。

3. 標準アッセイセットアップ

  1. アッセイ反応の組み立てと開始
    1. 目的の基質マスターミックス22.5 μLと、PCRチューブ内のDNAリガーゼまたは他の目的酵素2.5 μLを組み合わせます。反応を重複または三重に実行し、特に結果が定量化される場合はなおさらです。
    2. アッセイサンプルにタンパク質なしコントロール(バッファーのみ)を含めます。必要に応じて、この時点では補因子コントロールを含めないでください。
      注:酵素は50% v/vグリセロール中に-20°Cで保存できるため、溶液から直接ピペットで移すことができます。グリセロールを含む酵素溶液は、添加する前に、ピペッティングで混合するか、穏やかなボルテックスで混合することにより、十分に混合されていることを確認してください。
  2. 直ちに反応液を25°CのPCR装置に移し、30分間インキュベートします。酵素活性の最適条件に応じて、温度と持続時間を変えます。
  3. ローディング色素(95%ホルムアミド、0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ブロモフェノールブルー)5 μLを加えて反応を急冷し、95°Cで5分間インキュベートします。

4. アッセイ結果の解析

  1. トリス-ホウ酸-EDTA(TBE)-尿素PAGEゲルを以下のように調製します。
    1. 20%アクリルアミド、7 M尿素、および1x TBE溶液のストックを調製します。ここで説明するオリゴヌクレオチドセットについては、アクリルアミド/ビス溶液を29:1の比率で使用して、最適な分離を実現します。
    2. 1つのゲルについて、10 mLの20%アクリルアミドと7 M尿素溶液を100 μLのAPS(10%)および3 μLのテトラメチルエチレンジアミン(TMED)と組み合わせ、ゲルキャスターでキャストします。
  2. ゲルが固まったら、45〜55°CのTBE尿素ゲルでサンプルを分析します。
    1. ゲルを1x TBEバッファーで30分間、ゲルあたり10mAで外部加熱して予備分析します。
    2. パスチャーピペットを使用して1x TBEでフラッシングすることにより、ゲルのウェル内の余分な尿素を除去します。
    3. 各反応を10μL負荷し、外部加熱で10mAで1.0〜1.5時間運転します。
  3. イメージャーでゲルを可視化し、選択した蛍光色素に適した設定で行います。FAMの場合、495/519 nmで励起/発光を与えるフィルターセットを使用します。これは、ほとんどのイメージャーにプリセットとして保存されています。
  4. イメージャを備えた画像処理ソフトウェア、またはImageJ49,50などの外部プログラムを使用して、製品と基板のバンド強度を定量化し、次の式を使用して製品のパーセンテージを計算します
    データ分析におけるパーセンテージの計算に使用される比率式 P/(P+S)×100。
    ここで、 P は製品バンドの積分値、 S は基板バンドの積分面積です。DNAリガーゼ反応の例の場合、生成物バンドは40ヌクレオチド(nt)で、基質バンドは20ntで実行されます。

5. 補因子特異性をテストするためのDNAリガーゼの脱アデニル化

  1. 反応マスターミックスの調製
    1. 表4に記載されているように、FAM標識NL1オリゴヌクレオチドを含むマスターミックスを1セット調製します。表4に示すように、NL1オリゴヌクレオチドを含むFAM標識のない2番目のセットを調製します。
    2. これとは別に、両方のDNA二本鎖を95°Cで5分間加熱し、25°Cで30分間から1時間冷却します。 どちらのマスターミックスにもヌクレオチド補因子を添加しないでください。
  2. 脱アデニル化反応の組み立てと開始
    1. 試験する補因子の種類/濃度ごとに、10 μLの非標識マスターミックスと2.5 μLのリガーゼ酵素を組み合わせて、1回の脱アデニル化反応を準備します。
    2. 補因子コントロールなしおよびタンパク質コントロールなしとして追加のチューブを準備します(酵素の代わりに2.5 μLのバッファーを添加)。
    3. 酵素の最適活性に特異的な温度で反応を1〜2時間インキュベートします。酵素がまだアデニル化されている場合は、インキュベーション時間を長くすることができます。
  3. 補因子でライゲーション反応を実行します。
    1. 標識マスターミックス10 μLと目的のヌクレオチド補因子(ATP、NAD、ADP、GTPなど)2.5 μLを脱アデニル化反応(最終濃度0.1-1 mM)に直接添加します。
    2. 2.5 μLの反応バッファーを無塩基補因子コントロールに加えます。
    3. 反応を以前に使用したのと同じ期間および温度でインキュベートします。ステップ 4 の説明に従って、クエンチと視覚化を行います。

6. スプリントライゲーションまたはマルチパートアセンブリのための二重標識基板の使用

  1. すでに使用されている蛍光色素とは異なる励起/発光スペクトルを持つ蛍光部分を持つオリゴヌクレオチドを設計し、購入します。
    1. ここで説明するセットアップでは、3'末端に5-カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)を持つNL2(TAMRA)オリゴヌクレオチドを使用します(表1)。
  2. 以下に説明するようにマスターミックスを組み立てます。
    1. ステップ2で説明した反応の成分(アセンブリで使用されるすべてのオリゴヌクレオチドの等モル比、バッファーおよび二価カチオンなど)を組み合わせます。
    2. 95°Cで5分間加熱し、25°Cで30分間-1時間冷却してアニールします。補因子と酵素を添加し、ステップ3で説明したようにインキュベートします。
  3. ステップ4で説明したように、基板中の蛍光色素ペアの適切なチャンネルを使用してサンプルを泳動し、イメージングします。FAMおよびTAMRAの場合、これらはほとんどのイメージャーに存在するフルオレセイン(FITC)およびテトラメチルローダミン(TRITC)チャネルです。

