方法論記事

mRNA およびタンパク質解析のためのマウスの涙液採取の最適化

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DOI：

10.3791/66955

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2024年7月19日

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento, CINVESTAV Sede Sur

この記事について

サマリー

マウスモデルの涙からRNAおよびタンパク質バイオマーカーを同定することは、さまざまな疾患の早期診断に大きな期待が寄せられています。この原稿は、マウスの涙液からのmRNAおよびタンパク質単離の有効性と効率を最適化するための包括的なプロトコルを提供します。

要約

涙液膜は、眼の表面だけでなく、他の組織や臓器の病理に関連する分子変化を反映できる非常に動的な生体流体です。この生体液の分子分析は、疾患の診断またはモニタリング、治療効果の評価、および可能なバイオマーカーの特定のための非侵襲的な方法を提供します。サンプル量が限られているため、涙液サンプルの収集には、高品質と最大の効率を確保するための特定のスキルと適切なツールが必要です。さまざまな涙液サンプリング方法論が人間の研究で説明されています。この記事では、実験動物モデル、特にマウスから涙液関連のタンパク質情報を抽出するために特別に調整された、最適化されたプロトコルの包括的な説明を示します。この方法には、生後2ヶ月齢のマウスにおける涙液産生の薬理学的刺激、続いてシルマーストリップを用いたサンプル採取、および標準的な手順、SDS-PAGE、qPCR、およびデジタルPCR(dPCR)によるプロトコールの有効性と効率の評価が含まれます。このプロトコールは、さまざまな実験パラダイムにおける涙液タンパク質のシグネチャーの研究に容易に適合させることができます。動物モデル用の手頃な価格で標準化され、最適化された涙液サンプリングプロトコルを確立することで、ヒトと動物の研究の間のギャップを埋め、トランスレーショナルスタディを促進し、眼疾患および全身疾患研究の分野における進歩を加速することを目的としています。

概要

涙液は血漿限外濾過液と考えられており、血漿血清と脳脊髄液の中間体液としても説明されていますそれらが共有する生体分子の大幅な重複により1。ヒトの涙液には、タンパク質、涙液脂質、代謝物、電解質が含まれていることが報告されています2。最近では、mRNA、miRNA、細胞外小胞などの他の生体分子も同定されている3,4,5,6,7。

人間では、基底の涙は涙液膜にあり、これは3つの層で構成されています:外側の脂質層は、涙液の表面を滑らかに保ち、涙液の蒸発を防ぎます。目の水分を保ち、バクテリアをはじき、角膜を保護し、涙液膜の90%を構成する中央の水層。そして最後に、角膜と接触し、涙液が眼に付着することを可能にする高分子量タンパク質のファミリーであるムチン層8。眼表面全体の涙液の分布は、涙腺からの分泌から始まります。次に、この液体は涙管を通って目の表面を通過し、ドレナージチャネルに流れ込みます。まばたきをするたびに、涙が目全体に均一に分散し、しっとりとした状態を保ちます9。

涙液膜は、眼球表面だけでなく、他の組織や臓器でも発生する分子変化を反射できる非常にダイナミックな生体流体です。この生体液における差次的発現の解析は、ヒト疾患におけるバイオマーカーの発見のための有望なアプローチである10,11。涙液膜をバイオマーカーの供給源として利用することは、さまざまな病状における早期診断のためのバイオマーカーの供給源であり、非侵襲的な収集方法の存在によって大幅に促進されてきました。ヒトおよび獣医診療所で涙を採取するための最も一般的な方法は、毛細管現象の原理に基づいて作動する膜ベースの支持体(シルマーストリップ)を含み、涙の中の水が被験者の下部結膜嚢12,13,14に配置された紙の試験紙または毛細管の長さに沿って移動することを可能にする.この方法を通じて少量のサンプルを得るという固有の制限にもかかわらず、種々の高感度技術を用いた涙液組成の生化学的分析は、潜在的なバイオマーカー分子の同定を容易にした11,15。ヒト患者におけるシルマーストリップおよびキャピラリーからの涙タンパク質の溶出を最適化および評価するためのプロトコルは、十分に文書化されています16,17。しかし、実験動物モデルから涙液に関連する分子情報を抽出するために特別に設計された最適化されたプロトコルの完全な説明は入手可能ですが、ほとんどありません。涙腺18の直接刺激による涙液誘導のような既存の方法は、より大きな量の収集を可能にする一方で、侵襲的であり、動物に不快感を与える可能性がある。眼表面から涙液を採取するなどの非侵襲的な方法は、DNAおよびmiRNAを単離する方法として説明されている19,21。

