無傷および再生中のウーパールーパー四肢の軟骨の原子間力顕微鏡測定

サマリー

このプロトコルでは、原子間力顕微鏡(AFM)用のウーパールーパー組織を調製し、無傷および再生中の四肢軟骨のインデンテーション測定を行う方法を示します。

要約

機械的な力は、正常な細胞機能と発生中の組織におけるパターン形成に重要なシグナルを提供し、その役割は胚発生および病因において広く研究されてきました。それに比べて、動物の再生中のこれらのシグナルについてはほとんど知られていません。

ウーパールーパーは、損傷後に軟骨や骨の欠損など、多くの臓器や組織を完全に回復させる能力があるため、再生の研究にとって重要なモデル生物です。脊椎動物の体の主要な支持組織としての重要な役割のため、再生中に骨格機能を回復するには、失われた構造の修復とそれらの機械的特性の両方が必要です。このプロトコルは、原子間力顕微鏡(AFM)用のウーパールーパー四肢サンプルを処理する方法を記述しており、これは高い空間分解能で細胞および組織の機械的特性をプローブするためのゴールドスタンダードです。

この研究では、ウーパールーパーの再生能力を利用して、ホメオスタシス中の四肢軟骨の硬さと、組織組織分解と軟骨凝縮の2つの段階の四肢再生を測定しました。AFMは、動的組織再構築と再生中に発生する機械的変化についての洞察を得るための貴重なツールであることを示しています。

概要

骨格、特に軟骨と骨は、脊椎動物の体の軟組織の主要な機械的サポートを提供します。したがって、骨格系に損傷があると、機能や生存率が大幅に損なわれる可能性があります。人間では、骨折は最も一般的な外傷の1^{つであり、そ}のほとんどは数週間で修復されますが、これらの5%〜10%は治癒が遅れるか、完全に回復することはありません^2,3。さらに、人間は広範な骨や軟骨の喪失から回復することができません^4,5。しかし、一部のサンショウウオは、完全な四肢⁶を含むさまざまな体構造を再生できるため、骨格再生の研究に理想的なモデルとなっています。

ウーパールーパー(Ambystoma mexicanum)は、四肢の再生が広く研究されてきたサンショウウオの一種です。このプロセスは、1)創傷治癒、2)炎症/組織溶解、3)胚盤形成、および4)胚盤の成長/分化(^7,8でレビュー)の4つの主要な連続した重複する段階で発生します。切断後、損傷部位に隣接するケラチノサイトが急速に移動し、創傷を閉じて創傷上皮(WE)を形成します。その後の炎症と組織溶解の間に、病原体が排除され、破片と損傷した細胞が取り除かれ、切断面の下の細胞外マトリックス(ECM)が再構築されます⁹。組織組織溶解は、四肢の再生が起こるために不可欠であり¹⁰、タンパク質分解酵素の分泌は、全体的なECMリモデリングだけでなく、芽球を生じさせる細胞を放出し、ECM自体に隔離された生理活性分子を遊離させるためにも重要である⁸。実際、多くの再生環境やモデル生物での研究で、組織溶解中のECMのユニークな材料特性が、脱分化プロセスを誘発したり、細胞の損傷部位への移動を指示したりできることが示されている(¹¹の文献でレビュー)。さらに、組織溶解の後期段階での石灰化組織の吸収は、新たに形成された四肢骨格要素の適切な統合の鍵であることが示されています¹²。組織溶解段階に続いて、芽腫は、脱分化した成熟組織細胞または常在幹細胞に起因する未分化の多系統前駆細胞の蓄積として、創傷上皮(WE)の下に形成されます。ブラストメーマ細胞は増殖し、欠落しているすべての細胞タイプに分化します。最後に、四肢の形態形成が起こり、骨格組織は、骨格周囲細胞に由来する軟骨形成因子と超分化した真皮線維芽細胞13,14,15の凝縮を通じて再生される。

細胞の同一性とECM組成の変化を調節する生化学的手がかりの多くが同定されている10,13,14,16,17,18、四肢再生のさまざまな段階における組織の機械的特性、およびそれらが再生に及ぼす影響は、ほとんど解明されていない。多くの研究が、細胞がいくつかの状況で運命と行動を調節する機械的な手がかりを感知し、統合することを示している(^19,20でレビュー)。したがって、四肢の再生に関する細胞的および分子的知識を組織の機械的測定で補完することで、これらのプロセスの理解が大幅に向上します。

生物学的サンプルの機械的特性評価と力の操作を可能にするさまざまな技術が開発されてきました²¹。これらの技術の中で、原子間力顕微鏡(AFM)は、超高感度の力センサーであるAFMカンチ^レバー22でインデントすることにより、生体試料の粘弾性特性を高い空間分解能でプローブするメカノバイオロジーのゴールドスタンダードとなっています。この手法ではサンプルと直接接触する必要があるため、通常、組織スライスが生成されますが、これは場合によっては困難です。したがって、調製条件は、特定のサンプルごとに適合させ最適化して、可能な限り生理学的条件に近づけることができ、アーティファクトが最小限に抑えられるようにする必要がある²³。このプロトコルでは、AFMを使用してウーパールーパーの四肢の組織硬さを測定する方法を説明し、無傷の状態、組織溶解を受けている間、および軟骨凝縮段階の軟骨組織に焦点を当てています(図1および図2)。この方法は、他の組織タイプの測定にも拡張できます。

