方法論記事

固相ペプチド合成のための商用マイクロ波反応器の安価な適応

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DOI：

10.3791/66937

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2024年11月22日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Fairfield University

この記事について

サマリー

市販のマイクロ波反応器で固相ペプチド合成を行うための、シンプルで安価で新しい装置が紹介されています。

要約

マイクロ波照射と加熱を補助して固相ペプチド合成(SPPS)を行う自作装置を紹介します。従来のSPPS反応容器は、容器の底部にあるフリットを介して溶媒や副生成物を排出するのに対し、本装置は真空下でガス分散管を用いて溶媒や副生成物、余分な試薬を除去します。同じガス分散チューブが、カップリングと脱保護の反応ステップ中にSPPSビーズの窒素ガス攪拌を供給します。マイクロ波加熱は、α-アミノイソ酪酸(Aib)、α、α-ジアルキル化アミノ酸残基などの立体的に阻害された残基のSPPSカップリングに有益です。この自作の装置は、手動のFmoc SPPS法を介して、標準的な室温条件および試薬の下で結合するのが難しいことで有名なAib残基が優勢なヘプタメリックおよびオクタメアペプチドを調製するために使用されてきました。さらに、一般的な商用マイクロ波SPPSリアクターはSPPS合成専用であるため、SPPS以外のユーザーはアクセスできません。対照的に、提示された装置は、装置が市販のマイクロ波反応器から自明に除去されるので、化学反応の従来のマイクロ波加速のためのマイクロ波反応器の汎用性を保持する。

概要

1960年代にMerrifield社が導入した固相ペプチド合成SPPSは、ペプチドおよび化学合成に革命をもたらし、ノーベル化学賞を受賞しました1,2。その後の数十年で、多くの研究者がメリフィールドの独自の技術を洗練させ、フルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)ベースのものとtert-ブチルオキシカルボニル(BOC)ベースの2つの選択肢というSPPSの実践を支配する選択肢につながりました3。FMOC中の固体樹脂からペプチドを最終的に切断するには、BOC技術のHFと比較して、トリフルオロ酢酸を含むカクテルが必要であり、FMOCベースの分析法は多くの研究室で好まれています。

最先端のSPPS法は、目的の配列によって時折挑戦されます。近年、凝集4、ジケトピペラジン形成5、N-メチル化アミノ酸残基6などの特異な懸念を克服する進歩が見られました。カップリングの収率を最適化するために、何千ものカップリング試薬と添加剤が調査されてきました7。具体的には、COMU 8,9または酸性フッ化物10,11,12を介したカルボン酸活性化は、Oxyma13やヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)などの添加剤とともに、α,α-ジアルキル化残基が関与するカップリングなどの特に困難なカップリングに対して開発されました。

他の非試薬ベースの方法は、長い反応時間、「ダブルカップリング」、および加熱、特にマイクロ波加熱14,15,16を含む、困難なカップリングの収率を向上させるために採用されてきた。実際、マイクロ波加熱を採用した市販の自動ペプチドシンセサイザーは、反応速度を速め、ペプチドの最終純度を向上させ、溶媒の無駄を最小限に抑えるため、市場で最も商業的に成功したユニットの1つです。残念ながら、これらのユニットは高価になる可能性があり、場合によっては100,000ドル以上の費用がかかります。

私たちの研究室では、α-アミノイソ酪酸(Aib)17,18,19の強力なヘリコジェニック残基を含むペプチドのバリエーションを調製することに関心を持っています。そのα-炭素のジアルキル化から生じる立体障害のため、Aibは結合が難しいことで有名です。上述の方法(酸性フッ化物、マイクロ波加熱20)と巧妙な「ジペプチド」SPPS化学21は、SPPSをAIBの結合課題に適合させるために使用されてきた。Aibダイマーのオフレジン調製は、全体的な収率を向上させる一方で、追加の湿式化学と高温(50°C)を必要とします21。また、Aibの酸性フッ化物は、フッ素化剤の毒性があるため、使用を避けてきました。残念ながら、私たちの研究室には、SPPS副産物の必要な排出のための専用の反応容器を備えた専用のマイクロ波ベースの自動SPPSシンセサイザーがありません。それにもかかわらず、Clayden氏のグループからの最近の報告では、SPPSとマイクロ波照射22を使用してAibベースのオリゴマーを調製することに目覚ましい成功を収めており、私たちの研究室のCEM Discover SPマイクロ波ユニットをSPPS合成に適合させるように促されました。