このプロトコルは、マウスの涙を収集して処理するための費用対効果が高く最適化された方法を確立することを目的としています。この方法は、非侵襲性を優先しながら、SDS-PAGE、qPCR、dPCRなどの技術による分子分析に適した十分な涙液量を取得します。抽出されたタンパク質とmRNAの含有量情報は、既存の疾患の実験モデルにおける潜在的なバイオマーカーを特定するために利用することができます。

プロトコル

ここに記載されているすべての手順は、Cinvestavの動物倫理委員会(CICUAL、#0354/23)によって承認されました。実験動物は、ジャーナルの動物使用ガイドラインと、眼科および視覚研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明に従って厳密に取り扱われ、取り扱われました。処置前後の眼の健康は、眼の分泌物、まぶたの腫れ、眼の異常、および行動の変化を評価することにより評価されました。

1. 動物および試薬の準備

  1. この手順では、反復ごとに生後2か月のC57BL/6雄マウスを3匹、開始重量を~25 gで使用します(図1)。各マウスを個別に処理し、温かさを保つために加熱パッドに置きます。
  2. 涙液分泌を誘発するには、滅菌水を使用して20 mg / mLのピロカルピンの原液を調製します。.
  3. シルマーのテストストリップを長さ5mmにカットし、ノッチで各ストリップを90°の角度に曲げます。
  4. プロテアーゼ阻害剤を含む滅菌水250μLを調製します(メーカーの指示に従って、50mLに1錠)。

2.涙液生成の刺激と収集

  1. 各マウスの体重を個別に測定して、適切な治療量を計算します。
  2. 涙液の産生を刺激するには、6mmインスリン注射器を使用して30 mg / kgのピロカルピンを腹腔内に投与します(図1B)。.その効果が現れるまで、薬物注射後2分待ちます。.
    注:涙液の入手可能性が限られているため、刺激されていない動物からのデータは取得できませんでした。.
  3. 各シルマーストリップフラグメントの端を下まぶたの中央にピンセットで配置して涙を集め、涙がストリップの制限に達するまで所定の位置に保ちます(図1C)。次に、ストリップを交換します。2つのシルマーストリップを各目に順番に置き、収集のためにストリップの間に2分の間隔を空けます。涙液採取プロセスには、マウス1匹あたり10分以上かけて約4つのストリップフラグメントが必要です。
  4. Schirmer ストリップの断片を氷上の滅菌チューブに入れて、コンポーネントの劣化を防ぎます。コレクションが終わったらすぐにティア加工を始めます。

3. タンパク質の単離

  1. プロテアーゼ阻害剤を添加した滅菌水20 μLを入れた600 μLの微量遠心チューブにストリップフラグメントを入れ、前述した17(図1D)のように、600 x g、4°Cで1時間遠心分離します。
  2. サンプルが入った600 μLチューブの先端にある7.5 cmのステンレス製インジェクター針を使用して穿刺します(図1E)。次に、この穿刺したチューブを新しい滅菌した1.5 mLチューブに移し、以前に報告した17と同様に、サンプルを12,000 x gで4°Cで10分間遠心分離して、希釈した涙液の量を回復します。涙液膜の体積(上清)はチューブの底にあります。
  3. すべてのサンプルから回収した上清を組み合わせてタンパク質プールを作成します。この実験では、約200μLの総容量が得られました。
    注:涙液の生成は1時間以上続くことがあります。この間、涙はまだ溜まることができます。
  4. 涙液溜まりの総タンパク質含有量をBradford標準法22を用いて定量化します。