プロトコル

ウーパールーパー(Ambystoma mexicanum)は、ドレスデン工科大学(TUD)のドレスデン再生治療センター(CRTD)のウーパールーパー施設で栽培されました。飼育条件の完全な説明は^、24に記載されています。簡単に言うと、部屋は20〜22°Cに保たれ、12/12時間の昼夜サイクルで行われました。すべての取り扱いと外科的処置は、地元の倫理委員会のガイドラインに従って実施され、ドイツのザクセン州立協会によって承認されました。

この研究では、すべての実験に白色(d / d)ウーパールーパーを使用しましたが、これは体の色素沈着を欠く(メラノフォアとキサントフォアがほとんどまたはまったくない)自然に発生する突然変異株で、目の虹彩にのみイリドフォアがあります。この研究では、鼻から尾まで8〜15cm(生後5〜7か月)のウーパールーパーを使用し、性別特異的なバイアスは使用しました。

1. 事前準備

1. ウーパールーパーの麻酔と安楽死に使用される10%(w / v)ベンゾカインストック溶液を準備します(以下を参照)。このためには、500 mLの制限に達するまで、50 gのベンゾカインと100%エタノールを容量ボトルに混ぜます。.
2. 0.03%(w / v)ベンゾカインストック溶液を調製します。
   1. 1 Lの場合、50 mLの10倍トリス緩衝生理食塩水(TBS)を30 mLの10%(w/v)ベンゾカインおよび5 mLの4000%(w/v)ホルトフレッター溶液915 mLの蒸留水と混合し、マグネチックスターバーで一晩混合します。
   2. 1 Lの10x TBS溶液に対して、24.2 gのTrizma塩基と90 gのNaClを990 mLの脱イオン水と混合します。マグネチックスターバーでよく混ぜます。次に、約10 mLの濃縮HCl(12 Mまたは37%)を加え、pH 8に調整します。
   3. 1 Lの4000%(w / v)ホルトフレッター溶液の場合、158.4 gのNaCl、11.13 gのMgSO₄·7H₂O、5.36 gのCaCl₂·2H₂O、および2.88 gのKClを脱イオン水と1 Lまで混合します。
3. 麻酔用の保持タンク水で0.01%(w / v)のベンゾカイン希釈液を0.03%(w / v)ストック溶液を1:3に希釈して調製します。.
   1. 1 Lの溶液には、333 mLのベンゾカイン原液と666 mLの保持タンク水を使用します。.
4. 鎮痛薬用の5 mg / mL酒石酸ブトルファノールストック溶液を調製します。.このためには、100mgのブトルファノール(+)-酒石酸塩を20mLの超純水と混合します。アリコートは4°Cで保存してください。
5. 切断の日に、新たに0.5 mg/Lの酒石酸ブトルファノールのワーキング溶液を準備して、ストック溶液を保持タンク水で1:10.000に希釈することにより、外科的処置後の動物の痛みを軽減します。
   1. 体長8cm未満の動物の場合は、200 mLのストック溶液を200 mLの保持タンク水に混ぜます。
   2. 大型動物の場合は、60 μLのストック溶液を600 mLの保持タンク水に混合します。
6. 滅菌両生類リン酸緩衝生理食塩水(APBS)と80%(v / v)PBS溶液を調製し、800 mLのDPBSを200 mLの脱イオン水と混合して室温(RT)に保ちます。
7. 1 mg / mLインスリンストック溶液を調製します。.このためには、250 mgのインスリン粉末を25 mLのHCl 0.1 Mと混合し、溶解するまでゆっくりと攪拌します。撹拌しながら、溶液が透明になるまで225mLのAPBSを加えます。滅菌フィルターを使用し、4 mLのアリコートを-20°Cで保存します。
8. 無菌培地(全%(v/v):L15培地62.5%、熱不活化FBS10%、ペニシリン/ストレプトマイシン1%、インスリン1%、L-グルタミン1%)を調製し、使用日まで4°Cで保管してください。実験日は、使用前にRTに平衡化してください。
   1. 400 mLの培地には、250 mLのL15培地、40 mLの熱不活化FBS、4 mLのペニシリン/ストレプトマイシン、4 mLのインスリン溶液(ステップ1.7から)、4 mLのL-Glutamine、および98 mLの脱イオン滅菌水を使用します。無菌条件下で調製し、すべての成分を混合した後に滅菌フィルターで調製します。15mLのアリコートを準備します。
9. APBS溶液中に2.5%および3%(w / v)の低融点(lmp)-アガロースを調製し、70°Cで加熱してアガロースを完全に溶解します。1.5mLのチューブにアリコートを調製し、使用日まで4°Cで保存します。
   1. 20 mLの2.5%(w / v)lmp-アガロースの場合、0.5 gのlmp-アガロースと20 mLのAPBSを50 mLチューブで混合し、アガロースが完全に溶けるまで70°Cのウォーターバスで加熱します。解決策は明確で透明性のあるものでなければなりません。まだ温かいうちにアリコートを準備します。
   2. 20 mLの3%(w / v)lmp-アガロースについて、0.6 gのlmp-アガロースを20 mLのAPBSと混合し、上記のように進めます。.
   3. (オプション):20 mLの1%(w / v)lmp-アガロースについて、0.2 gのlmp-アガロースと20 mLのAPBSを混合し、上記のように進めます。
      注:融解時間はlmp-アガロースの濃度に依存し、約15〜40分の範囲であり得る。
10. 切断および組織装着には、明視野ステレオスコープを使用します。
11. 直径100mmのプラスチック製ペトリ皿、鉗子、メス、手術用ハサミを組み立てて、切断や組織採取を行います。
12. くぼみ測定のために直径35mmのプラスチックペトリ皿を準備します。
13. 直径~1cmの~1cmの長さの円柱を準備します。このためには、ブンゼンバーナーの炎の下で段ボールカッターを加熱し、加熱したブレードで15mLのチューブを切断します。
14. パラフィルムを^1cm2 マスの小さなカットして保管します。
15. 金属製またはコールドブロックを-20°Cで、冷凍庫に少なくとも1時間放置して調製します。
16. プラスチック製のパスツールピペットを準備します。
17. (オプション):固定剤MEMFa溶液(3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸[MOPS] 0.1 M pH 7.4、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'、N'-四酢酸[EGTA] 2 mM、MgSO_{4.7H 2}O 1 mM、3.7%ホルムアルデヒド)を調製します。このためには、10.465 gのMOPS、0.123 gのMgSO₄·7H₂O、2 mLの0.5 M EDTA pH 8.0を加え、45 mLになるまで水を加えます。5 mL のホルムアルデヒド 37% (w/v) を総容量 50 mL に加えます。