我々はまず、マイクロ波反応器を手動SPPS/マイクロ波ユニット23に変換するためのCEMの市販のアクセサリーを調査した。コストとは別に、このアクセサリは、手動 SPPSのみ に対するマイクロ波ユニットのコミットメントを必要とします。他のラボユーザーは、マイクロ波ユニットの優れた機能にアクセスできなくなります。したがって、私たちのケースでは、商用アクセサリの実装は受け入れられないと見なされました。

その代わりに、比較的安価な部品を使って、マイクロ波アシストSPPSをミリモルスケールで行う装置を組み立てました。以下のプロトコルでは、シンプルで比較的安価なコンポーネントを使用して、手動のマイクロ波支援SPPSを実現する方法について説明します。

プロトコル

1.装置を組み立てます(図1)

注意: 装置を組み立てるためのすべてのコンポーネントは、 材料の表にあります。

  1. 真空コンセントを組み立てます。
    1. エチレンテトラフルオロエチレン(ETFE)製の「ティー」(図1、「1」とラベル付けされた部品)の右側に1/8インチのテフロンチューブを接続します。
    2. 1/8インチテフロンチューブをETFE製のバルブ(図1、「2」とラベル付けされた部品)に接続します。
    3. バルブの反対側に100cmのテフロンチューブを取り付けます(図1、「2」とラベル付けされた部品)。
    4. このチューブをゴム製のコルクの1/8インチの開口部に挿入し、このコルクを使用して、真空(ハウスまたは控えめなポンプ)に接続されたサイドアームの三角フラスコ(図1A、「8」とラベル付けされた部品)をキャップします。
  2. 窒素ガス入口を組み立てます。
    1. 2インチの1/8インチテフロンチューブをETFE「ティー」の左側に接続します(図1、「1」とラベル付けされたパーツ)。
    2. 1/8インチテフロンチューブをETFEバルブに接続します(図1、「3」とラベル付けされた部品)。
    3. 100cmの1/8インチテフロンチューブをEFTEバルブの反対側に取り付けます(図1、「3」とラベル付けされたパーツ)。
    4. 1/8インチテフロンチューブの遠端をゴム製のコルクに通し、このコルクを使用して、レギュレーターが取り付けられた窒素ボンベに取り付けられたタイゴンチューブに接続します(図1A、「7」とラベル付けされた部品)。
    5. レギュレーターのニードルバルブを閉じた状態で、レギュレーターのダイヤフラムバルブを使用します(図1A、「7」とラベル付けされた部品)。5〜10psiの圧力を達成するため。
  3. アスピレーター/バブラーを組み立てます。
    1. 「ティー」のステム(図1、「1」とラベル付けされた部品)を長さ100cmの1/8インチODテフロンチューブに接続します。
    2. このチューブを、以前に針で穴を開けたマイクロセプタム(図1、「6」とラベル付けされた部品)に挿入します。
    3. チューブをガス分散チューブに完全に挿入します。マイクロセプタムを使用して、ガス分散チューブ(図1、「4」とラベル付けされた部品)とテフロンチューブとの間にシールを形成します。
    4. ガス分散管を試験管反応容器(図1、「5」と表示された部品)に挿入し、試験管をマイクロ波反応器の外部にあるホルダー( 図1Bの写真)に入れます。
      注:化学反応中、試験管はマイクロ波反応器に挿入されます。反応溶液および溶媒洗浄の添加中、試験管はマイクロ波反応器の外部に保持されます。
  4. オープンベッセルアッテネーターをマイクロ波リアクターに取り付けます。これで、装置を使用する準備が整いました。

