Cumulus-Oocyte Complexesの即時部分的除去:体外受精の迅速観察のための洗練されたアプローチ

サマリー

ここでは、採卵後に卵丘-卵母細胞複合体の一部を迅速に除去して体外受精観察プロセスを迅速化し、顆粒膜細胞の除去に必要な時間を短縮し、外部要素への卵子の曝露を最小限に抑え、胚発生を妨げず、最終的に体外受精の検査手順の効率を向上させるための最適化された方法を紹介します。

要約

体外受精(IVF)の臨床技術および実験室技術の急速な進歩にもかかわらず、患者のかなりの割合(10%-15%)が受精障害を経験し続けており、受精率が低く、生存不能な胚が産生されています。短期受精では、顆粒膜細胞を早期に除去して第2極体の押し出しを観察し、受精の評価と早期の改善策により、低受精率と完全な受精失敗に対処することができます。しかし、体外受精における短期受精の観察は、未処理の卵丘-卵子複合体のクラスターが大きすぎることや卵子間の癒着、顆粒膜細胞の除去のための複雑な外部手順の必要性、観察期間の長期化などの課題によって妨げられています。この問題に取り組むために、本研究では、採卵後に顆粒膜細胞を直ちに部分的に除去する方法を提案します。このアプローチは、短期受精と従来の受精モニタリングの後続の段階を合理化し、卵子の押し出しに必要な時間を短縮し、卵子への外部環境の影響の可能性を最小限に抑え、重要な受精観察ウィンドウを逃すリスクを減らします。その結果、この研究は、IVFにおける胚研究所の運用効率を高めることを目的とした新しい臨床的証拠をもたらします。

概要

体外受精-胚移植(IVF-ET)の分野では、一般的な受精率は60%から80%の範囲に収まります¹。しかし、症例の約4%から16%は、完全な受精の失敗または低い受精率のいずれかに遭遇し、予測^2,3では課題を提示します。臨床妊娠の結果を改善し、完全な非受精と低受精の発生を減らすために、体外受精手順での短期受精の利用は増加しています⁴。このアプローチでは、顆粒膜細胞を迅速に除去して、第 2 極体の押し出しを監視し、受精状態を評価し、場合によっては治療的な細胞質内精子注入 (ICSI) を実施します。卵子卵丘細胞複合体(OCCC)と卵子との間の結合は、従来の夜間受精と比較して短期受精の方が強くなるため、OCCC^{除去の課題}が増大します5。卵子数の過剰、OCCC複合体の多さ、卵子間の接着などの要因により、短期受精中の顆粒膜細胞の除去時間が長くなり、卵子がインキュベーターの外に留まる期間が長くなる可能性があります⁴。受精観察期間を最適化するために、OCCC複合体が重要な卵子から顆粒膜細胞を部分的に切除するなど、採卵後の修正アプローチが考案されました。この技術は、卵子を取り巻く顆粒膜細胞を保持し、初期の卵子構造⁶の完全性を維持し、これらの細胞が卵子の成熟とその後の受精-胚結合⁷に不可欠な因子を供給し続けることを可能にする。

そこで、本研究では、生殖医療センターでIVF-ET治療を受けている患者を研究参加者として、即時部分顆粒膜細胞の機械的切除法が短期受精と夜間受精モニタリングの両方の処置期間に及ぼす影響を調査するとともに、正常な受精と後期発達の結果を評価することを目指しています。この研究は、体外受精における胚実験室の手順を強化するための貴重な洞察を提供することを目的としています。

プロトコル

すべての手順は、梅州人民病院の生殖医療部門の標準運用手順に従って実施され、同部門の倫理委員会によるレビューの対象となりました。書面によるインフォームドコンセントは、参加した各カップルから得られました。この研究には、卵割または胚盤胞期の胚移植を伴う最初の体外受精サイクルを受ける参加者と、20歳から45歳までの女性が含まれていました。除外基準には、ドナーの卵子/精子の使用と、先天性または二次性子宮異常(例:中隔子宮、単角子宮、子宮二分体)、腺筋症、子宮粘膜下筋腫、または胚移植日の子宮内膜の厚さが7mm未満。2023年12月から2024年2月に登録された合計115人の患者が、OCCCの即時部分除去が行われたかどうかに基づいて2つのグループに層別化されました。