4. SDS-PAGE分析

  1. タンパク質サンプルを99°Cで4分間加熱して、タンパク質を変性させます。サンプルを短時間ボルテックスして、成分を混合します。
  2. 各サンプルから定量したタンパク質含有量30 μgを10% SDS-PAGEゲル(表1)にロードし、標準的な方法23を使用してサンプルを90 Vで2時間分析します。
  3. 電気泳動後、ゲルを染色溶液(表1)で覆い、30分間インキュベートしてタンパク質を染色します。
  4. ゲルを脱染液で数回すすぎ、背景が鮮明になり、タンパク質バンドが見えるまで洗い流します。
  5. ゲルドキュメンテーションシステムで画像を取得します。

5. qPCRおよびデジタルPCRのためのmRNA単離

  1. ストリップを20μLの滅菌水が入った600μLの微量遠心チューブに入れます。サンプルが入ったチューブの先端に穴を開け、新しい滅菌済み1.5 mLチューブに入れ、以前にヒトの涙3で報告したように、2,000 x g、4°Cで20分間遠心分離します(図1E-H)。
  2. すべてのサンプルからプールを作成します。この実験の回収量は、マウス1匹につき約22μLの上清、すなわち総体積66μLであった。生体分子の分解を避けるために、チューブをドライアイスの上に置きます。
  3. フェノールとイソチオシアネートグアニジン(市販品)の単相溶液200μLを加え、ピペッティングでホモジナイズします。室温で5分間放置します。このステップでは、サンプルを-20°Cで数週間、または-70°Cで数ヶ月間保存できます。
  4. クロロホルム40μLを加え、ボルテックスで15秒間混合します。室温で2分間放置します。10,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
  5. 水相を(間相を取らずに)新しい1.5mLチューブに慎重に移します。
  6. 100 μLのイソプロパノールに0.5 μLのグリコーゲン (0.05 μg/μL) を加え、ピペッティングで混合します。グリコーゲンはRNAと共沈殿し、その後のステップを妨げません。
  7. -20°Cで10分間放置します。 10,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清をすばやくデカントします。
  8. 200 μLの冷75%エタノールを加え、ボルテックスしてRNAペレットを再懸濁します。8,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
  9. エタノールをデカントします。チューブを反転させずに、20〜30分間風乾させます。20 μLのRNaseフリー水を加え、再懸濁します。
  10. 260 nmおよび280 nmの微量分光光度計で光学密度を読み取り、RNAの純度を評価します。サンプルは氷上にある必要があります。
    注:リボソームバンド28Sおよび18Sは、サンプルの性質上、アガロースゲルを使用して観察することはできません。miRNAやmRNAなどの他のRNAの存在は、前に示したように、バイオアナライザーを使用して分析できます18。
  11. メーカーのプロトコルに従って、市販のキットを使用して涙液RNAからcDNAを合成します。
    1. 10 ng〜5000 ngの範囲の入力RNAから始めます。使用するキットに応じて、1 μL のオリゴ (dT) と最大 12 μL の RNase フリー水と混合します。500 x g で30秒間遠心し、65°Cで5分間インキュベートします。
    2. 5x 反応バッファー 4 μL 、RNase 阻害剤 1 μL 、dNTP ミックス 2 μL 、逆転写酵素 1 μL をミキシングチューブに加えます。
    3. チューブを500 x g で30秒間回転させ、混合物を引き下げます。次に、チューブを42°Cで60分間インキュベートします。チューブを70°Cで10分間インキュベートして反応を終了します。
  12. 涙液中のmRNAの濃度が低いため、qPCR24には希釈されていないcDNAを使用することをお勧めします。この実験では、150 ngのcDNAを使用しました。 DNMT3a プライマーを使用してqPCRを実行します。
    フォワード:GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA、リバース:CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGAおよび GAPDH プライマー:
    フォワード:ACTGGCATGGCCTTCCGTTCTTA、リバース:TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCメーカーおよび機器の手順による指示に従います。
    1. qPCRサイクルの場合、次のプログラムを使用します:初期変性:95°Cで10分間、その後C 95°C-15秒、60°C-30秒、および72°C-30秒の45サイクルを行い、72°Cで5分間の最終延長で終了します。
    2. メルトカーブ解析を実施して、反応中のプライマーダイマーまたは非特異的アンプリコンの存在を評価します。温度上昇は50°Cから始まり、最終的な99°Cまでで、最初のステップでは90秒の初期ホールド、各ステップ間では5秒のホールドがありました。
    3. dPCR25では、目的のmRNAを検出するために必要なcDNAの量を最適化するために、段階希釈を行います。この実験では、ヌクレアーゼフリー水で希釈したcDNAを150 ng、75 ng、37.5 ng、および18.75 ngのcDNAに使用します。前述の DNMT3a のプライマーを使用しました。dPCRサイクルには、次のプログラムを使用します:初期変性:95°Cで2分間、続いて95°C-15秒および60°C-30秒の40サイクル。

