方法論記事

虚血性脳卒中後の亜急性および慢性の時期に形質導入細胞におけるNeurod1の異所性発現を調査するためのAAVシステムとマウスモデル

DOI：

10.3791/66965

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2024年11月29日

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1Department of Surgery, Division of Anatomy, University of Toronto, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Donnelly Centre for Cellular and Biomedical Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、皮質虚血性脳卒中後のNeurod1のウイルス媒介性異所性発現を説明しています。Neurod1は、(1)脳卒中後の亜急性期(7日間)に野生型マウスにCre-Flex AAVシステムを使用して、(2)脳卒中後の慢性期(21日間)に条件付きレポーターマウスに単一のAAVベクターを使用して送達されます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

in vivoでの神経原性因子の異所性発現は、疾患モデルで失われたニューロンを置き換えるための有望なアプローチとして浮上しています。レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)などの非伝播性ウイルス様粒子系を介した神経塩基性ヘリックスループヘリックス(bHLH)転写因子の使用が広く報告されています。in vivo実験では、AAVは病原性が低く、翻訳可能性が高いため、ますます使用されるようになっています。このプロトコルは、虚血性脳卒中後の形質導入細胞における転写因子の異所性発現を調査するための 2 つの AAV システムについて説明しています。どちらのシステムでも、Neurod1の発現は短いGFAP(gfaABC(1)D)プロモーターによって制御されており、脳卒中後の反応性アストロサイトや、神経原性因子の発現と組み合わせた場合の内因性ニューロンでアップレギュレーションされます。記載されている虚血性脳卒中モデルでは、マウスの運動皮質にエンドセリン-1(ET-1)を注入することにより、局所虚血が誘発され、反応性GFAP発現アストロサイトと生存ニューロンに囲まれた病変が作成されます。脳卒中後の亜急性期(7日)および慢性期(21日)にNeurod1の発現を異所的に誘導するために、AAVの脳内注射が行われます。AAV注射後数週間以内に、異所性にNeurod1を発現するマウスでは、AAVコントロールウイルスを投与されたマウスと比較して、形質導入細胞中のニューロンの数が有意に多く同定されます。使用したAAVベースの戦略は、軽度から中等度の皮質脳卒中のモデルでレポーター遺伝子を発現するニューロンの数の増加の観察結果を再現しました。このプロトコルは、AAV ベースのシステムで送達される転写因子の異所性発現の影響を調査するための標準プラットフォームを確立し、脳卒中の文脈における神経原性因子発現の理解に貢献します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脳卒中は、世界中で障害の主な原因です1。脳卒中は、脳への血流が妨げられたときに発生します。これは、脳内の血管が破裂する出血性脳卒中(症例の~15%)、または脳への血流が遮断される虚血性脳卒中のいずれかで発生する可能性があります1。虚血性脳卒中は最も多く、脳卒中症例の~85%を占めています1。脳卒中は、脳へのグルコースと酸素の供給を減少させ、神経細胞の迅速な死と神経機能の障害につながります。

虚血性脳卒中は、興奮毒性、酸化的およびニトロソ化ストレス、カルシウム調節不全、皮質拡散脱分極、浮腫、血液脳関門(BBB)の破壊、および炎症のメカニズムを通じて、病変の中心部で数分以内に細胞が失われます2,3。梗塞周囲領域の細胞は、脳卒中後数時間以内に、数日間、アポトーシス細胞死を起こします4。梗塞周囲の環境は、損傷後に多様な役割を果たすミクログリアとアストロサイト(「反応性」アストロサイト)の活性化につながる炎症誘発性および抗炎症性のシグナルにさらされます5,6,7,8。反応性星状細胞は、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)のアップレギュレーション、および脳卒中後数日以内に病変の周囲に境界が形成されることを含む多くの表現型の変化を経ます。これは、病変の範囲を制限するのに役立つだけでなく、損傷した組織内の神経可塑性にも影響を与えます8,9,10。