1. 卵子回収前の準備

1. 卵子ピックアップディッシュ(材料表)をインキュベーターに37°Cで一晩置きます。
2. 12 mLの卵胞操作培地(材料表)を14 mLの丸底試験管に入れ、37°Cで一晩インキュベートします。卵子を回収する30分前に、チューブを予熱した試験管ラックに移します。
3. 卵胞操作培地を調製する:9 mLの卵胞操作培地を14 mLの丸底試験管(材料表)に加え、37°Cで一晩インキュベートします。卵子回収の日に、培地4.5 mLを、100%パラフィンオイル2 mLで覆ったインキュベート済みの卵子ピックアップ皿(材料表)に移します。
4. OCCCフラッシング溶液を調製する:卵子ピックアップ皿に4.5 mLの受精培地(材料表)を加え、37°Cで一晩インキュベートします。
5. 受精培地を準備する:100%パラフィンオイル(材料表)で覆われた6cmの皿に1mLの受精培地を加え、37°Cで一晩インキュベートします。
6. ガラス製のパスツールピペットを準備する(材料表):アルコールランプで約5秒間加熱することにより、先端を穏やかに鈍くし、丸めますamp(図1)。パスツールピペットの先端に吸引ヘッドを取り付けて、傷がつかずに皿の底に触れることができるようにします。ガラス製のパスツールピペットと10cmの皿を卵胞操作用培地ですすいでください。

2. OCCCの卵子回収と即時部分的除去

注:卵子の分離およびOCCC除去手順中に実体顕微鏡を使用してください。最適な結果を得るには、すべての手順を温度制御付き加熱テーブル(37°C)で実施し、卵子回収の30分前にすべての機器を予熱する必要があります。

1. 卵子回収中に排卵前の卵胞液を採取します^{ESHRE 推奨事項 8}.
   1. 簡単に言えば、17 Gの針を使用して、経膣超音波ガイド下で卵子を回収します。適切な負圧は120-140mmHgの範囲です。
   2. 14 mLの丸底試験管に集めた卵胞液を10 cmの皿(材料表)に注ぎ、液体の深さを0.5 cm未満に保ちます。.皿を一定温度のプラットフォーム(37°C)に置きます。
2. OCCCを実体顕微鏡で観察し、卵子の存在を確認し、成熟度を評価します。
   注:OOOCの成熟度は、卵丘細胞の形態および特定の卵母^{細胞構造の可視性}9に基づいて評価される。
3. 鈍い端のパスツールピペットを使用してOCCCを吸引します。10cmの皿を約15度傾けて、すべての大きなOCCCを広げます。半径2500μm以内の卵母細胞および周囲の顆粒膜細胞を吸引することは避けてください。パスツールピペットで縦軸に沿って余分な顆粒膜細胞を切断します(図2)。詳細な手順は次のとおりです。
   1. 卵胞液中に灰色がかった半透明の粘液塊があるかどうかを肉眼で観察します。見つからない場合は、実体顕微鏡であるOCCCで外側から内側に回転させて、灰色がかった半透明のムコイド塊をすばやく探します。
   2. OCCCに卵子が存在するかどうかを確認し、卵子の成熟度を予備的に評価します。
   3. 次に、丸い炎で磨かれたパスツールピペットでシリコン吸引ピペットを事前に準備し、OCCCを吸引すると同時に、10cmの皿を持っている手の左薬指で培養皿を9〜10時の位置でゆっくりと持ち上げ、培養皿を左に約15°少し傾けます(薬指を皿の下に置くのはほぼ必要な角度です)。
   4. ディッシュの11時位置で吸引したOCCCを吐き出しながら、右横にゆるやかに伸ばします。次に、拡大したOCCCの周りの顆粒膜細胞のサイズを観察します。続いて、水平に細長いOCCCの適切な位置で、パスツールピペットを使用して、余分な顆粒膜細胞を上から下に迅速かつ穏やかに下降させます。
4. カットしたOCCCをOCCCフラッシング液が入った回収皿に移します。残りの卵胞液を滅菌サンプル容器に注ぎます(材料表)。すべての複合施設が収集されるまで、これらの手順を繰り返します。