結果

この論文に記載されているプロトコルは、ほとんどの分子生物学研究室で一般的に利用可能な技術を使用して、涙液から分子情報を取得するための簡単で手頃な方法を提供します。さらに、酵素活性検出にELISAなどの高感度技術を採用することで、プロトコルをスケールアップすることができます。

これらの処置後、総タンパク質収量は約3〜4μg/μLでした。クマシー染色した全タンパク質抽出物のSDSページ分析により、全網膜および涙液におけるタンパク質発現のパターンが明らかになりました(図2A)。

単離されたRNAのUV吸収比は260/280で、1.9から2.0でした。平均収量は134.8 ng/μLでした。qPCRは、ハウスキーピング遺伝子(グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、GAPDH)3 および推定バイオマーカー遺伝子(DNA-メチルトランスフェラーゼ3a、DNMT3a)26のプライマーセットを使用して実施されました。希釈されていないcDNAサンプル1:1(150 ng)を使用しました。

融解曲線解析を行い、qPCRソフトウェアでCtレートを計算しました。すべての実験は二重に行われました。分析の結果、サンプル中の標的mRNAの開始量の適切な範囲である20〜24のCt値が得られました(図2B)。しかし、 図2C の融解曲線解析では、標的mRNAの存在が少ないことが示唆されています。それにもかかわらず、2%アガロースゲルは、予想されるサイズでアンプリコンの存在を確認しました(図2D)。

dPCRは、 DNMT3aと同じプライマーセットのペアを使用して実行しました。使用したcDNAサンプルの希釈率は、1:1(150 ng)、1:2(75 ng)、1:4(37.5 ng)、1:8(18.75 ng)でした。すべての実験は二重に行われました。dPCRは、希釈していないサンプルの1.33コピー/μLから、8倍希釈サンプルの0.45コピー/μLまで検出できました(図3A、3B)。したがって、dPCRは、qPCRと比較して、涙液中に存在する標的mRNAに対する感度が高いことを示しました。

figure-results-1
図1:マウスからの涙液抽出プロトコルの概略図。(A) ティアコレクション。生後2ヶ月のC57BL/6Jマウスを3匹使用しました。(B)涙液産生は、ピロカルピンの腹腔内投与によって薬理学的に誘発されました。.シルマー・ストリップの配置を示す写真。(C)引き裂き加工。次に、涙液をシルマーストリップを使用して10分間収集し、微量遠心チューブに移しました。(D)シルマーストリップに集められた涙液を、滅菌水とプロテアーゼ阻害剤、または滅菌水のみで遠心分離しました。(E、F)これらのチューブは底部に穴が開いており、その後、液体の捕捉を容易にするために、新しい滅菌された1.5 mLチューブに移されました。(G、H)涙液は1.5チューブmLに集められます。(I)涙を集める手順の代表的な写真。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:分子応用のための涙液膜の下流分析(A)マウス涙液とレチナールタンパク質抽出物のSDS-PAGE。MW:分子量マーカー。レーン1:網膜のタンパク質プロファイル(30μg)。レーン2:涙液のタンパク質プロファイル(30μg)。(B)マウスの涙液中のGAPDHおよびDNMT3aのqPCR。平均CTとΔCTを表2に示します。(C)DNMT3aおよびGAPDH PCR産物の融解曲線解析。y軸は増幅反応における蛍光の変化率(dF / dT)を表し、x軸は°Cでの温度を表します(D)0.5 μg / mLのエチジウムブロマイドを含む2%アガロースゲル電気泳動におけるPCRアンプリコンの分析。レーンM:1 kbプラスDNAラダー。レーン1,2:それぞれGAPDHおよびDNMT3a PCRアンプリコン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:マウスの涙液における DNMT3a 発現のデジタルPCR(dPCR) (A)dPCRの結果は、 DNMT3a 転写産物のコピーを青色の点で示す1D散布図として表示されています。黒い点は、 DNMT3a 転写産物のコピーが存在しないパーティションです。(B) DNMT3a 転写産物のコピーを定量するための最適な濃度を決定するために、cDNAの希釈シリーズを生成しました。エラーバーは標準偏差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