直接的な細胞リプログラミングは、多能性状態を経ることなく、1つの成熟細胞タイプを別の成熟細胞タイプに変換することを可能にする11。常在する脳細胞を新しいニューロンに変えて、損傷で失われた細胞を置き換えることは、脳の回復のための魅力的な道筋を示しています。脳卒中は、失われたニューロンを置き換え、治療期間を広げ、最終的には機能回復を促進する治療法が必要であることを考えると、細胞ベースの治療の理想的な標的です。この目的のために、Ascl1、Neurog2、Neurod1、そして最近ではAscl1の変異型(Ascl1-SA6)を含むさまざまな基本-ヘリックス-ループ-ヘリックス(bHLH)神経原性転写因子を使用して、アストロサイトからニューロン(AtN)へのリプログラミングをin vitroおよびin vivoで実証する多くの論文があります11,12,13,14.考慮すべき重要なことは、結果、解釈、および研究間の比較に影響を与える可能性のある多くの実験計画因子です。Ghazaleらは、同じbHLH転写因子14を使用した場合、AtNのリプログラミング効率が異なるマウス株、AAV血清型、およびプロモーター間で異なることを実証しました。損傷モデル、脳領域、ウイルス投与、遺伝子送達のタイミング、リプログラミング因子、送達のモードなど、その他の考慮事項が結果に影響を与えます。最近の報告では、既存の形質導入されたニューロンが再プログラムされたニューロンと誤って解釈されていることが示されている15,16。これらの報告は必ずしもAtN変換が起こることを否定するものではありませんが、これらの研究は適切に制御された実験の重要性を強調しており、いくつかの論文は、この分野での次のステップについての推奨事項を示しています15,17,18,19。文献から明らかなことは、bHLH転写因子の異所性発現が、神経変性疾患/損傷の様々な動物モデルにおける機能的転帰を改善できることである13,20,21,22,23,24。

本明細書では、目的の転写因子であるこのプロトコルNeurod1は、形質導入細胞13,22において異所的に発現される。成体マウスの感覚運動皮質への虚血性脳卒中の確立されたエンドセリン-1(ET-1)モデルが使用されます。ET-1の注射は、機能障害22,23,25を含む虚血性脳卒中の病態生理学を模倣した局所血管収縮を引き起こします。一般的に使用されているshort-GFAPプロモーター(gfaABC(1)D)は、(1)野生型マウスにおけるAAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre送達と(2)tdTom-CreレポーターマウスにおけるAAV5-GFAP-Neurod1-Cre送達の2つのウイルス戦略を用いて、損傷部位および病変周囲領域におけるNeurod1の異所性発現を促進するために使用されます。脳卒中損傷を受けた脳におけるNeurod1の異所性発現の可能性をさらに理解するために、AAVは脳卒中後の亜急性期(7日間)または慢性期(21日間)に送達されました。どちらのパラダイムでも、異所性Neurod1発現後数週間以内に有意に多くの標識ニューロンが見つかりました。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、トロント大学のアニマルケア委員会によって承認され、 実験動物のケアと使用に関するガイド (第2版、 カナダ動物ケア評議会、2017年)に準拠しています。本研究では、野生型(C57BL/6J)およびトランスジェニックtdTom-Creレポーター(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 マウス系統を用いた。マウスは7〜9週齢で、オスとメスの両方が含まれていました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. エンドセリン-1脳卒中手術

注:すべての手術器具および材料は、手術前にオートクレーブで滅菌されます。定位固定装置フレームはPREemptで滅菌されます。シリンジは、手術前にPREempt、70%アルコールで滅菌され、滅菌PBSでプライミングされます。エンドセリン-1(ET-1)は、手術中ずっと氷上に保存されます。