3. 精液調製と体外授精

1. 卵子回収の朝に射精して精液サンプルを採取します。世界保健機関(WHO、2010)の基準¹⁰に従って、光学顕微鏡下で精子の濃度、運動性、および形態を評価します。次いで、精子ペレットを新しい遠心分離管に移し、受精培地¹¹で2回洗浄する。必要になるまで、6% CO₂ および37°Cでインキュベートします。
2. 受精皿で回収してから約2〜3時間後に、1ミリリットルあたり1 x 10⁵ 〜3 x 10⁵ 運動性精子を1つの液滴でOCCCに授精します(材料の表)。6〜8個のOCCCと1mLの受精培地を受精皿に加えます。
   注:粘着性のあるOCCCを洗浄した後、パスツールピペットを使用して受精皿に移します。一度に1つのOCCCを放出し、ピペットを液体表面からそっと持ち上げてから次のOCCCを放出し、各OCCCが個別にディッシュに配置されてクラスター化を防ぎます。

4.積雲細胞の除去

1. 短期的な施肥の場合は、以下に説明する手順に従ってください。
   1. OCCCを精子と共インキュベートします4〜6時間。インキュベーション後、卵子の周囲の卵丘細胞を機械的に除去します。
   2. 卵丘細胞を完全に除去するために、卵母細胞よりわずかに小さい内径のピペットを使用して卵子を吸引します。
   3. 2つの極体の存在を観察することにより、受精を確認します。第2の極性体を示す卵子は受精していると見なされます。
   4. 第2極体が受精不全として示されないケースを特定し、レスキューICSIが必要です。
2. 定期的な受精の場合、18〜20時間の共インキュベーション後、受精評価のためにピペットを使用して卵丘細胞を取り出します。

5.胚培養

1. 受精卵子を培養し、卵子回収後3〜5日間観察します。授精後20時間で受精を評価して、前核の数を決定します。その後、各受精卵を培地液滴中で個別に培養し、受精後の胚を切断培地に移します。
   注:3日目までの理想的な胚は、6つ以上の同じサイズの割球で構成され、10%以下の断片化率を示す必要があります¹²。
2. 胚盤胞培養を進めるかどうかの決定は、患者の好みや、3日目に得られる胚の量や質などの特定の状況によって異なります。3日目の胚を胚盤胞培地に移し、5日目に評価します。ガードナーのスコアリングシステムを使用して胚盤胞を評価し、高品質の胚盤胞は≥ 4 BB¹³のスコアを持っています。

6. アウトカム測定と統計分析

1. 連続データを平均±標準偏差としてレポートし、順序データを比率として表します。適切なデータ分析ソフトウェア(ここではIBM SPSS Statistics)でスチューデントのt検定またはカイ二乗検定を使用して統計分析を実行します。 0.05 < P の有意水準を統計的に有意とみなします。

結果

短期間の共インキュベーション手順を受けているグループでは、レスキューを受けた患者は除外されました。短期授精を受けた患者47人のうち、患者の年齢と回収された卵子の数に有意差は認められませんでした(表1)。OCCCの即時部分的な除去により、卵母細胞の周囲に残っていたOCCCが緩み(図3)、第2の極性体の検出が容易になりました。OCCC群の部分的切除では、平均処置時間は対照群と比較して有意に短かった(4.42±1.68分対9.29±5.04分、 P <0.001)が、切断率、最適胚率、最適胚盤胞率に有意差は認められなかった。