2. 試薬

1. この作業に使用した試薬については、 Table of Materials を参照してくださいが、他の商用プロバイダーも使用できます。

3.ウーパールーパーの切断と四肢の再生

1. すべての実験手順の前に、保持タンク水(ステップ1.3)で希釈した0.01%(w / v)ベンゾカインで動物に麻酔をかけます(ステップ1.3)20分間、動物が深く麻酔をかけられ、触覚刺激に反応しないことを確認します。
2. ウーパールーパーを麻酔から取り出し、麻酔水で湿らせた紙ティッシュが入った100mmのシャーレの上に置きます。四肢を体の軸に対して垂直に向け、プレートをステレオスコープの下に置いて、視覚化を改善します。
   注:ここでは、コンパクトなグースネックランプを備えたステレオスコープを使用しました。
3. 鐘足領域(橈骨/尺骨)の石灰化領域のすぐ遠位にある鋭利な滅菌メスで四肢を切断します(図1A)。
   注:3R動物福祉の原則に従い、切断によって最初に切除された手足を無傷のコントロールとして使用することをお勧めします。
4. 動物を皿の上に置いたまま、ベンゾカイン含有水に浸した加湿ティッシュペーパーで15分間覆い、血液凝固と創傷閉鎖が起こるようにします。.
5. 動物を鎮痛剤(酒石酸ブトルファノール、0.5 mg / L、ステップ1.5から)を含む新鮮な保持水を入れたタンクに戻します。.
6. 術後鎮痛治療の24時間後に、動物を新鮮な保持水が入った元のタンクに移します。
7. 目的の段階まで動物が再生するのを待ちます。
   注:分析された四肢は、生後5か月の動物の無傷期の場合は切断日、組織溶解期の場合は切断後5日(dpa)に収集されました。軟骨の凝縮段階は、7か月齢の動物で21dpaで測定されました。