2. 試薬の準備

  1. FMOC-アミノ酸溶液を調製します。0.100 mmol スケールの場合、DMF で 0.2 M FMOC-AA-OH を調製します。各カップリングサイクルでは、2.5mLのアミノ酸溶液を使用します。
  2. ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)カップリング試薬を調製します。DMFに1.0M DICを用意する。各カップリングは1.0mLのDIC溶液を使用します。
  3. Oxyma Pure添加剤溶液を調製します。DMF中に0.5 Mオキシマを調製します。各カップリングは1.0mLのオキシマ溶液を使用します。
  4. 保護解除液を準備します。20% v/v モルホリン/DMF 溶液を調製します。各保護解除の実行には、7 mLの溶液が必要です。fmoc の保護解除ごとに 2 回の保護解除を実行します。

3. ペプチド樹脂の調製

  1. SPPS Wang樹脂、100〜200メッシュ、1%ジビニルベンゼンと架橋されたポリスチレンの適切な質量を測定し、乾燥樹脂を試験管反応容器に入れます。例えば、0.100 mmol スケールの合成では、0.500 mmol g-1 の負荷を持つ樹脂には 200 mg の樹脂が必要です。
  2. レジンにDMF溶媒3mLを加え、レジンを室温で15分間膨潤させます。このステップでは、攪拌のために窒素ガスの供給が「オン/オープン」であり、真空バルブ(図1、「2」とラベル付け)が「オフ/クローズ」になっていることを確認します。窒素供給のニードルバルブ(図1A、7とラベル付け)を使用して、溶液内で穏やかにバブリングします。
    注:この設定は、窒素ガスによるすべてのさらなる攪拌に適している必要があります。
  3. レジンを膨潤させてから15分後、真空下でDMF溶媒を吸引します:N2 バルブを閉じます(図1、「3」とラベル付けされています)。真空用のバルブを開き(図1、「2」とラベル付け)、DMF溶媒を吸引します。溶媒がほぼ除去されたら、N2 バルブを開きます(図1、「3」とラベル付けされています)。
  4. 手順3.2と3.3を2回繰り返して、レジンを完全に膨潤させます。

4. FMOCの取り外し

注:樹脂には、C末端残基としてあらかじめロードされたさまざまなFMOC保護アミノ酸がプリロードされています。したがって、FMOCの除去は通常、樹脂を膨潤させた後の最初のステップです。

  1. マイクロ波反応器の外部にある試験管反応容器と真空バルブ(図1、「2」とラベル付け)を閉じた状態で、7 mLの20%ピペリジン/DMFまたは20%モルホリン/DMFを試験管に直接加えます。
  2. 窒素バルブ(図1、「3」とラベル付け)をオンにして、ビーズを攪拌します。
    注:SPPS樹脂は、FMOCによって保護されたC端子残留物があらかじめ充填されています。
  3. ビーズを含む試験管を「オープンベッセル」減衰器(図1B、反応器の金属ポート)を介してマイクロ波反応器に挿入します。
  4. マイクロ波を ダイナミックモードにして90°Cに2分間加熱します: 温度目標 を 90°C、 50Wの電力、保持時間= 2.0分 に設定します(マイクロ波内の保護解除に関するレポートについては 、補足ファイル1 を参照してください)。電子レンジの赤外線センサーを介して温度を監視します。マイクロ波は反応温度を維持するために電力を減らします。
  5. ビーズの入った試験管をマイクロ波反応器から取り外します。
  6. 真空下でDMF溶液と反応副産物を吸引する:N2 バルブを閉じます(図1、「3」とラベル付け)。真空用のバルブを開きます(図1、「2」とラベル付けされています)。溶液がほぼ除去されたら、N2 バルブを開きます(図1、「3」とラベル付けされています)。
  7. 真空バルブを閉じます(図1、「2」とラベル付けされています)。DMFを3mL加えて、試験管とガス分散管をすすぎます。
  8. 真空下でのDMF溶媒洗浄を吸引する:N2 バルブを閉じます(図1、「3」とラベル付けされています)。真空用のバルブを開きます(図1、「2」とラベル付けされています)。溶液がほぼ除去されたら、N2 バルブを開きます(図1、「3」とラベル付けされています)。
  9. ステップ 4.7 と 4.8 を 2 回繰り返し、DMF 溶媒で合計 3 回洗浄します。
  10. FMOCの取り外し手順4.1〜4.9を繰り返して、合計2つの連続した保護解除手順を実行します。