7. 天然ゲル上の電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によるDNA結合の評価

  1. 以下に説明するように、10%ネイティブTBE PAGEゲルを調製します。
    1. 2.5 mLの40%アクリルアミド、10x TBE1 mL、100 μLの10% APS、3 μLのTMED、および6.5 mLのMQ水を混合し、ゲルキャスターにキャストします。
  2. 以下に説明するように結合反応を組み立てます。
    1. EMSA基板を 表5 に従って組み立て、EDTA(10 mM)が含まれ、金属イオンが省略されるようにします。
    2. 20 μL の EMSA 基質マスターミックスと 5 μL のタンパク質を PCR チューブで組み合わせます。タンパク質コントロールなしのサンプルを含めてください。25°Cで30分間インキュベートします。
  3. 以下に説明するように、ネイティブ電気泳動による分析を行います。
    1. 5x ネイティブローディング色素 (100 mM EDTA、0.25 % ブロモフェノールブルー、25% v/v グリセロール、MQ 水 1 mL まで) 5 μL をサンプルに加えます。
    2. 調製したゲルに負荷をかけ、60Vで2〜3時間運転し、染料の前面がゲルの端から数cm上になるまで水循環で冷却します。
    3. ステップ4の説明に従ってゲルを視覚化および分析します。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNAリガーゼによるライゲーション
DNAリガーゼの酵素活性は、尿素PAGEゲル上で可視化すると、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドのサイズの増加をもたらします。 表2にリストされているDNAライゲーションとRNAライゲーションの両方の基質の場合、これは20 ntから40 ntへのサイズの倍増に相当します(図3A)。最適な酵素活性は、温度、タンパク質濃度、またはインキュベーション時間(図3B)ヌクレオチド補因子、金属補因子(図3C)などの条件を変更することによって決定できます。異なる基質上のリガーゼの相対的な活性は、並行して比較することができます(図3D)。

製品および基質バンドの定量は、ライゲーションされた総基質の割合として表され、 図3に示すように、酵素の比活性を評価したり、二価の陽イオン選好、温度、pHなどの最適な活性を決定したりするために使用できます。

細菌性DNAリガーゼDV-1-1-Lig(図3)は、DNA基質のニックおよびミスマッチをライゲーションすることができ、マグネシウムとマンガンの両方をライゲーション活性に利用することができ、マグネシウムを優先的に用います。この酵素のさらなる詳細は、51に記載されている。

DNAポリメラーゼによるプライマー伸長
蛍光標識プライマー20 ntの伸長によるDNAポリメラーゼ活性は、ここに示すオリゴヌクレオチドセットを使用すると、最大40 ntのサイズ増加をもたらします(図4A)。部分的に拡張された商品は、テンプレートのサイズまで商品のはしごとして表示されます(図4Bおよび図4C)。ここに示されているプライマー伸長アッセイ(図4C)により、プライマー鎖が完全に合成されました。

ヌクレアーゼによる分解
ヌクレアーゼ活性は、尿素PAGEゲル上で可視化すると、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドのサイズの縮小をもたらします。特定のエンドヌクレアーゼ活性を持つヌクレアーゼは、単一の20 nt製品をもたらす可能性があります(図5A-C)。エキソヌクレアーゼ活性を持つヌクレアーゼは、さまざまなサイズの蛍光標識オリゴヌクレオチドをもたらします(図5D-F)。ここでは、細菌の南極メタゲノムヌクレアーゼタンパク質の結果が示されており、これは二本鎖非塩基性部位基質上に特異的なエンドヌクレアーゼ活性を示し、一本鎖基質上に非特異的なエキソヌクレアーゼ活性を示します(それぞれ図5Cおよび図5F)。

リガーゼ脱アデニル化およびヌクレオチド補因子使用アッセイ
多くの組換え発現リガーゼ酵素は、宿主51,52,53,54,55から回収されたATPまたはNADから、すでにアデニル化された状態で精製されます。この共有AMP中間体の除去は、酵素が核酸基質51のライゲーションに使用できるヌクレオチド補因子の範囲を正確に同定するために必要である。外因性ヌクレオチド補因子の非存在下での非標識基質を有するアデニル化リガーゼ酵素の代謝回転は、アデニル化中間体を枯渇させる。蛍光標識DNA基質を使用し、第2ステップのみでヌクレオチド補因子を添加することにより、ゲルイメージャーで蛍光チャンネル(フルオレセイン-FITC)を使用したときに見えるライゲーション産物は、このステップでヌクレオチド補因子を添加したアデニル化の結果です。