マテリアル名形容
10% SDSゲル1つの分離ゲルの場合:3.8 mLの蒸留H2O;2.6 mLトリス;pH 8.8;1.5 M 3.4 mLアクリルアミド;100 μL 10% SDS;100 μL 10% APS;4 μL TEMED.
1つの収集ゲルの場合:2.72 mL蒸留H2O、0.52 mLトリス。pH 6.8;1.5 M 0.68 mLアクリルアミド、40 μL 10% SDS、40 μL 10% APS 4 μL TEMED。
電気泳動バッファー250 mM トリスベース、2 M グリシン、1% SDS
染色ソリューション以下の試薬を43mLの水に溶解します(琥珀色のボトルに室温で保存してください):クマシー0.25g;酢酸7mL;メタノール 50 mL
脱染ソリューション以下の試薬を63mLの水に溶解します(室温で保存してください):酢酸7mL;エタノール30 mL

テーブル 1.SDS-Pageの設定を行います。

遺伝子名CT1のCT2のSDとの平均ΔCT(カト)
ガプド20.1420.7320.44±0.17
DNMT3aの24.5924.9724.78±0.074.35

テーブル2.マウスの涙液中の DNMT3a と GAPDH のCt値。

ディスカッション

涙液は容易に入手でき、涙液中のバイオマーカーの測定は、さまざまなヒト疾患の早期診断のための成功した補完技術として採用することができる27。実験動物モデルにおける涙液組成の生化学的解析は、このアプローチを補完し、疾患の分子基盤の理解における大きな進歩を約束しますが、利用可能なデータやプロトコルが不足しているため、開発に至りました。このレポートに記載されている方法は、技術的に実行が簡単で、さまざまな疾患関連候補分子の差次的発現を事前に同定できます。

涙液の採取は、毛細管およびシルマーストリップ16,17、綿棒28およびスポンジ29のような種々の方法を通じて達成することができる。シルマーストリップ法は、アクセスのしやすさ、定量性、サンプル収集時の適応性、コスト、および実験室処理用の涙液成分の抽出の容易さから、好まれました。さらに、この方法は、費用対効果が高く、低侵襲であり、ペーパーフィルターストリップ16,17の組成のおかげで、角膜への損傷または損傷のリスクをもたらさない。このプロトコルの重要なステップには、ピロカルピンを使用した涙液産生の薬理学的刺激の必要性と、適切な溶出バッファーの選択が含まれます。

ピロカルピンは、M3ムスカリン受容体に結合し、外分泌腺の薬理学的刺激を引き起こし、涙液産生、唾液分泌、および排尿を促進することができるコリン作動性アゴニストです。ヒトでの研究は、涙液刺激が採取された液体の浸透圧を変化させないことを示したが30、それは明らかにタンパク質プロファイル31に影響を与える。ピロカルピンの外分泌腺のコリン作動薬理学的刺激剤および涙液分泌増強剤としての使用は、ウサギおよびマウス19,32,33において成功裏に報告されているが、タンパク質含有量に対する刺激の影響は評価されていない。この制限を回避し、実験条件間で涙液プロファイルを正確に比較できるようにするには、特定の収集設定を考慮することが重要です。同様に、涙液採取の前にすすぎステップを導入することは、眼の表面の事前の汚染を避けるために有益である可能性があります。このプロトコルでは、30 mg / kgの濃度のピロカルピンが使用されました13。この薬剤を注射した後もマウスは動かず、落ち着いていたため、麻酔なしで涙液を採取することができ、サンプルの採取が容易でした。