5. FMOCアミノ酸のカップリング

  1. 試験管反応容器をマイクロ波反応器の外部のホルダーに入れます。
  2. 試験管内のレジンに、2.5 mL の 0.2 M FMOC アミノ酸 (5 倍モル過剰)、1.0 mL の 1.0 mL 1.0 M DIC カップリング剤溶液 (10 倍モル過剰)、および 1.0 mL の 0.5 M オキシマ添加剤溶液 (5 倍モル過剰) を手動で添加します。
  3. 窒素バルブ(図1、「3」とラベル付け)を開いて、ビーズを攪拌します。
  4. ビーズを含む試験管を、オープンベッセルアッテネーター(図1B、リアクターの金属ポート)を介してマイクロ波リアクターに挿入します。溶液を100°Cに10分間加熱します。マイクロ波を ダイナミックモードで使用する場合は、 温度目標 を 100°C、電力60W、ホールドタイム=10.0分 に設定します(マイクロ波内の結合に関するレポートについては 、補足ファイル1 を参照してください)。電子レンジの赤外線センサーを介して温度を監視します。マイクロ波は反応温度を維持するために電力を減らします。
  5. ビーズの入った試験管をマイクロ波反応器から取り外します。
  6. DMF溶媒および反応副生成物を真空下で吸引する:N2 バルブを閉じます(図1、「3」とラベル付け)。真空用のバルブを開きます(図1、「2」とラベル付けされています)。溶液がほぼ除去されたら、N2 バルブを開きます(図1、「3」とラベル付けされています)。
  7. 真空バルブを閉じます(図1、「2」とラベル付けされています)。DMFを3mL加えて、試験管とガス分散管をすすぎます。
  8. 真空下でのDMF溶媒洗浄を吸引する:N2 バルブを閉じます(図1、「3」とラベル付けされています)。真空用のバルブを開きます(図1、「2」とラベル付けされています)。溶液がほぼ除去されたら、N2 バルブを開きます(図1、「3」とラベル付けされています)。
  9. ステップ5.7と5.8を2回繰り返し、DMF溶媒で合計3回洗浄します。

6. SPPSペプチドサイクルを繰り返す

  1. セクション4(FMOCの除去)およびセクション5(FMOCアミノ酸のカップリング)のすべてのステップを、目的の配列のペプチドが得られるまで繰り返します。
    注:試薬溶液は、マイクロ波反応器の外側の室温で、試験管反応容器に直接追加してください。また、試験管をマイクロ波反応器に入れる前に、窒素攪拌が開始されていることを確認してください。

7. ペプチド切断

  1. レジンをフリットプラスチックシリンジに移します。
  2. 95%トリフルオロ酢酸(TFA)、2.5%水、および2.5%トリイソプロピルシラン(TIPS)の切断カクテルを1 mL/100 mg樹脂の容量で調製します。.
  3. ペプチドを室温で2時間、連続的または不定期に振とうしながら切断します。
  4. ペプチド生成物を10 mLの氷冷ジエチルエーテルに沈殿させます。
  5. ペレットを最小限のMeCN/0.1%水性TFAに再懸濁し、一晩凍結乾燥します。

結果

当社の装置で調製したペプチド配列の例を 図2 と 図3に示します。 表1 は、使用した溶液、マイクロ波パラメータ、および洗浄をまとめたものです。MALDI-TOF質量分析の確認は図に示されています。これらのペプチドの質量回収率は 80% を超えています。重要なことに、これらすべての配列は、隣接するα、α-ジアルキル化アミノ酸間に複数のカップリングを持っています。これらは、ペプチド結合形成を介して結合するのが最も難しい残基の一つです。