大腸菌システムで発現した細菌DNAリガーゼを用いてセットアップした活性アッセイは、それがプレアデニル化形態で精製され、追加の補因子なしでニックDNAをライゲーションするバックグラウンド能力を示したことを示しています(図6Ai-ii)。アデニル化リガーゼへのATPの添加は、反応で形成されるライゲーション生成物の量を増加させますが、この基礎活性が広域スペクトルの補因子の使用の誤った印象を与えるか、反応へのヌクレオチド補因子のさらなる追加が基質のライゲーションを阻害する可能性があるため、これは常に信頼できるわけではありません。最初に、リガーゼを非標識のニックDNA基質とインキュベートすることにより、AMPを裏返し、ATPを反応に添加しない限り、標識DNAニック基質にライゲーションは観察されません。第2の活性アッセイ(図6B)は、脱アデニル化DNAリガーゼがATPおよびADPの添加によりNick DNA基質上のライゲーション活性を改善することを示しています。また、GTPの追加によりライゲーションに若干の改善が見られ、これは非補因子コントロールで見られるバックグラウンドライゲーションよりも優れています。NADとの反応で観察されるライゲーションは、補因子制御なしの反応で見られるライゲーションに匹敵し、NADがライゲーションの補因子として除外されます。

デュアルラベルアッセイの結果
直交するフルオロフォアは、複雑な基質のさまざまな部分で活性を確立するために使用できます。 図7 の例は、スプリントしたDNA/RNA二本鎖上のT4 DNAリガーゼと比較した、最近報告されたDNAリガーゼR2D56 の活性を示しています。基質のRNAドナー部分へのDNAアクセプターのライゲーションは6-FAMを使用して検出され、RNAアクセプターのDNAドナーへのライゲーションは5-TAMRAを使用して検出されました(図7A)。RNA基質の両端に対するDNAライゲーションの相対的な範囲は、6-FAMチャネルと5-TAMRAチャネルの両方に蛍光を発する製品バンドが存在することで評価でき、これは複合画像では黄色で表示され、個々の6-FAMチャネルと5-TAMRAチャネルはそれぞれ緑色と黄色で表示されます(図7B)。以前の論文56で詳述されているように、R2DリガーゼのみがDNAをRNAの5'末端にライゲーションすることができたが、一方、両方のリガーゼはDNAをRNAの3'末端にライゲーションすることができた。単一反応混合物で両方のDNA分子をRNAにライゲーションすると、R2Dリガーゼは、バンドが上方に移動し、色が黄色に変化することが観察されるため、DNAオリゴをRNAの両端にライゲーションできます(図7C)。

図8の2番目の例では、デュアルラベリングアプローチを使用して、異なるpHでの複数のオリゴヌクレオチドのライゲーションを示しています。7つのオリゴヌクレオチドの混合物から組み立てられた基質を使用して、R2Dリガーゼが短いフラグメントを組み立てる能力を示しました。5'鎖にはFAM蛍光色素で標識された14 nt鎖があり、補体鎖には16 ntオリゴヌクレオチドの3'末端にTAMRA蛍光色素があります。ライゲーションの成功は、FAM(緑)オリゴとTAMRA(赤)オリゴのより高いバンドを追加することで確認できます。両方の蛍光色素が重なっているため、黄色のヌクレオチドバンドは、同じサイズの完全にライゲーションされた鎖として得られます。

EMSAを用いたDNAリガーゼ酵素からのDNA結合結果
DNAリガーゼ酵素がリン酸化されたニックDNAに結合すると、オリゴヌクレオチド単独よりも高い分子量で走る複合体が生じます(図9A)。ここでは、細菌のATP依存性DNAリガーゼのニックDNA基質への結合が示されています。高タンパク質濃度では、標識されたDNA基質の大部分が結合し、高分子量バンドに見られます。タンパク質濃度が低いと、遊離DNA基質が優勢になります(図9B)。

DNA/RNAリガーゼ基質図;ニック、鈍い、まとまりのある、ミスマッチ、ギャップ。RNA-DNAハイブリッド鎖。
図1:リガーゼ酵素活性の試験用に設計されたさまざまな核酸基質の概略図。 星は、5'末端(5' FAM)の6-カルボキシフルオレセインによるラベリングを表しています。標識鎖は黒または濃い青/赤(DNA/RNA二本鎖の場合)の線で示され、基質二本鎖の標識されていない部分は灰色または水色/赤(DNA/RNA二本鎖の場合)の線で示されます。標識されたストランドは20 ntで、ストランドがライゲーションされると、40 ntの製品を形成します。5'リン酸化部位は、円の中のPで示されます。オリゴヌクレオチド鎖には標識が付けられており、その名称は 表1 および 表2で参照されています。(A)DNAリガーゼの酵素活性をテストするために使用される、さまざまな種類の切断を持つ二本鎖DNA基質の設計。(B)DNAおよびDNAおよびRNAオリゴヌクレオチドを組み込んだRNA/DNA二本鎖基質の設計。基質には単一のニックサイトが含まれており、RNA/DNA二本鎖のニックブレークをシールするリガーゼの能力をテストするために使用されます。赤い線はRNAオリゴヌクレオチドを表し、青い線はDNAオリゴヌクレオチドを表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

DNA基質図:ヌクレアーゼ、修飾、損傷。タイプ:Ds、Ss、テール、フラップ、スプレイ。ベースの不一致。
図2:ヌクレアーゼ酵素活性の試験用に設計されたさまざまな核酸基質の概略図。 星は、5'末端(5' FAM)の6-カルボキシフルオレセインによる標識を表しています。ラベル付きストランドは黒線で示され、基板デュプレックスのラベルされていない部分は灰色の線で示されます。5'リン酸化部位は、円の中のPで示されます。オリゴヌクレオチド鎖には標識が付けられており、その名称は 表1 および 表2で参照されています。(A)二本鎖および一本鎖部分を持つ基板の設計。(B)二本鎖DNA基質の設計は、3'または5'末端(Flapped 3'、フラップ5'、またはフラップされた両端(spered))で一本鎖フラップを生成するように変更されます。(C)損傷した塩基またはミスマッチを中央位置に組み込んだ二本鎖基板の設計。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