4. 測定のためのティッシュの取り付けと処理

1. 2.5%または3%(w / v)lmp-アガロース(ステップ1.9)を含む1.5 mLチューブをサーモブロック上で70°Cでアガロースが完全に溶けるまで加熱します。チューブを37°Cで別のサーモブロックに交換し、温度を平衡化させてから使用してください。
   注:ここでは、再生組織の測定に2.5%のlmp-アガロースを使用し、無傷の組織に3%を使用しました。
2. 長さ1cmの円柱の片側(ステップ1.13から)をパラフィルムピースの1つ(ステップ1.14)で覆い、底部が完全に密閉されるようにします。
3. 15 mL の培地を RT に平衡化します (ステップ 1.8 から)。
4. 麻酔薬を含む水(0.01%(w / v)ベンゾカインを保持タンク水で希釈)に少なくとも20分間浸して、動物を麻酔します。
5. ステレオスコープで手足を画像化し、ソフトウェアで定量的な測定を可能にします。対象の構造の長さを測定し、対象のセクションに到達するまで、四肢の遠位端からどれだけの組織を取り除く必要があるかを計算します。
6. 手足を再生するには、肘のレベルでメスや手術用ハサミで切断し、手足から余分な組織を解剖して手足を収集します。次のステップを準備する間、組織をAPBS溶液に残します。カットが下腕軸に対して横方向(90°)になっていることを確認して、均一な表面を作成します。無傷の手足の場合は、手根骨領域を切開して手を取り除きます。
7. 動物を致死量の麻酔(0.1%ベンゾカイン)に少なくとも20分間さらして安楽死させます。このためには、必要な量の10%(w / v)ベンゾカイン溶液を添加して、0.1%(w / v)濃度に到達します。
   1. 動物を100 mLの0.01%(w / v)ベンゾカイン溶液で麻酔した場合は、10%(w / v)ベンゾカイン溶液900 μLを追加します。.
8. 手足をAPBS溶液に沈めてすすぎます。
9. パスツールピペットとサーモブロック(アガロースアリコートで37°Cで安定化)が作業ステーションの近くにあることを確認します。-20°Cの冷凍庫からコールドブロックを取り出し、パラフィルムで覆われた端を下に向けてシリンダーを置きます。
10. 解剖した手足をつかみ、ティッシュペーパーで余分な液体をそっと取り除きます。手足をきれいなプレートに置き、溶かしたlmp-アガロースを上に加え、アガロース内で手足を少し動かして、皮膚表面から残っているAPBSを移動します。
11. すばやく作業して、手足をシリンダーの内側に配置し、関心領域が上を向くように垂直に向けられるようにします。
12. 鉗子で手足を優しく保持しながら、組織が完全に覆われるまでシリンダー内にlmp-アガロースを追加します。アガロースが固まる前に鉗子をそっと取り除きます。
13. シリンダーをコールドブロックから取り外し、アガロースをRTで約30秒間完全に固化させます。
14. 組織含有アガロースブロックを、無菌培地アリコートおよびAPBSとともに、RTで直ちにビブラトームルームに持って行きます。
15. シリンダーの底からパラフィルムをはがし、組織を含むアガロースをシアノアクリレート接着剤でビブラトームステージに取り付けます。アガロースとサンプルの両方がステージに接着されていることを確認してください。
16. ステージをAPBSに沈めて切片化します。
    注:無傷の組織には硬い骨/軟骨が含まれますが、再生組織はより柔らかいです。したがって、ビブラトームパラメータはそれに応じて調整する必要があります。この研究では、無傷組織(振幅1.2 mm、速度0.1 mm/s)と再生組織(振幅0.9 mm、速度0.4 mm/s)のパラメータを使用しました。
17. 組織先端に到達するまで、アガロースを短いステップ(例えば、100 μmステップ)で切片化し始めます。次に、組織の遠位部分(ステップ4.5で計算)が除去されるまで、組織ブロックを切片にします。これにより、対象領域の横方向の断面に容易にアクセスできるようになります。
    注:除去された組織切片には、AFMでプローブされた表面のすぐ隣の表面が含まれ、組織構造の参照として役立ちます。したがって、直接相補分析に使用することも、その後の染色のために固定することもできます(セクション6を参照)。
18. 組織含有ブロックをかみそりの刃でビブラトームステージから慎重に取り除き、接着剤の痕跡をすべて取り除きます。すぐにブロックを35 mmのプラスチック製ペトリ皿に外科用組織接着接着剤で接着し、RTで約2 mLの培地を追加して、組織が完全に覆われていることを確認します。
    注:アガロースブロックの露出した組織表面がプローブされる表面です。

5. AFMによる測定

1. 測定の少なくとも1日前に、カンチレバーを測定用に準備します。
   注:この作業では、チップレスシリコンカンチレバーをポリスチレンビーズ(直径20μm)で官能化し、ビーズ-カンチレバー結合を少なくとも1日間強化してから、インデンテーション測定に使用しました。
   1. エポキシ接着剤を使用してカンチレバーにビーズを取り付け、処理時間は5分です。
   2. 接着剤でコーティングされたスライドガラスに最小限の接触でカンチレバーをすばやく下げて、その端に接着剤の小さな液滴が形成されるようにし、直後に適切なビーズと接触させます。
   3. カンチレバーとビードの接点を~10分間保持してから、結合したビードでカンチレバーを表面から持ち上げます。
2. 測定前にカンチレバーを校正してください。
   注:修正されたカンチレバーは、AFMソフトウェアの組み込み手順を使用して、熱雑音法によって各実験セットの前に較正されました。
3. ティッシュブロック(ステップ4.18から)と培地を入れたペトリ皿をAFMのペトリ皿ホルダーに挿入し、明視野顕微鏡で概観画像を取得します(図1B)。
   注:インデンテーションテストには、直立した光学顕微鏡の上にモーターステージを装備したセットアップが使用されます。AFMヘッドを取り付け、カンチレバーを組織上に配置し、カンチレバーを表面に近づけます。
4. 特定の関心領域を選択し、力-距離曲線の配列を記録します(図2A)。
   注:2-25 nNの相対力設定値を使用して、剛性の異なる組織に対して1~4 μmの同等のくぼみ深さに到達し、アプローチと収縮速度は7.5 μm/s、z長は50 μm、グリッドサイズは70 μm x 70 μm、3 x 3ポイント。
5. プローブした領域ごとに、明視野顕微鏡画像を取得して、取得した値を四肢セクションの各特定の領域に関連付けます。
6. すべてのサンプルについて、組織タイプごとに少なくとも3つの異なる領域を調査します。
   注:すべての場合において、この研究では、軟骨の中心にある4つの領域と軟骨領域の周辺にある3つの領域を測定し、組織を最大1時間顕微鏡下に置きました。
7. インデンテーション測定が終了したら、さらなる分析のために組織を廃棄または固定します。
   注:サンプルは、測定終了後、MEMFa溶液を含む2 mLチューブに入れて固定し、4°Cで一晩固定しました。MEMFa(ステップ1.17)を使用しましたが、PBS中のホルムアルデヒド4%(w / v)溶液も使用できます。