figure-results-1
図1:自作のマイクロ波支援手動SPPS装置(A)1)ETFE「ティー」を示す概略図。2)真空へのETFEバルブ。3)窒素ガスへのETFEバルブ。4)ガス分散管、5)パイレックス試験管反応容器内。6)1/8インチテフロンチューブをガス分散チューブに接合するNMRタイプのセプタム。7)窒素ガスの流れを制御するニードルバルブ。8) 反応廃棄物を回収するためのサイドアームフラスコ。メーカーの表とコンポーネントのカタログ番号を参照してください。(B)組み立てた画像の写真。番号付けは図 1A と同じです。略語:SPSS =固相ペプチド合成;ETFE =エチレンテトラフルオロエチレン;NMR = 核磁気共鳴。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:マイクロ波SPPS法とMALDI-TOF確認により合成したペプチド1の構造(A)マトリックスとしてCHCAを採用。m/z = 880.18 のピークはカリウム付加体 [MK+] で、m/z=880.45 と計算されました。(B)粗ペプチド1のHPLC微量。溶媒グラジエントは、0.1% 水性 TFA に対して 20% から 80% までの MeCN を 20 分間で測定します。観測波長=222nm。略語:SPSS =固相ペプチド合成;MALDI-TOF = マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間;CHCA = α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、HPLC = 高速液体クロマトグラフィー;MeCN = アセトニトリル;TFA = トリフルオロ酢酸。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:マイクロ波SPPS法とMALDI-TOF確認により合成したペプチド2の構造 (A)マトリックスとしてCHCAを採用。m/z = 1022.7 のピークは、m/z=1023.5 と計算されたカリウム付加体 [MK+] に割り当てられます。m/z = 966.5 のピークは、水損失24 を介して C 末端オキサゾロンに暫定的に割り当てられており、m/z = 967.5 と計算されています。(B)粗ペプチドのHPLC微量2。溶媒グラジエントは、0.1% 水性 TFA に対して 20% から 80% までの MeCN を 20% で 20% にします。観測波長=222nm。略語:SPSS =固相ペプチド合成;MALDI-TOF = マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間;CHCA = α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、HPLC = 高速液体クロマトグラフィー;MeCN = アセトニトリル;TFA =トリフルオロ酢酸、 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

歩溶液/溶剤内容量(mL)時間 (分)温度 (°C)
1デプロテクト20%モルホリン7290
2洗浄DMFの4, 4, 4-RTについて
3デプロテクト20%モルホリン7290
4洗浄DMFの4, 4, 4-RTについて
5結合FMOC-AA-OH、OXYMA、DIC5, 2, 210100
6洗浄DMFの4, 4, 4-RTについて
7繰り返す
終わり劈開TFA/TIPS/H2O1>120

表1:0.1mmolスケールのマイクロ波支援SPPSの1サイクルのステップ:FMOCの脱保護、洗浄、およびFMOCとアミノ酸のカップリング。 0.2 M FMOC-AA-OH、0.5 M オキシマ、1.0 M DIC。溶液は、マイクロピペッターで手動で直接試験管に添加します。略語:SPSS =固相ペプチド合成;FMOC = フルオレニルメトキシカルボニル;DIC =ジイソプロピルカルボジイミド。

補足ファイル1:Fmoc保護基の除去に関するCEM Discover SP Microwave Reactor Reportと、Fmoc保護アミノ酸のカップリングに関するCEM Discover SP Microwave Reactor Report。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここで紹介する装置は、マイクロ波支援SPPS中に溶媒、余分な試薬、老廃物を除去し、窒素ガス攪拌を追加するためのシンプルで斬新で安価な方法を呼び出します。従来のSPPS容器が容器の底部でフリットを呼び出すのに対し、本装置は真空下でガス分散管を呼び出し、容器を吸引します。したがって、反応容器は通常の試験管であり、マイクロ波反応器メーカーが推奨する「オープン容器減衰器」内の場所で加熱されます。