  1. 手術を開始する前に、37°Cに設定された加熱パッドに清潔なケージを置いて、回復エリアを設定します。 または、ヒーティングランプを使用している場合は、ケージの半分だけを熱の下に置きます。
    1. イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけるには、動物管理委員会によって承認されたプロトコルに従ってください。マウスを麻酔誘導チャンバーに置き、酸素を1〜1.5 L / minにオンにしてから、イソフルラン気化器を3%〜5%に調整して麻酔を開始します。
  2. 動物が横になって立ることができなくなったら、動物をチャンバーから取り出し、きれいな面に置きます。手術前および手術中につま先のつま先つまみ反射がないことを確認することにより、動物が適切に麻酔されていることを確認してください。
    1. 麻酔器から伸びたノーズコーンを動物に固定し、イソフルランを1%〜2%に調整してメンテナンスします。イソフルランへの曝露を最小限に抑えます(誘導の場合は3%-5%で5分間、残りの時間は1%-2%)、手順が完了するまでに最大40分かかる場合があるためです。
  3. 動物の毛のトリマーを使用して、首/耳の後ろから動物の鼻までの毛皮を取り除き、手術のために頭蓋骨の皮膚を露出させます。
  4. 動物の体重を量り、体重に基づいて適切な用量の術前鎮痛薬(メロキシカム(2.0 mg / kg))を皮下投与します。.
  5. マウスの各眼に眼用潤滑剤軟膏を塗布し、麻酔中の角膜の乾燥を防ぎます。
  6. 毛皮で切り取った皮膚領域(ステップ1.3)を70%エタノールで滅菌し、続いてクロルヘキシジンアルコールを2回滅菌して手術野を形成します。
  7. マウスをマウスの定位固定装置フレームに移すには、まずマウスの鼻を定位固定装置の鼻円錐に置き、次にイヤーバーで頭蓋骨を安定させます。マウスを37°Cに設定した加熱パッドの上に置いて、手術中ずっと熱サポートします。イソフルランを1%〜2%に維持して、マウスが1呼吸/秒の呼吸数を示すようにします。
  8. 必要に応じて、処置中の角膜の乾燥を防ぐために、目の潤滑剤を繰り返し塗布します。マウスの体、耳の下に滅菌外科用ドレープを塗布して、滅菌野のサイズを広げます。
  9. #10メスの刃を使用して、目の中点の後ろから後頭部(頭頂骨)まで、動物の矢状面に平行な垂直切開を行います。皮膚を側面に向かってゆっくりと引っ込めて、頭蓋骨を露出させます。
  10. Qチップを使用して頭蓋骨の筋膜を乱し、頭蓋骨を乾燥させてブレグマを露出させます。
  11. .018インチのドリルビットを備えた高速定位固定装置ドリルを運ぶドリルホルダーを備えたマニピュレーターアームをセットアップします。
  12. 右感覚運動皮質の座標、ブレグマの外側2.25mm、吻側+0.0mm、吻側+1.0mm、尾側からブレグマまでの座標に、高速定位固定装置ドリルで3つのバリ穴(直径.018インチ)をドリルします。
  13. ドリルを26インチの長い針が付いた0.375Gシリンジと交換します。
  14. 滅菌PBSに溶解した400μM ET-1 1.5 μLをシリンジにロードします。良好な流れを確保するために、針の先端に液滴が観察されるまで、少量のET-1を放出します。滅菌済みのQチップを使用して、注射を行う前に余分な部分を拭き取ります。
  15. 硬膜に穴を開けずに、針の先端を頭蓋骨を過ぎて中央のバリ穴(右感覚運動皮質の+ 0.0前方および2.25 mmのブレグマの外側)に下げます。位置合わせが完了したら、針を脳内に1mm下げます。
  16. ET-1 1 μL を 0.1 μL ずつ分注して 1 μL を注入します。ハミルトンシリンジのプランジャーを前方に押して0.1μLを分注し、次の0.1μLを注入する前に1分間待ってから、1μLが分注されるまで注入します。
    1. 最後の0.1 μLを分注した後(0.1 μL x 10回の注入= 合計1 μL)、逆流を防ぐために針を10分間所定の位置に保持し、その後ゆっくりと上向きに引き出してシリンジを取り外してください。
  17. 注射中に針が詰まらないように、針の先端に滴が観察されるまで、少量のET-1を放出します。滅菌済みのQチップを使用して、注射を行う前に余分な部分を拭き取ります。次の動物にPREemptを注入する前にシリンジを滅菌し、続いて70%アルコールを注入し、次にPBSを滅菌します。
  18. 傷を閉じるには、4-0ポリソルブポリエステル滅菌縫合糸を使用して、頭蓋骨の上にある皮膚を縫合します。
  19. 縫合した部分に綿棒を使用して抗生物質軟膏を投与し、術後の感染を防ぎます。
  20. マウスを脳定位固定装置フレームから取り外し、回復エリアの清潔で予熱された動物用ケージに移します。イソフルラン気化器と酸素の電源を切ります。
  21. 麻酔からの回復期間中、ケージを加熱パッドの上に置いておきます。または、加熱ランプを使用する場合は、マウスをランプの下のケージの側面に置き、マウスが麻酔から目覚めたときにマウスがケージの冷たい側に移動できるようにして、過熱を防ぎます。マウスが麻酔から出てくるのを次の5〜10分で監視します。
  22. 次の3日間マウスを監視し(体重モニタリング)、術後ケア(水分補給を確保するための湿ったマッシュチャウ)、および鎮痛薬(2 mg / kgメロキシカム、1日2回皮下、2〜3日間)を提供する地元の動物管理委員会が定めた規制に従って。