従来の 体外 受精(IVF)を受けた68人の患者の別のコホートでは、受精チェックが授精後18〜20時間で実施され、患者の年齢と2つのグループ間で回収された卵子の数に類似性が認められました(表2)。卵子を囲む顆粒膜細胞の構造の緩みの増加は、採卵中にOCCCの即時部分除去を受けた患者で観察されました(図4)。OCCC群の部分的な除去では、平均運転時間がわずかに短いことが認められた(4.93 ± 0.80分対6.54 ± 7.77分、 P = 0.207)、統計的に有意な差は見られなかった。場合によっては、密集した接着により、観察手順が40分を超える長期にわたることにつながる可能性がありますが、一晩保管した後のほとんどのケースでOCCCの接着が一般的に緩んでいることは、2つのグループ間の操作時間に統計的なばらつきがないことを説明できる可能性があります。前のグループと同様に、切断率、最適な胚率、および最適な胚盤胞率に大きな不一致は確認されませんでした。

全体として、代表的な結果は、OCCCの即時部分的除去が、卵割率、最適な胚率、最適な胚盤胞率などの主要なIVF結果を損なうことなく、短期授精手順の手術時間を大幅に短縮することを示しています。この手法は、卵子の周りに残っているOCCCを緩めることにより、第2極性体の検出を容易にし、手術時間の短縮に貢献している可能性があります。従来のIVF手順の文脈では、OCCCの即時部分除去により手術時間が短縮される傾向が観察されましたが、その差は統計的に有意ではありませんでした。これらの知見は、OCCCの即時部分的切除は、特に短期授精の状況において、手続きの効率を向上させることができる一方で、従来の体外受精のタイムラインへの影響はそれほど顕著ではない可能性があることを示唆しています。

図1:アルコールバーナーを使用したパスツールピペットの準備。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:処理が必要なOCCCの典型的なイメージ。 (A および B)2人の患者から直径が2.5mmを超える典型的な卵子は、線引きされた赤い破線に沿って部分的な除去を受けました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:精子との共インキュベーション後4〜6時間後の受精の形態学的特徴を示す典型的な顕微鏡写真。 典型的な卵子 (A) と (B) OCCC の部分的な除去なし。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:精子との共インキュベーションの18〜20時間後の前核評価の形態学的特徴を示す典型的な顕微鏡写真。 典型的な卵子 (A) と (B) OCCC の部分的な除去なし。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

	OCCCグループの一部削除	コントロールグループ	p値
患者数 (n)	26	21
年齢 (y)	32.04 ± 4.11	33.33 ± 3.41	0.193
いいえ。回収された卵子の数	12.85 ± 9.02	11.38 ± 5.32	0.493
4時間の処置時間(分)	4.42 ± 1.68	9.29 ± 5.04	<0.001
切断率、n (%)	98.89±0.04、24	100.00 ± 0.00、19	0.221
最適な胚率、n(%)	71.38±35.46、24	72.14±35.72、19	0.945
最適な胚盤胞細胞率、n(%)	58.13±28.29、19	65.18±28.09、12	0.504

表1:OCCCの即時部分除去が短い共インキュベーション手順を受けている場合としない場合の2つのグループ間の受精結果の比較。

	OCCCグループの一部削除	コントロールグループ	p値
患者数 (n)	29	39
年齢 (y)	32.21 ± 4.11	32.72 ± 4.25	0.619
いいえ。回収された卵子の数	12.93±7.00	12.44 ± 7.26	0.777
20時間運転時間(分)	4.93 ± 0.80	6.54 ± 7.77	0.207
切断率、n (%)	98.81±0.04、28	95.93±0.17,37	0.39
最適な胚率、n(%)	72.07±36.75、28	72.62±30.01,36	0.948
最適な胚盤胞細胞率、n(%)	62.93±28.30、21	63.36±24.61、28	0.955