当社の主な革新は、真空下で「ガス分散管」を介して試験管から溶媒と反応副産物を除去することです。マイクロ波照射下での化学変換中、および溶媒(N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)または N-メチルピロリジノン、NMP)による洗浄中、SPPSビーズはチューブ全体に分散した窒素ガスによって攪拌されます。真空ガスと窒素ガスはETFEバルブによって制御され、耐溶剤性を最適化します。SPPS廃棄物は、サイドアームの三角フラスコに回収されます。すべてのコンポーネントは1/8インチのテフロンチューブを介して接続されています。私たちは「家庭用」の真空を使用していますが、機械式真空ポンプも機能します。上の 図1は、当社の装置の概略図です。

SPPSを成功させるには、装置だけでなく、温度、時間、化学試薬の化学プロトコルも必要です。Claydenらのプロトコール22を採用して、従来の室温SPPS法では不可能ではないにしても困難なペプチドをいくつか調製しました。アミノ酸のカップリングには、カップリングカクテルとしてジイソプロピルカルボジイミド(DIC)とオキシマを使用し、100°Cに10分間照射します。Oxymaは、結合プロセス13中の残留物のラセミ化を抑制すると考えられている。FMOCの脱保護には、DMF中の20%モルホリンを使用し、90°Cで2分間照射し、もう一度繰り返します。反応の合間には、DMFを用いてSPPSビーズ(Wang樹脂)を3回繰り返しすすぎます。

この手動装置を用いて、合成が困難なペプチドを1残基あたり約40分の割合で調製しました。このレートの最適化の可能性については、まだ検討していません。例えば、マイクロ波反応器内の時間は、「目標温度での時間」ではなく「総反応時間」に制限することができ、結果を損なうことなく設定できると考えています。これは、目標温度に漸近的に近づくのに時間がかかっているためです(詳細は 補足ファイル1 を参照)。さらに、原則として、反応容器をマイクロ波から取り出さずに、すべての試薬と溶媒を添加することができます。しかし、私たちはすべてのステップで樹脂を検査できることを好みます。

我々のユースケースはSPPSであるが、固相法は、デンドリマー25、RNA26、電気化学合成27など、さまざまな合成にますます適用されていることに注意すべきである。さまざまなユースケースでマイクロ波支援が役立つ可能性があり、この装置が適しています。最後に、この装置はマイクロ波支援SPPSを実行するように構築されていますが、その基本的な反応容器は試験管です。したがって、この装置は、従来の室温SPPSだけでなく、例えばオイルバス中で高温で実施されるSPPSでも採用され得る。

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

著者らは、フェアフィールド大学のINSPIRE助成金、フェアフィールド大学の化学科および生化学部の支援、および研究室の管理に関する専門知識に対するドロシー・ソブシンスキー博士の支援に感謝しています。さらに、著者らは、ペプチドおよび有機合成に関する議論を行ったJillian Smith-Carpenter教授とAaron Van Dyke教授に感謝します。著者らは、フェアフィールド大学芸術科学部の出版基金の支援に感謝しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CEM ディスカバー SP マイクロ波リアクターCEM廃止。nbsp;最近、製品ラインでDiscover 2.0に置き換えられました
ジイソプロピルカルボジイミド(DCC)TCIアメリカ
ジメチルホルムアミド(DMF)サーモ・サイエンティフィック・ケミカルズ
ガス分散管、マイクロ、およびnbsp;ケムグラスCG-207-02中程度の多孔率
微小鼻中隔ケムグラスCG-3022-20「NMRチューブ」タイプセプタム
モルフォリンサーモ・サイエンティフィック・ケミカルズ
N-Fmoc保護アミノ酸
オイクスマ・ピュアTCIアメリカ
サイドアーム式エーレンマイヤーフラスコ各種ベンダー廃棄物収集
「ティー」イデックスP-713ETFE
テフロンチューブ 1/8インチ、そしてnbsp;レステック25306外径 × 0.063インチ内径、3 m
試験管(マイクロ波外部の反応容器用ホルダー) 各種ベンダー(30 x 175)
試験管(反応容器)コーニング・グラス9820-25Xパイレックス 25 x 200 mm、リムレス 
バルブイデックスP-721ETFE(2回)
Wang SPPS樹脂、1%架橋ジビニルベンゼン、100-200メッシュ上級化学技術

参考文献

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