6. (オプション)隣接する組織切片の処理

1. 隣接する組織切片をその後の染色に使用する場合は、切片化直後に固定剤が入った小さな2 mLチューブに切片を入れ、4°Cで一晩固定します。
   1. アクチン細胞骨格と核の標識を通じて組織構造を明らかにするには、PBSでそれぞれ5分間3回洗浄して固定液を除去し、Alexa Fluor 488標識ファロイジン(1:250)およびHoechst 33258(1:10000)をPBSに含んだ溶液で、ロッキングプラットフォーム上のRTで1時間染色します。
   2. 次に、37°Cで安定化したAPBS中の1%(w / v)lmp-アガロースを使用して、ガラス底皿の上にステンドサンプルを固定化します(ステップ1.9から)。対象のサーフェスがガラスに面していることを確認します。アガロースが固まったら、脱水症状を防ぐためにサンプルをPBSで覆います。
      注:インタクトサンプルと組織溶解サンプルは、倒立共焦点顕微鏡(倍率 10 倍、光学切片 8 μm)でイメージングします。 図1C の画像は、8つの光学セクションの最大投影です。
2. 隣接する組織切片を新鮮な組織を必要とする即時下流の分析(RNA抽出、生色素によるインキュベーションなど)に使用する場合は、迅速に作業し、細胞培養培地(ステップ1.8から)を使用して、可能な限り最高の組織完全性を確保してください。

7. データ分析と表示

1. 見かけのヤング率を計算するには、JPK/Brukerデータ処理ソフトウェアを使用して、球状圧子のHertz/Sneddonモデル(Eq.1)を使用して力-距離曲線を解析します。ポアソン比を0.5と仮定します。
   (式1)
   ここで、R:圧子半径、E:弾性率、 ν:ポアソン比、a:圧子とサンプルの間の円形接触領域の半径、δ:圧子の深さ。
2. 粘弾性解析のためには、PyJibe 0.15.0 で力-押し込み曲線のアプローチ部分を "Hertz model corrected for viscoelasticity using Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM)" (written by Paul Müller, https://github.com/AFM-analysis/PyJibe)²⁵ で解析します。フィット関数は、Abuhattum et ^al.26 によって記述されたモデルに基づいており、Kelvin-Voigt-Maxwell モデル要素を統合しています。
   1. フォースインデンテーションカーブを前処理し、直線による区分的フィット(ベースライン)とアプローチパートの多項式フィット関数を使用して接触点を推定します。
   2. 力-インデンテーション曲線を「Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM) モデルを使用して粘弾性を補正したヘルツモデル」に適合させます。フィットから、弛緩していないヤング率、見かけのヤング率、および見かけの粘度を求めます。このモデルは、マクスウェルの緩和時間とインデント時間も提供します。
      注:いくつかの分析された力の押し込み曲線(特に無傷の組織)では、マクスウェル緩和時間は押し込み時間よりも有意に大きいまたは小さかったため、それぞれかなり弾性的な挙動またはケルビン・フォイトの機械的挙動が示されました。
3. すべての測定値をスプレッドシートにエクスポートし、組織タイプとサンプルごとの見かけのヤング率の中央値を計算します。
4. 適切なソフトウェアを使用してデータをプロットし、統計的に分析します。
   注:ここではGraphPad Prismが使用されており、結果を説明する際には、サンプルあたりの見かけのヤング率の中央値の平均±SDを参照します(図2D-Fに表示)。
5. 共焦点画像から光学スライスを投影することにより、Fijiの最大投影機能で光学スライスを表示します。個々のチャンネルの明るさとコントラストを調整して、蛍光染色を最適に視覚化します。
6. 適切なソフトウェアでフィギュアパネルを生成します。
   注:パネルの生成にはAffinity Designerを使用し、 図1A のモデルはAffinity Designerを使用して描画します。