DNAライゲーションプロセス、PAGEゲル分析;酵素-基質相互作用、電気泳動の結果。
図3:細菌ATP依存性DNAリガーゼDV-1-1-Ligのライゲーション活性の試験 (A) TBE尿素PAGEゲルで結果を分析したDNA基質上のリガーゼ活性の酵素アッセイの概略図。星は、5'末端(5' FAM)の6-カルボキシフルオレセインによる標識を表しています。ラベル付きストランドは黒線で示され、分析中に見えないサブストレートデュプレックスのラベルされていない部分は灰色の線で示されます。(B)異なる時点での傷ついたDNA上のDV-1-1-Ligによるライゲーションの定量化。各基質に対する活性は、二重に行った。反応液を異なる時間(0.5時間、1時間、2時間、3時間、4時間)で25°Cでインキュベートし、最終タンパク質濃度4 μM、最終ATP濃度1 mM、マグネシウムイオン最終濃度10 mMでインキュベートしました。(C)ニックDNA基質をマグネシウム(Mg)またはマンガン(Mn)でライゲーションする。反応は、25°Cで3時間、最終ATP濃度1 mMおよび最終金属イオン濃度10 mMで行いました。(D)異なるDNA基質上でのライゲーションの結果。反応は、最終タンパク質濃度2 μM、ATP最終濃度1 mM、マグネシウム最終濃度10 mMで、20°Cで8時間行いました。反応へのタンパク質の付加は、プラス記号(+)で示されます。制御反応はCで示され、含まれているタンパク質の不在はマイナス記号(-)で示されます。製品(40 nt)と基板(20 nt)は赤い矢印で示しています。活性アッセイの結果は、イメージングシステムを使用して視覚化されました。バンドは、ImageJソフトウェア49 を使用して強度の統合によって定量化され、グラフ化ソフトウェアを使用してグラフを生成した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

DNAポリメラーゼ反応図;変性PAGEゲル;製品分析、DNA伸長プロセス。
図4:DNAポリメラーゼアッセイ (A)DNA基質上のプライマー伸長アッセイの概略図。星は、5'末端(5' FAM)の6-カルボキシフルオレセインによる標識を表しています。ラベル付きストランドは黒線で示され、分析中に見えないサブストレートデュプレックスのラベルされていない部分は灰色の線で示されます。(B)ヌクレオチドの添加により標識プライマーの長さが増加することを示す、予想されるTBE尿素PAGEゲル結果の概略図。(C) 大腸菌 KlenowフラグメントDNAポリメラーゼ酵素によるプライマー伸長の例。反応へのタンパク質の付加は、プラス記号(+)で示されます。レーン1、12.5 U;レーン2、2.5 U;レーン3、1.25U。制御反応はCで示され、含まれているタンパク質の不在はマイナス記号(-)で示されます。反応を 25 °C で 15 分間行い、5 mM MgCl2、50 mM Tris pH 8.0、50 mM NaCl2、1 mM DTT、および 0.25 mM dNTP を含んでいました。製品(40 nt)と基板(20 nt)は赤い矢印で示しています。活性アッセイの結果は、イメージングシステムを使用して視覚化されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