適切な溶出バッファーの選択は、涙液サンプルの生化学的組成とストリップからの生物学的物質の回収率を分析するための選択された方法と密接に関連しています。例えば、患者におけるシルマーストリップからのタンパク質保持に焦点を当てた比較研究では、100 mM重炭酸アンモニウムと0.25%ノニデットP40(NP40)からなるバッファーが、プロテオミクスまたはマルチプレックスELISA分析アプリケーションにおいて優れた結果をもたらすことが確立されました17。私たちの手では、滅菌水の使用がSDS-PAGEで全タンパク質抽出物を視覚化し、PCRによって目的の遺伝子のmRNAを検出するのに十分であることが証明されました。

マウスの涙液中の DNMT3a および GAPDH のmRNAの存在を評価するために、qPCRとdPCRの性能を比較しました。qPCRの融解曲線で観察されるプライマーダイマーの存在は、 DNMT3a 転写産物の存在量が少ないことに起因しています。実証されているように、dPCRは、希釈されていないサンプルと希釈したサンプルでこれらのサンプル中の標的mRNAを検出する際の感度と有効性が著しく高くなっています。この正確な検出機能により、dPCRはマウスの涙液分析に適した方法となり、研究者や臨床医は将来の研究や潜在的な臨床応用のための信頼できるツールを提供します。

動物モデルにおける涙液サンプル採取のための標準化されたプロトコルの開発は、研究における大きな進歩を表しています。このプロトコルは、涙液サンプルの体系的かつ正確な収集を容易にするだけでなく、さまざまな研究分野での応用に幅広い可能性を開きます。動物モデルから涙液サンプルを採取する能力により、幅広い疾患や状態の調査が可能になり、新しいバイオマーカーや潜在的な治療法の探索が可能になります。さらに、標準化されたプロトコールを確立することで、異なる研究や研究室間での結果の再現性が促進され、研究の妥当性と信頼性に貢献します。最終的に、動物モデルにおける涙液サンプル採取法のこの進歩は、重要な発見を推進し、さまざまな疾患の病態生理学の理解を深め、診断、治療、予防の新たな道を開く可能性を秘めています。

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、VELUX STIFTUNG[プロジェクト1852]からM.L.への支援を受け、CONAHCYTからM.B.(836810)、E.J.M.C.(802436)、A.M.F.(CVU 1317418)への大学院フェローシップ助成金によって支援されました。研究室、Centro de Investigación sobre el Envejecimiento、Departamento de Farmacobiología (Cinvestav)の全てのメンバーに対し、刺激的な議論に貢献してくださったことに心から感謝申し上げます。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-メルカプトエタノールギブコ1985023
2x Laemmli バッファーバイオラッド16-0737
酢酸キミカ・マイヤー64-19-7
アクリルアミドシグマ・アルドリッチA4058
ブラッドフォード試薬シグマ・アルドリッチB6916
クロロホルムシグマ・アルドリッチ1003045143
クマシーブルーR 250米国生物学的6104-59-2
エタノールキミカ・リケ64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA ラダーサーモフィッシャーサイエンティフィックSM1331
グリセロール米国生物学的G8145
グリシンサンタクルスSC-29096
グリコーゲンロシュ10901393001
HClキミカ・リケ7647-01-0
イソプロピルアルコールキミカ・リケ67-63-0
メタノールキミカ・マイヤー67-56-1
マイクロチューブ 1.5 mlアクシーゲンMCT-150-C
マイクロチューブ600&マイクロ;lアクシーゲンMCT-060-C
NaClシグマ・アルドリッチS3014
PCRチューブ&ストリップノバスビオPCR検査 0104
ピロカルピンシグマ・アルドリッチP6503-10g
プロテアーゼ阻害剤ロシュ11873580001
QIAcuity EvaGreen PCRキット (5mL)キアゲン250112
QIAcuity ナノプレート 26k 24 ウェル (10)キアゲン250001
リアル qPlus 2x マスター ミックス グリーンアンプリコンA323402
RevertAid First Strad cDNA合成キットサーモフィッシャーサイエンティフィックK1622
シルマーのテストストリップサントガル研究所SANT1553
SDSのシグマ・アルドリッチL3771
テメドシグマ・アルドリッチ102560430
TRI試薬シグマ・アルドリッチT9424-200MLのフェノールとイソチオシアネートグアニジニウムの単相溶液
トリス米国生物学的T8650
トリスベースケム・クルスSC-3715A

参考文献

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