結果

上記のプロトコルを使用して、我々は、初期の軟骨組織溶解中、および後の軟骨凝縮段階(図1A)の間に、恒常性(「無傷」)状態で軟骨ウーパールーパー四肢組織の見かけのヤング率を測定した。また、カンチレバーの位置を示す画像に示されているように、中心と周辺を含むさまざまな領域の骨格要素の機械的特性を調査しました(図1B)。組織構造を表示し、それを剛性測定値と相関させるために、横方向の組織切片または測定が行われた組織ブロックのいずれかを固定し、アクチンフィラメントと核をそれぞれAlexa Fluor 488標識ファロイジンとヘキストで染色しました(図1C)。無傷の肢では、半径は尺骨よりも明らかに大きいが、両方の軟骨骨格要素は同様の形態を持ち、中央に均等に分布した丸い核があり、軟骨周囲に対応する扁平な核のリングに囲まれている²⁴。組織溶解期には、組織構造の劇的な変化が検出され、骨格要素内の核が無秩序で密度が低くなりました。その後の軟骨凝縮段階では、核は再び組織化され、新たに形成された軟骨と周囲の再生組織との間に明確な境界が設けられます。しかし、この段階ではほとんどの原子核が平らになっており、中心と周辺の間に明確な形態上の違いはありません。

頬足領域(橈骨と尺骨)に存在する両方の骨格要素の横断面を測定したところ、無傷の四肢に区別できない明らかなヤング率が検出され、中央値はそれぞれ10.95 kPa±11.69 kPa、15.71 ± 6.49 kPa(図2D、左)であり、これは解剖学的類似性と一致しています(図1C)。興味深いことに、軟骨の中心 と 周辺部の分析では、無傷の状態で、中央の見かけのヤング率は周辺部よりも高く、中央値はそれぞれ16.48±6.86kPa対7.53±4.63kPaでした(図2E、左)。切断後5日目には、組織融解期に対応して、橈骨と尺骨の見かけのヤング率が大幅に減少しました(それぞれ0.03 ± 0.02 kPa、0.13 ± 0.09 kPa、 図2D、右)が、中心と周辺の違いも消え、ヤング率の中央値はそれぞれ0.11 ± 0.07 kPa、0.27 ± 0.34 kPaでした(図2E、右)。後の再生段階で軟骨特性を解析すると、軟骨が凝縮し始めた時点で、見かけのヤング率の有意な増加が検出され、無傷の段階と組織分解期の中間値(0.77 ± 0.29 kPa、 図2F)に達しました。

提供された例の曲線(図2B)に見られるように、ほとんどのアプローチ曲線と収縮曲線のペアの間でヒステリシスが発生し、力が加わった組織の粘弾性応答を示しています。さらに、さまざまな組織の粘弾性特性をより詳細に分析することに着手しました。複数の周波数にわたる振動測定は時間がかかり、特に複数の組織領域をマッピングする際に、組織の完全性を維持する上でやや重要であるため、カンチ^レバー26を即時に収縮させる前に力-距離曲線のアプローチ部分を適合させることができるAbuhattumらによって以前に発表された方法を使用しました.このモデルは、Kelvin-Voigt Maxwellモデル要素に基づいており、以前に細胞とヒドロゲル²⁶、ならびに膵臓組織²⁷の粘弾性特性の分析に適用されている。再生の異なる段階の組織について得られた中央の非弛緩弾性率(無傷:23.05 kPa、組織分解:0.20 kPa、凝縮軟骨:1.60 kPa)と見かけのヤング率(無傷:17.54 kPa、組織分解:0.07 kPa、凝縮軟骨:1.54 kPa)は、有意差を示しました(図2G-H)。全体として、変形に対する組織の主に弾性応答は、選択された変形速度で観察され、これは、緩んでいない弾性率と見かけの弾性率の大きな類似性に反映されています(図2G、H)。組織溶解期(0.72 Pa・s)では、インタクト(2.06 Pa・s)および凝縮軟骨期(2.32 Pa・s)と比較して、見かけの粘度の中央値の中央値が有意に低くなりました(図 2I)。予想通り、PyJjibe解析の見かけのヤング率(図2H)は、JPKデータ処理ソフトウェア(図2F)によって得られた値と高く一致していました。

結論として、機械的特性評価は、再生プロセス中の動的組織再構成を反映しています。これらの測定値は、組織構造の観察された変化(図1C)とともに組織の硬さが減少し、再生中に徐々に回復するという解剖学的観察と一致しています。