DNA切断分析、PAGEゲル図;温度効果、イオン衝撃;酵素活性の可視化。
図5:異なる基質、金属、およびインキュベーション温度を使用した細菌の南極メタゲノムヌクレアーゼの活性の試験(A)非塩基性部位(xで示される)上のヌクレアーゼタンパク質の概略特異的エンドヌクレアーゼ活性。星は、5'末端(5' FAM)の6-カルボキシフルオレセインによる標識を表しています。黒い線は標識されたDNA鎖を表し、灰色の線は標識されていないDNA鎖を表します。ヌクレアーゼによる特異的な切断は、非塩基性部位の右側に示されていますが、左側にも発生する可能性があります。(B)マイナス記号(+)で示されるヌクレアーゼの存在下で、マイナス記号(-)で示されるタンパク質の非存在下での未切断基質(40 nt)および切断された製品(20 nt)を示す変性尿素PAGEゲルの概略図。(C)非塩基性部位を有する二本鎖DNA基質上の特異的エンドヌクレアーゼヌクレアーゼ活性の結果を示すTBE尿素PAGEゲルの一例。アッセイは、タンパク質濃度1.0μMおよび1mMのMgCl2で実施しました。20°Cで、タンパク質を含まない反応(ウェル1)と金属を含まない反応(ウェル2)の2つの対照反応を行いました。反応液を、ゲル画像の上に示されているように、1°Cから50°Cに上昇する温度で5時間インキュベートしました。タンパク質の付加はプラス記号(+)で示され、タンパク質の不在はマイナス記号(-)で示されます。基板と製品は赤い矢印で示されています。(D)一本鎖基質上のヌクレアーゼタンパク質の非特異的エキソヌクレアーゼ活性を示す模式図。星は、5'末端(5'FAM)に6-カルボキシフルオレセインで標識することを表しています。黒い線は、ラベル付けされたストランドを表します。ヌクレアーゼを非特異的に切断すると、さまざまな長さの標識鎖(<39 nt)が得られます。(E)タンパク質が添加されていない未切断の基質(40 nt)を示す変性尿素PAGEゲルを表す模式図(−)、およびタンパク質が添加されたさまざまな長さの切断基質を示す(+)非特異的エキソヌクレアーゼの活性に起因する可能性のあるもの。(F)TBE尿素PAGEゲルは、一本鎖基質を有する同じ南極メタゲノムヌクレアーゼの非特異的エキソヌクレアーゼ活性の例を示す。アッセイは、タンパク質の最終濃度を1.5 μM、金属イオンの最終濃度を10 mMにして、20°Cで4時間実施しました。使用する金属イオンは画像の上に記載されています。タンパク質の付加はプラス記号(+)で示され、タンパク質の不在はマイナス記号(-)で示されます。基板(40 nt)は赤い矢印で示され、長さの異なる製品は赤いクランプで示されています。すべてのヌクレアーゼ反応の結果をイメージングシステムを用いて可視化しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ライゲーション効率チャートとゲル分析、ATPと補因子の影響、DNAリガーゼ活性の結果。
図6:細菌DNAリガーゼのアデニル化および脱アデニル化バージョンによるニックDNA基質のライゲーション結果 (A) i) ATPの有無にかかわらず、アデニル化および脱アデニル化リガーゼ酵素によるライゲーションの定量化。グラフ上の点は、各反応の反復の平均を表します。標準のエラーバーが含まれています。ii)ATPの有無にかかわらず、アデニル化および脱アデニル化リガーゼ酵素によるnick DNA基質へのライゲーションの結果を示すTBE尿素PAGEゲル。反応はトリプリケートで行った。脱アデニル化酵素を、非標識Nick DNA基質および0.1 μM酵素を用いて25°Cで2時間プレインキュベートした後、標識Nick DNA基質を用いて1時間インキュベートしました。アデニル化酵素は、非標識基質と事前にインキュベートされていませんでした。ATP(1 mM)を反応液に加え、標識DNA基質を添加しました。(B)i)異なる補因子(ATP、NAD、ADP、およびGTP)を持つNICK DNA上の脱アデニル化リガーゼによるライゲーションの定量化。グラフ上のポイントは、各濃度の平均を表します。標準偏差のエラーバーが含まれています。ii) リガーゼによるライゲーションの結果を示すTBE尿素PAGE(異なる補因子の添加の有無にかかわらず)。各基質に対する活性は、二重に行った。反応液を、標識されていないニックDNA基質、4 μMタンパク質、および5 mMマグネシウムイオンを用いて25°Cで2時間プレインキュベートした後、標識されたニックDNA基質、5 mMマグネシウム、および異なる補因子を最終濃度1 mMで添加して4時間インキュベートしました。反応へのタンパク質の付加は、プラス記号(+)で示されます。タンパク質を含まない対照反応(コントロール、C)または補因子を含まない反応(補因子なし)を使用しました。製品(40 nt)と基板(20 nt)は赤い矢印で示しています。活性アッセイの結果は、イメージングシステムを使用して視覚化されました。バンドは、ImageJソフトウェア49を使用して強度の統合によって定量化されました。グラフは、グラフ作成ソフトウェアを使用して生成しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

FAM/TAMRA標識を用いたDNAライゲーション解析 図、ゲル結果、PAGEゲルチャート、リガーゼ活性
図7:DNAテンプレートによって配置された5'リン酸化RNAオリゴの両端への短い蛍光標識DNAオリゴヌクレオチドのライゲーション(A)DNAスプリントしたDNA-RNAライゲーションの概略図で、デュアルラベリング戦略を使用してライゲーション産物を可視化する方法を示しています。(B)2つのチャンネルで画像化されたUrea-PAGEゲルで見られると予想される可能性のある製品の概略図。(C)デュアルフルオロフォアライゲーションの実験結果。ライゲーション反応は、T4 DNAリガーゼとR2Dリガーゼを使用して試験しました。どちらも、DNAがRNAの5'末端(レーン2-4)または3'末端(レーン5-7)にライゲーションされた単離反応、または両方のDNAオリゴヌクレオチドが同じ反応混合物でライゲーションされた1回の反応(レーン8-10)で行われました。タンパク質コントロールなし(NPC)は酵素を添加していませんでした。この例で使用されている反応条件と特定のオリゴヌクレオチドは、56で示したものと同じです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

pHレベルにわたるライゲーション効率を示す電気泳動結果によるDNAライゲーション図。
図8:異なるpHの3つのR2Dバリアントによる複数の短いオリゴヌクレオチドセグメントのライゲーション(A)マルチパートライゲーション戦略の概略図。(B)マルチパートアセンブリのpH依存性を示す代表的なゲルを、FAMチャネルとTAMRAチャネルの両方でイメージング。レーンCは酵素制御なし、レーン1-3 pH 6.0、レーン4-6 pH 6.5、レーン7-9 pH 7、およびレーン10-12 pH 7.5。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