表2:従来の 体外 受精(IVF)を受けているOCCCの即時部分除去の有無にかかわらず、2つのグループ間の受精結果の比較。

ディスカッション

顆粒膜細胞の即時部分的除去は、短期受精の早期崩壊プロセスを加速し、短期受精と従来の体外受精の両方で第2極体の観察時間を短縮し、その後の胚発生を損なうことはありません。現在、世界中の研究所は、受精障害と低い成功率を軽減するためにさまざまな戦略を採用しています。好ましい方法は、短期受精¹⁴の4〜6時間後に第2の極性体を観察するための顆粒膜細胞を除去することを含む。卵母細胞と周囲の卵丘細胞との間の密接な接着により、ピペットを使用した機械的除去が妨げられるため、課題が生じます。卵子の即時ピッキングと切断により、OCCCの接着と体積が減少するため、この問題を軽減でき、観察時間が短縮されます。このプロトコールの重要なステップは、採卵後にOCCCを直ちに部分的に除去し、卵子の周囲に残っている卵丘細胞を緩めて、受精成功の評価に重要な第2極性体の検出を容易にすることです。迅速な除去により、切断率、最適な胚率、または最適な胚盤胞率を損なうことなく、手術時間を大幅に短縮できます。

切断技術の推奨される変更とトラブルシューティングは次のとおりです: (i) 針の固定は、体外時間が長くなるため、不要と見なされます。実際には、これは便利な切断アプローチを表しています。(ii)OCCCに焦点を当てると、卵母細胞の直径に一致する各側に3〜4個の顆粒膜細胞を保持することをお勧めします。二国間OCCCの場合、両側を切断する必要があります。片側OCCCの場合は、OCCCで側面を切り取ります。対称性を追求することはできますが、必ずしも完璧ではありません。(iii)卵胞がカールして広がり状態を乱すのを防ぐために、OCCCの浮き上がりを防ぐために、切断時には皿の上の卵胞液を十分に薄くする必要があります。(iv)卵胞液は、卵子の回収中に血液成分を含むことがよくあります。切断後は、血液汚染の影響を軽減するために卵胞を速やかに洗浄皿に移し、卵子回収後も洗浄を続ける必要があります。

部分除去後も卵丘細胞を保持することで、卵母細胞は成長因子やアミノ酸などの初期胚発生に不可欠な物質を受け取り、胚発生を促進します¹⁵。これまでの研究では、長期の共培養により活性酸素種(ROS)が大量に発生し、胚性透明帯が硬化し、胚の潜在能力が損なわれることが分かっています。顆粒膜細胞の即時部分的除去は、必要な顆粒膜細胞を保持しつつ、顆粒膜細胞によるROSおよび培養培地中のエネルギー消費を減少させる¹⁶。現在、体外受精の短期受精のために顆粒膜細胞を除去するタイミングと割合について統一されたコンセンサスはありません。この研究で得られたデータは、選択した卵子をOCCC直径約2500μmまで即時に除去しても、その後の胚発生や短期および従来の体外受精の観察プロセスを妨げないことを示唆しています。

この手法の大きな制限は、卵母細胞と卵丘細胞との間の接着度にばらつきが生じる可能性があり、それが結果の一貫性に影響を与える可能性があることです。さらに、即時部分除去アプローチは観察時間を短縮しますが、卵子の損傷を回避したり、その後の胚発生を損なったりするためには、正確な実行が必要です。切断後のOCCCの最適残量を決定するには、さらなる実験が必要です。例えば、約2000μmのOCCCを保持し、ピッキング皿に目盛りを事前にマーキングすることで、OCCCのサイズと切断範囲の統一的な評価を強化できるかどうかを調査することができます。

結論として、この洗練された技術は、受精や胚発生に重大な悪影響を示さず、支持する価値のある方法となっています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
G-IVFT PLUS	Vitrolife	10136
OVOIL	™ Vitrolife	10029
G-MOPS PLUS	Vitrolife	10130
Falcon 3003 ディッシュ	Corning	353003
Falcon 3001 ディッシュ	Corning	353001
Falcon 2001 チューブ	Corning	352001
Falcon 4013カップ	コーニング	354013
ファルコン3037皿	コーニング	351058
パスツールピペット	ダーウィン	D1150-5P