図1:再生中のウーパールーパー四肢軟骨のくぼみ測定(A)再生段階の概略図。破線は、測定が行われたビブラトームによって生成された横方向のセクションのおおよその位置を示しています。(B)四肢軟骨の中心(上)と周辺(下)の測定の代表的な画像。黒い先端がカンチレバーです。スケールバー:100μm.(C)無傷の手足の組織構造(左)、組織溶解中の組織(中央)、軟骨の凝縮(右)。緑:核(Hoechst)、マゼンタ:アクチンフィラメント(ファロイジン)。スケールバー:500μm.C'パネルに輪郭が描かれた拡大領域。スケールバー:100μm。70 μm x 70 μmのくぼみグリッドは、白(中央)と黄色(周辺)の点線で示されます。パネルBとCでは、文字RとUはそれぞれRadiusとUlnaを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:AFMによるウーパールーパー四肢再生中の軟骨剛性の測定(A)AFMインデンテーション実験の概略図を、時間の関数としての力(上)と圧子とサンプルの間の距離の関数としての力(下)として示しました。アプローチカーブとリトラクトカーブは、それぞれ青と赤で表示されます。接触点は、黒の縦破線で表示されます。フォースインデンテーション曲線は、Hertz/Sneddonモデル(JPKデータ処理ソフトウェアおよびPyjibe)またはPyjibeの粘弾性KVMモデル拡張を使用して、曲線のアプローチ部分内に収まりました。(B)組織溶解および凝縮軟骨期における無傷および再生中の四肢のAFM測定からの代表的な力-距離曲線。解析可能な曲線(アーティファクトなし)の割合は、各曲線の右上隅に示されます。(C)力-圧痕曲線の典型的なアーティファクトの例、たとえば、圧子と表面の不適切な接触によるもの。示されている例は無傷の手足に対応していますが、すべての条件で同等の種類のアーティファクトが観察されました。B-Cの場合:代表的な力-距離曲線をPyjibeを使用してフィットさせ、表示しました。水色の曲線は曲線のアプローチ部分を表し、薄い赤色の曲線は後退部分を表しています。濃い青色の線は、球状の圧子に適した適用されたヘルツ/スネドンです。フィットからのそれぞれの残差は、ボトムフォース-距離曲線について下に示します。プロットされた残差は、適合値と実際の力値の差を表します。(D)無傷の四肢で測定され、組織溶解を受けている橈骨および尺骨中心の見かけのヤング率。(E)無傷の四肢および組織溶解中の軟骨中心対末梢(Peri)の明らかなヤング率。(F)再生の分析段階で軟骨中心について測定された見かけのヤング率。D-Fの場合:各ドットは、解析に成功した1つの力-距離曲線から導出され、大きいドットはサンプルあたりの中央値に対応します。見かけのヤング率は、JPK BrukerソフトウェアのHertz/Sneddonモデルフィットを使用して取得されました。(G-I)非弛緩弾性率(G)、見かけのヤング率(H)、および見かけの粘度(I)は、再生の分析段階での軟骨中心測定からPyJibe(KVM拡張)を使用して計算されました。各ドットは、解析に成功した1つの力-距離曲線から導出されます。線は、条件ごとのすべての測定値の中央値に対応します。D-Iの場合:Kruskal-WallisとDunnの多重比較検定。異なる文字は、統計的に互いに異なる条件を表します (p < 0.05)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、AFMを用いてウーパールーパー四肢の軟骨硬直を測定する技術を紹介します。ただし、この方法は、他の組織タイプもプローブするために拡張できます。AFM測定を成功させるための重要なステップはサンプル調製であり、これはウーパールーパーサンプルでは特に困難であることが証明されました。その結果、アガロースブロックにまだ埋め込まれている組織表面をプローブすることが、組織の完全性を維持するための最良の方法であることがわかりました。これは、ウーパールーパーの皮膚が表皮の表面に高レベルの粘液を分泌するため、スライスされた組織切片がアガロースに安定して埋め込まれるのを妨げるためです。

サンプルによっては、高い接着性など、追加の課題が生じる場合があります。この問題は、特に組織溶解期のサンプルで経験しましたが、比較的順応性があり、接着性がありました。これらのサンプルでは、くぼみ部分が「ギザギザ」の外観を持つ複数の力-距離曲線も観察され、ビードがサンプル表面を非連続的に変形させていることを示しています(図2C)、たとえば、応力下で表面が屈服するためです。このような力-距離曲線は、ヘルツ-スネドンモデルに適合できなかったため、破棄する必要がありました。接着性を低下させるためには、圧子の不動態化が有用であり得る²⁸、すなわち、ポリエチレングリコール(PEG)やウシ血清アルブミンなどの粘着性を低下させる薬剤で圧子ビーズを被覆することによって。また、力-距離曲線をフィッティングするための代替モデル、例えば、JKR(Johnson-Kendall-Roberts)モデル²⁹を使用することができます。ここで分析した組織は、隣接する組織領域とテストされたさまざまな条件で1桁以上の弾性率の比較的大きな変動を示したため、単一の理想的なカンチレバー/圧子(ばね定数/圧子サイズ)を選択することは困難でした。組織の硬さのかなり大きな変動は、くぼみの深さを同等で適切な範囲(圧子直径の約5%〜25%)に保つために、加えられる接触力の適応も必要でした。

組織の機械的特性を可能な限り生理学的に保持するためのもう一つの重要なパラメータは、組織の完全性を最大限に維持することです。これは、採取後すぐに処理し、pH安定化細胞培養培地で適切な温度に保った新鮮なサンプルを測定することで確認しました。

最近、他のグループは、サンプル処理の代替方法を使用して、ウーパールーパー骨格要素のマイクロインデンテーション測定を行った³⁰。しかし、これらの実験では、組織を事前に凍結し、再生する骨格片を周囲の組織から手動で解剖して、その場で測定しました。経験的に証明されるまで、これらの操作が軟骨組織の完全性と機械的特性に影響を与えるかどうかは不明です。サンショウウオの筋肉と芽球の分析も報告されています^31,32。ただし、これらの場合、皮膚は除去され、サンプルは切片化されませんでした。したがって、除去された上皮のすぐ下にある表面からの情報のみが得られました。このタイプの定量化は正確ですが、むしろ筋肉の側面に関する情報を提供するため、内部の筋肉層からの機械的情報は無視されます。我々は20μmの圧子を使用したため、測定値は報告されたマイクロインデンテーション測定値30,31,32のようにバルクではなく、細胞および細胞外スケールで行われた。したがって、細胞が実際にさらされる機械的な手がかりを反映した解像度を得るだけでなく、組織の不均一性を明らかにします(図2D-I)。