タンパク質濃度の低下に伴うタンパク質-基質結合の変動を示す電気泳動図とゲル結果。
図9:EMSAの結果。 DNA基質上のATP依存性DNAリガーゼ(南極のMcMurdo Dry Valleysのメタゲノムデータに由来)の結合活性を可視化する電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)の概略図およびネイティブTBE PAGEゲル。(A)ニックDNA基質上のDNAリガーゼによるEMSAs/DNA結合活性の模式図。結合結果は、非変性TBE PAGEゲル上で可視化されます。リガーゼ酵素に結合したDNA基質はゲル内をゆっくりと移動しますが、酵素を含まない基質はより速く移動するため、ゲル上に可視化されるバンドサイズ(黄色のボックス)がシフトします。基質が非変性ゲル上で可視化されると、オリゴヌクレオチドはアニーリングされたままになり、FAM標識鎖(黄色の星)が遊離基質と結合基質の両方に存在できるようになります。タンパク質濃度勾配を使用して、最適な結合のためのタンパク質濃度を決定できます。(B)ネイティブTBE PAGEゲル上でのEMSAの可視化、異なるタンパク質濃度でのATP依存性DNAリガーゼのニックDNA基質への結合能力を示す。この酵素を、ニックDNA基質とともに25°Cで30分間インキュベートし、最終ATP濃度1 mMおよびEDTA40 mM でインキュベートしました。3つの異なるタンパク質濃度(5.5 μM、2.3 μM、および1.5 μM)を使用しました。反応液は、10% ネイティブ TBE ゲルで行い、反応液にネイティブローディング色素を使用しました。タンパク質を含むサンプルは、タンパク質濃度が異なるトリプリケートで使い果たされました。コントロールレーンには、1 mMのニックDNA基質、最終ATP、およびEDTAが含まれていますが、タンパク質は含まれていません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:アッセイ基質の構築に使用されるDNA基質オリゴヌクレオチド配列。 損害は太字と下線で示しています。最終的なデュプレックスの不一致とギャップの位置には下線が引かれています。略語:5' 6-カルボキシフルオレシエン(5' FAM)、8-オキソ-デオキシグアノシン(8OxodG)、非塩基性テトロヒドロフラン(dSpacer)。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:さまざまな酵素アッセイのマスターミックスのアセンブルに使用されるオリゴヌクレオチドの組み合わせ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表3:最大4つのオリゴヌクレオチドを含むアッセイマスターミックスのセットアップ。 さまざまなアッセイ基質に使用するオリゴヌクレオチドの組み合わせについては 表2 を、反応条件の詳細についてはテキストを参照してください。少なくとも、標識されたオリゴヌクレオチドが必要です-二本鎖の追加部分は括弧で示されます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表4:ニックDNA二本鎖を作製するための標識および非標識マスターミックスの成分。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表5:デュプレックスのさまざまな組み合わせに対するEMSAマスターミックスのセットアップ。 さまざまなEMSA基質に使用するオリゴヌクレオチドの組み合わせについては 表3 を、反応条件の詳細についてはテキストを参照してください。EMSA基質は、活性アッセイ用と同じオリゴヌクレオチドを使用して設計されています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プロトコルの重要なステップ
オリゴヌクレオチドの設計と購入:二本鎖形成用のオリゴヌクレオチドを購入する際には、配列設計を考慮することが不可欠です。オリゴ分析装置ツールを使用して、GC含量、融解温度、二次構造、二量体化電位などのヌクレオチド配列の特性を予測することをお勧めします57。

核酸二本鎖のアセンブルとアニーリング:RNA/RNA-DNA二本鎖を調製する際は、RNaseを含まない試薬や水を使用するか、RNAse阻害剤を添加することでRNase汚染を防ぐように注意する必要があります(ただし、調査対象の酵素自体がRNAseでない場合)。機器、手袋、およびベンチスペースは、オリゴヌクレオチド58の分解を避けるために、マスターミックスを組み立てる前にRNase除染溶液で処理する必要があります。RNAオリゴヌクレオチドのマスターストックは、コンタミネーションの場合に備えて、より小さなバッチで補うことができます。

DNAリガーゼは、常に0.1〜1 mMの最終濃度のヌクレオチド補因子(ATPまたはNAD)を必要とします。DNAポリメラーゼは、鎖合成にdNTPを必要とし、これらは通常、それぞれ50 μMの等モル比で添加されます。リガーゼおよびポリメラーゼ二本鎖のマスターミックスを調製する場合、ATP、NAD、dNTPなどのヌクレオチド補因子は、混合物が加熱され室温まで冷却された後にマスターミックスに添加する必要があります。

オリゴヌクレオチドをアニーリングするための10倍バッファーには、半減期が短いDTTを添加する必要があり、理想的には使用前に新鮮または冷凍で調製する必要があります。10xバッファーの小さめのアリコートは、事前に調製して4°Cで保存し、使用前にDTTを添加することができます。

オリゴヌクレオチドストックとマスターミックスは、長期使用のために-20°Cで保存し、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドまたはミックスをホイルで包んで、蛍光色素の光退色を防ぐ必要があります。オリゴヌクレオチドの完全性を損なう可能性のある凍結融解サイクルの繰り返しを避けるために、少量(>1 mL)を調製して使用することをお勧めします。

アッセイのセットアップと結果の解析:アッセイ結果を正しく解釈するためには、コントロールを含めることが不可欠です。ノンタンパクコントロール(DNA基質と緩衝液)を使用して、基質上の見かけの活性が酵素の結果であることを確認する必要があります。ヌクレアーゼの場合、外因性基質の分解により低分子量バンドまたは制御不能なラダーが発生しますが、リガーゼまたはポリメラーゼの場合、不完全な二本鎖変性により、制御に高分子量バンドが生じます。予想される製品のサイズをポジティブコントロールすることは 表2 に示されており、正しい製品サイズを確認するために含める必要があります。