2. 脳卒中後アデノ随伴ウイルス(AAV)の送達(亜急性モデル7日または慢性モデル21日)

注意: AAVの使用については、施設のバイオセーフティガイドラインを参照してください。トロント大学のガイドラインによると、この手術は封じ込めレベル2バイオセーフティキャビネットで行われます。

注:すべての手術器具および材料は、手術前にオートクレーブで滅菌されます。定位固定装置フレームはPREemptで滅菌されます。シリンジは、70%アルコールのPREemptで滅菌され、滅菌PBSでプライミングされます。AAVは、手術中ずっと氷上に保管されます。

  1. 手術を開始する前に、37°Cに設定された加熱パッドに清潔なケージを置いて、回復エリアを設定します。 または、ヒーティングランプを使用している場合は、ケージの半分だけを熱の下に置きます。
    1. イソフルランを使用してマウスを麻酔するには、マウスを麻酔導入チャンバーに入れ、酸素を1〜1.5 L / minにオンにし、イソフルラン気化器を3%〜5%に調整して麻酔を開始します(Instutionly承認されたプロトコルに従います)。
  2. 動物が横になり、きれいな面に立つことができなくなったら、動物をチャンバーから取り出します。手術前および手術中につま先のつま先つまみ反射がないことを確認することにより、動物が適切に麻酔されていることを確認してください。
    1. 麻酔器から伸びたノーズコーンを動物に固定し、イソフルランを1%〜2%に調整してメンテナンスします。イソフルランへの曝露を最小限に抑えます(誘導の場合は3%-5%で5分間、残りの時間は1%-2%)、手順が完了するまでに最大40分かかる場合があるためです。
  3. 動物の体重を量り、体重に基づいて適切な用量の術前鎮痛薬(メロキシカム(2.0 mg / kg))を皮下投与します。.
  4. マウスの各眼に眼用潤滑剤軟膏を塗布し、麻酔下での角膜乾燥を防ぎます。
  5. 毛皮で刈り取られた皮膚領域を70%エタノールで滅菌し、続いてクロルヘキシジンアルコールを2回投与して手術野を形成します。
  6. マウスをマウスの定位固定装置フレームに移すには、まずマウスの鼻を定位固定装置の鼻円錐に置き、次にイヤーバーで頭蓋骨を安定させます。マウスを37°Cに設定した加熱パッドの上に置いて、手術中ずっと熱サポートします。イソフルランを1%〜2%に維持して、マウスが1呼吸/秒の呼吸数を示すようにします。
  7. 必要に応じて、処置中の角膜の乾燥を防ぐために、目の潤滑剤を繰り返し塗布します。マウスの体、耳の下に滅菌外科用ドレープを塗布して、滅菌野のサイズを拡張します。
  8. まだ存在する場合は、手術用ハサミで縫合糸を切断し、鉗子でかさぶたを取り除きます。皮膚を引っ込めて頭蓋骨を露出させます。
    注:慢性モデルの場合、#10メスブレードで皮膚を切除する必要がある場合があります。
  9. 滅菌済みのQチップを使用して頭蓋骨を乾燥させ、バリ穴を見つけます。
  10. 定位固定装置のマニピュレーターアームを、長さ0.375インチの針が付いた26Gシリンジを搭載したニードルホルダーでセットアップします。
  11. 3.4 μL の AAV (1 x 109 Genome Copies(GC)/μL、慢性研究の場合は 1 x 1010 GC/μL) をシリンジにロードします。流れが良好であることを確認するには、針の先端に液滴が観察されるまで、少量のAAVを放出します。滅菌済みのQチップを使用して、注射を行う前に余分な部分を拭き取ります。
  12. ET-1 に使用される最初のバリ穴 (右感覚運動皮質の + 0.0 前方、2.25 mm のブレグマ) で頭蓋骨を越えて針の先端を下げます。位置合わせが完了したら、針を脳内に1mm下げます。(0 AP、+2.25 ML、ブレグマから-1.0 DV)。