測定では、無傷の骨格要素の周辺で見かけのヤング率が低い値が検出され、ウーパールーパーのペリコンドリウムが軟骨よりも順応性が高いことを示唆しています。しかし、骨格要素に隣接する組織も、70 μm x 70 μmのグリッド設定によりプローブされた可能性を排除することはできません。組織溶解期では、そのような違いは観察されず、ウーパールーパー再生肢の組織溶解は、軟骨、その周囲の軟骨周囲、および隣接組織で同等に進行する可能性があることを示唆しています。橈骨と尺骨は似たような構造を共有していますが、橈骨の直径が大きく、尺骨が長いなど、解剖学的な大きな違いがあります²⁴。それにもかかわらず、それらの剛性の比較分析は、医療目的³³の機械的負荷に対するそれらの応答を除いて、これまで報告されていません。ここでは、これら2つの骨格要素の断面における無傷の肢と再生中の肢のくぼみ測定について説明します。我々は、ウーパールーパーの四肢の半径と尺骨の間に剛性に有意差が存在しないことを示し、これはヒトの対応物で検出された同等の骨塩密度と一致している³⁴。しかし、特に組織溶解中に、半径内の見かけのヤング率が低い傾向が観察されました。この観察結果が生物学的に重要であるかどうかを判断するには、サンプル数が多いことが望ましいでしょう。この研究で得られたデータに基づいて、条件ごとに最低 5 つのサンプルを提案します。組織溶解期には、両方の骨格要素がより順応性が高くなりますが、これは、この段階で発生すると説明されているECMリモデリングと一致しています⁹。最後に、この研究で得られた測定値は、軟骨の硬直が後の軟骨凝縮段階で徐々に増加することを示唆しています。これらの観察結果は、最近報告された無傷の骨および凝縮性軟骨のインデンテーション測定²⁹、ならびにブリルアン共焦点顕微鏡^法35による軟骨の機械的特性のin vivo評価と一致している。

全体として、この研究は、ウーパールーパーの四肢の機械的特性を研究するための貴重なツールとしてのAFMの可能性を広げます。この技術により、遺伝子発現と細胞分化転換の軌跡^16,13に関する知識を補完し、組織力学が再生プロセスをどのように形成し、影響を与えているかをよりよく理解することを目指しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Affinity Designer	のアフィニティ	バージョン1.10.4	図の組み立て用
アガロース 低メルト	ロート	6351.1	サンプル調製用
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	組織を染色するには
Axiozoom	Zeiss		AFM下の画像サンプルへ
ベンゾカイン	Sigma-Aldrich	E1501	動物を麻酔するには
ブトルファノール(+)-酒石酸塩塩	シグマ・アルドリッチ	B9156	鎮痛剤として
片持ち梁	NanoWorld	Arrow TL1	AFMインデンテーション測定用
Cellhesion 200セットアップ モーターステージを装備	JPK/Bruker		AFMインデンテーション測定用
CellSenseエントリー			ステレオスコープオリンパスUC90
ダルベッコでのイメージング用s リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS, 1x)	Gibco	14190-144	ビブラートーム下のサンプルと切片を洗浄するには
FIJI (ImageJ2)	https://imagej.net/software/fiji	version 2.9.0/1.53t	画像処理用
GraphPad Prism	GraphPad Software	(version 8.4.3)	データをグラフ化し、統計的に分析するには
熱不活性化FBS	Gibco	10270-106	細胞用培養液
ヒストアクリル接着剤 (2-ブチル-シアノアクリレート)	ブラウン		サンプルをシャーレに接着するには
Hoechst 33258	Abcam	ab228550	組織を染色するには
インスリン	Sigma-Aldrich	I5500	細胞培養培地用
倒立共焦点顕微鏡	Zeiss	780 LSM	組織切片を画像化する
倒立共焦点顕微鏡	Zeiss	980 LSM	組織切片を画像化するには
JPK/Bruker データ処理ソフトウェア	JPK/Bruker	SPM 6.4	力-距離曲線を分析するには
L15 培地 (Leibovitz)	Sigma	L1518	細胞培養培地用
L-グルタミン	Gibco	25030-024	細胞培養培地ペ
ニシリン/ストレプトマイシン	Gibco	15140-122	細胞用培養液
ポリスチレンビーズ(20&マイクロ;m直径);)	microParticles		AFMインデンテーション測定用
Pyjibe	Paul Mü著;ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe	0.15.0	粘弾性解析用
ステレオスコープ オリンパスSX10	オリンパス	SX10	四肢切断および組織固定用
ステレオスコープ オリンパスUC90	オリンパス	UC90	イメージング用
ビブラトームライカ	ライカ	VT 1200S	組織切片化用