アッセイ産物の電気泳動を成功させる際の重要なパラメータは、以前のプロトコル59に記載されている。これには、アクリルアミドの割合が基質のサイズに適していることを確認することや、基質のサイズと結果の視覚化に必要なゲルの種類に応じて適切なローディング染料を使用することが含まれます。トラッキング色素ブロモフェノールブルーは、10塩基オリゴヌクレオチドとほぼ同じサイズで動作するため、ここで説明するオリゴヌクレオチドセットに適しています。しかし、より短いヌクレオチドを使用するときに蛍光生成物または基質バンドと重なる色素のバンドがある場合、トラッキング色素はキシレンシアノールに交換されてもよい、これはよりゆっくりと流れる60。

基質/製品バンドの良好な分解能を確保するために、ゲルタンクはウォーターバスを使用して外部から加熱するか、高電圧(180Vなど)を動作させることによって行う必要があります。尿素PAGEゲルを少なくとも30分間事前に実行し、ピペットでウェルを洗い流して余分な尿素を除去することは、定量に適したシャープでまっすぐなバンドを得るために不可欠です。

基質および製品の定量化では、蛍光ゲルバンドの正確な統合を可能にするために、全材料の20%〜80%の範囲を製品に変換する必要があります。新しい酵素をアッセイする場合は、タンパク質濃度のグラジエントを実行して、この範囲で後続の測定が行えるようにすることをお勧めします。多くの蛍光イメージャーには、この目的に使用できるバンド統合機能が組み込まれています。ImageJ49などの外部プログラムを使用する場合は、ゲル画像がtiff形式で高品質でエクスポートされていることを確認してください。

技術の変更とトラブルシューティング
オリゴヌクレオチドの設計と購入:このプロトコールで提供されるオリゴヌクレオチドは有用な出発点であり、メソッドのセクションで提案されているように、オリゴヌクレオチド配列を変更し、修飾を組み込むことで拡張できます。

標準的なアッセイのセットアップと結果の分析:最適な反応条件は異なるタンパク質間で異なるため、新しい酵素の活性をテストする際にはパイロット実験が不可欠です。このプロトコルで指定されているパラメータは、開始点としてのみ意図されています。酵素濃度、反応温度、インキュベーション時間、補因子、バッファーの組成/pHなどの要因は、マスターミックスおよびアッセイ反応アセンブリ中に変化させることができます。補因子の濃度は、ヌクレオチド補因子または金属イオンのいずれかが過剰になると阻害性になる可能性があるため、特に重要であり、それぞれの濃度の範囲をテストすることをお勧めします。DNAポリメラーゼの場合、推奨されるdNTP濃度は合計20〜200μMの範囲ですが、高濃度のdNTPはフィデリティを低下させます61。同様に、ポリヌクレオチドリガーゼは、典型的には0.1〜1.0mMのヌクレオチド補因子でアッセイされるが、過剰な濃度は蓄積されたDNAをアデニル化し、反応阻害を引き起こす62。

ここでの標準的なプロトコルでは、二価カチオンとしてMgを使用します。ただし、一部の酵素はマンガン(Mn)または亜鉛(Zn)に対してより活性があります。MnまたはZnを含むマスターミックスは、低pHの緩衝液(<7.5)で調製し、加熱後に金属を添加する必要があります。マスターミックスは、沈殿物や酵素活性の阻害を避けるために、同じ日に使用する必要があります。.

ポリエチレングリコール(PEG)のようなクラウディング剤やウシ血清アルブミンのような安定剤を含む添加物は、いくつかの酵素の活性を増大させるために使用することができる63,64。これらは、熱性があるため、アニーリングステップの後に追加する必要があります。生物学的に由来するすべての試薬は、汚染されたヌクレアーゼの導入を避けるために、分子生物学グレードである必要があります。

このプロトコールで使用されるホルムアミドクエンチバッファーの容量は、オリゴヌクレオチドの基底セットに適しています。ただし、オリゴヌクレオチドを長くするには、ホルムアミドの容量を10 μLから20 μLに増やして、鎖を完全に分離し、急冷した反応を氷上でスナップ冷却し、電気泳動まで4°Cで保存することができます。

一部の酵素では、タンパク質の基質/生成物への緊密な結合により、電気泳動中、特に酵素を高濃度で使用する場合、オリゴヌクレオチドのゲルへの移動が妨げられる場合があります。これは、ゲル上の製品/基質バンドの欠如、および多くの場合、ウェル内の蛍光物質(タンパク質と複合体化された製品および/または基質)の蓄積として現れます。これらの複合体を破壊するために、クエンチバッファーを添加する前にアッセイ混合物をプロテイナーゼKで処理するか、クエンチング中にドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を添加することができます。

DNAリガーゼ活性は2つの個別のバンドを生成し、簡単に定量できます。同じ方法を使用して、単一の20ヌクレオチド生成物が予想されるDNA損傷基質上のエンドヌクレアーゼ活性を定量化したり、結合状態と非結合状態が明確に区別されるEMSAアッセイを定量することができます。ポリメラーゼおよびプロセシブヌクレアーゼ活性の正確な定量は、バンドインテグレーションでは困難であり、一般に、序論で説明したように、プローブまたはビーコンを用いたリアルタイムアッセイを使用することが推奨されます。