  13. AAV 1 μL (急性期試験の場合は 1 x 109 GC/μL、慢性試験の場合は 1 x 1010 GC/μL) を一度に 0.1 μL 分注して注入します。ハミルトンシリンジのプランジャーを前方に押して0.1μLを分注し、次の0.1μLを注入する前に1分間待ちます。1 μLが分注されるまで注入します。最後の0.1 μLを分注した後(0.1 μL x 10回の注入= 合計1 μL)、逆流を防ぐために針を10分間所定の位置に保持し、その後ゆっくりと上向きに引き出してシリンジを取り外してください。
  14. 注射中に針が詰まらないように、針の先端に滴が観察されるまで、少量のAAVを放出します。滅菌済みのQチップを使用して、注射を行う前に余分な部分を拭き取ります。
  15. 残りの 2 つのバリ穴 (右感覚運動皮質の +1 AP、+2.25 ML、-1.0 DV、および -1 AP、+2.25 ML、-1.0 DV mm) への AAV 注入について、手順 2.11 から 2.14 を繰り返します。次の動物にPREemptを注入する前に注射器を滅菌し、次に70%アルコールを注入し、最後に滅菌PBSを注入します。
  16. 傷を閉じるには、4-0ポリソルブポリエステル滅菌縫合糸を使用して、頭蓋骨の上にある皮膚を縫合します。
  17. 縫合した部分に綿棒を使用して抗生物質軟膏を投与し、術後の感染を防ぎます。
  18. マウスを脳定位固定装置フレームから取り外し、回復エリアの清潔で予熱された動物用ケージに移します。イソフルラン気化器と酸素の電源を切ります。
  19. マウスをケージ内に入れ、ケージの外側をPREemptと70%アルコールで滅菌してから、麻酔からの回復のために加熱パッドの上に置きます。
    1. または、加熱ランプを使用する場合は、マウスをランプの下のケージの側面に置き、マウスが麻酔から目覚めたときにマウスがケージの涼しい側に移動できるようにして、過熱を防ぎます。マウスが麻酔から出てくるのを次の5〜10分で監視します。
  20. 次の3日間マウスを監視し(体重モニタリング)、術後ケア(水分補給を確保するための湿ったマッシュチャウ)と鎮痛薬(2 mg / kgメロキシカム、1日2回皮下、2〜3日間)を提供する地元の動物管理委員会が定めた規制に従って。

3. 組織の準備と解剖

  1. マウスを安楽死させるには、マウスにトリブロモエタノール(アベルチン)(濃度12.5 mg / mL、250 mg / BW(kg))を腹腔内注射し、完全導入のために2〜3分間待ちます。ケージからマウスを取り出し、つま先のつま先つまみ反射がないことを確認して、動物が適切に麻酔されていることを確認してください。
  2. ヒュームフードで、生理食塩水と続いて4%パラホルムアルデヒドで経心電26 を実行します。安楽死させた動物の頭に70%エタノールを浸すまでスプレーします。
  3. 大きなハサミを使って頭蓋骨の付け根で頭を切り落とします。まっすぐな4-1 / 2インチの虹彩はさみを使用して、頭蓋骨全体の正中線に沿って皮膚を切り開きます。皮膚を引っ込めて頭蓋骨を露出させます。
  4. 首の脊髄腔の開口部から、虹彩はさみを挿入し、矢状および前頭間縫合糸に沿って頭蓋骨を切り込みます。
  5. 次に、2つの眼窩にハサミを挿入し、前頭鼻縫合糸を切断します。
  6. 特に脳を傷つけないように注意してください。頭蓋骨プレートを左右にこじ開けて、脳が露出するまで開きます。
  7. 脳を4%パラホルムアルデヒドを含むシンチレーションバイアルに移します。脳を4%パラホルムアルデヒドに4°Cで4時間保持します。
  8. 次に、4%のパラホルムアルデヒドを30%のスクロースに置き換えることにより、脳を凍結保護します。脳がバイアルの底に沈むまで(~12時間)、脳を30%スクロースに4°Cで保持します。