DNAリガーゼの脱アデニル化と補因子特異性:このプロトコルの最適化は、ヌクレオチド補因子の添加により回復するすべてのバックグラウンド活性を除去するために必要になる場合があります。脱アデニル化(非補因子制御におけるライゲーションとして見られる)後もバックグラウンドリガーゼ活性が残っている場合、脱アデニル化ステップのインキュベーション時間を長くするか、リガーゼの濃度を低下させることができます。ラベルのないDNAニックデュプレックスがタンパク質(> 4:1::substrate:protein)よりも濃縮されていることを確認してください。標識DNAの存在下で補因子を添加しても、試験した補因子のいずれについてもライゲーションが回復しない場合は、酵素が変性している可能性があり、脱アデニル化ステップを短縮する必要があります。新しいリガーゼまたは新しい組換え酵素のバッチの場合、追加のヌクレオチド補因子がない場合に、アデニル化酵素によるバックグラウンドライゲーションの程度を決定することが有用です。これには、10 μLの非標識マスターミックス、10 μLの標識マスターミックス、および2.5 μLの脱アデニル化されていない新鮮酵素を同時にインキュベートする別の反応を設定することが含まれます。

二重標識基板を使用します。 このプロトコルでは、最初に使用された蛍光色素とは異なる励起/発光スペクトルを持つ蛍光部分を持つオリゴヌクレオチドの設計と購入、次にこれを二本鎖に組み立てて、2つの直交する蛍光色素が基質の異なる部分を標識する必要があります。疑わしい場合は、FPbase Spectra ViewerやBD Spectrum Viewerなど、励起スペクトルと発光スペクトルのチェックに利用できるオンラインスペクトルビューアが多数あり、これらを使用して蛍光色素ペアの適合性と最適なイメージャ設定の両方を確認できます。ゲルの視覚化に使用される特定の設定は、イメージャーのモデルと使用する蛍光色素によって異なります。合成画像は、両方のチャネルからのシグナルを単一のゲルに記録し、両方の蛍光色素が同じ製品に結合しているバンドが中間色として表示されます。個々のチャンネルからの別々の画像を分析して、示差標識されたストランド上のライゲーションまたは分解の程度を定量化できます。

手法の制限事項
蛍光標識基板の取り扱いには、健康被害の少なさなど多くの利点がありますが、これらのタイプの標識基板の取り扱いには、考慮しなければならないいくつかの制限があります。その1つは、これらのオリゴヌクレオチドに蛍光色素標識や損傷塩基の追加などの修飾を施して注文するコストが、社内の放射性標識と比較して比較的高いことです。もう一つは、標識されたストランドの検出には、特殊な想像装置とソフトウェアが必要であることです。しかし、これらの機能は現在、ほとんどの新しいゲルイマジネーションシステムに含まれています。また、蛍光色素が標的相互作用タンパク質の結合特性を変化させる可能性も考慮する必要があります。フルオレセインとその誘導体FAMは、オリゴヌクレオチドの標識に一般的に使用され、pHの変化および核酸塩基消光65に敏感です。これらの制限は、デュプレックス設計のためのオリゴヌクレオチド上の蛍光色素の種類と配置を決定する際に慎重に考慮する必要があります。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEGとURは、R2Dリガーゼを販売するArcticZymes Technologies ASの従業員です。AW、ER-S、RSは競合する利害関係はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AWは、ラザフォードディスカバリーフェローシップ(20-UOW-004)によってサポートされています。RSは、ニュージーランド ポスト南極奨学金 の受給者です。SGとURは、ノルウェー北極大学トロムソ化学研究所の技術サポートに感謝しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
30% アクリルアミド/ビス溶液 (29:1)BioRad1610156
アデノシン三リン酸 (ATP)多くの供給者
過硫酸アンモニウム (APS)多くの供給者
ベンチトップ遠心分離機多くの供給者
ホウ酸塩多くの供給者
ブロモフェノールブルー多数サプライヤー
ジチオスレイトール (DTT)多くのサプライヤー
循環水浴付き電気泳動システム多くのサプライヤー
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)多くのサプライヤー
蛍光イメージャー、例えば iBright FL1000サーモフィッシャーサイエンティフィックA32752
ホルムアミド多数サプライヤー
ゲルキャスティングシステム多くのサプライヤー
加熱ブロック多くのサプライヤー
塩化マグネシウム多くのサプライヤー他の金属イオンは、研究されたタンパク質に応じて好まれる場合があります
マイクロ遠心チューブ(1.5 mL)多くのサプライヤー
マイクロピペットとヒント多くのサプライヤー1 mL、0.2 mL、0.02 mL、0.002 mL
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)多くのサプライヤー
オリゴヌクレオチド統合 DNA テクノロジーNAサーモフィッシャー、シグマ-アルドリッチ、 Genscriptなどもこれらの
牧草地ピペット多くのサプライヤーPCR
サーモサイクラー多くのサプライヤーPCR
チューブ多くのサプライヤーRNAse
離れてサーモフィッシャー7002PKRNAオリゴで働く場合にのみ必要ですRNase離れ
てメルク83931-250MLRNAseの除去のための界面活性剤表面の汚染
RNAseフリー水ニューイングランドバイオラボB1500LRNAオリゴを扱う場合にのみ必要
塩化ナトリウム多くのサプライヤー
SUPERase IN RNase 阻害剤サーモフィッシャーサイエンティフィックAM2694ブロードスペクトラム RNAse インヒビチル(タンパク質ベース)
SYBR ゴールドサーモフィッシャーサイエンティフィックS11494これは、ゲルをポストステインし、非標識オリゴヌクレオチドを視覚化するために使用できます
テトラメチルエチレンジアミン(TMED)多くのサプライヤー
トリス、またはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン多くのサプライヤー
超純水(Milli-Q)メルク
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参考文献

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