4.凍結した脳の切片化

  1. クライオスタットチャンバーの温度を-20°Cから-26°Cの間に設定します。
  2. 小脳を横切って冠状に切断し、脳の平らな尾側部分を最適な切断温度化合物(OCT)を備えたクライオスタットチャックに取り付けます。
  3. 脳のあるチャックをディスクホルダーに置き、嗅球をナイフの刃に合わせます。
  4. 脳を厚さ20μmの冠状スライスに切片化します。切片化された脳のスライスに縞や引っかき傷が入らないように、切片化プラットフォームにテープを貼って、アンチローリングプレートとプラットフォームの間に小さな隙間を作ります。ペイントブラシを使用して、正に帯電したスライドガラスにキャプチャする前に、セクションの向きを調整できます。
  5. 脳切片を含むスライドは-20°Cで保存してください。

5. 免疫組織化学および定量

  1. 汎ニューロンマーカーであるNeuNに対する一次抗体を使用して、免疫組織化学の切片を標準プロトコル22,26に従って処理します。
  2. 凍結保存した脳切片を室温で5分間解凍します。切片を1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でそれぞれ5分間3回洗浄します。
  3. 0.3% Triton X-100のPBS溶液で切片を室温で20分間インキュベートし、透過処理します。
  4. ブロッキング溶液(5%正常ヤギ血清および0.3%Triton X-100 in PBS)を調製し、ブロッキング溶液中の切片を室温で1時間インキュベートします。
  5. 一次抗体であるrabbit anti-NeuNをブロッキング溶液中で1:500の比率で希釈します。切片を一次抗体溶液と入れて4°Cで一晩インキュベートします。
  6. 切片を0.3% Triton X-100含有PBS溶液で3回、各洗浄で5分間洗浄します。
  7. 二次抗体であるヤギ抗ウサギ568または488をPBSで1:1000の比率で希釈します。切片を二次抗体溶液と室温で1時間インキュベートし、光から保護します。
  8. 0.3% Triton X-100をPBS溶液で3回、各5分間洗浄します。切片をDAPI(PBS中1:10,000)で室温で5分間インキュベートします。
  9. 切片をPBSでさらに3回、それぞれ5分間洗浄します。蛍光封入剤とガラスカバースリップを使用して、ステンドした部分をスライドガラスに取り付けます。取り付けられたスライドを一晩乾かします。
  10. 20倍対物レンズと共焦点顕微鏡を使用して、各動物の3つの異なる冠状切片(前方の脳梁の交差部と後方の交連部の交差の解剖学的領域の間)の脳卒中病変の周りのReporter+細胞のビューを取得するために、染色スライドを画像化します。
    注意: AAVスプレッドの距離は半球内で異なります。しかし、私たちの経験とReporter+細胞の組織後プロセシング分析に基づくと、AAVの広がりは一般にブレグマから約+3 mmから-3 mmに及びます。脳梁が正中線を横切る領域と前交連接続の間の領域にある脳卒中病変の周囲のレポーター+細胞(NeuNの不在/まばらな染色によって識別される)を定量化する必要があります。
  11. 形質導入ニューロンの定量化には、共局在解析を行います。脳切片中のダブルポジティブ細胞(Reporter+NeuN+)の数と形質導入細胞の総数(Reporter+)を手動でカウントします。本明細書の結果について、マウス当たりの3つの冠状切片から、病変(内側、外側、および下)を囲む>3の視野を数えた。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

野生型(C57BL/6J)およびトランスジェニックtdTom-Creレポーター株(具体的にはB6.ET-1脳卒中傷マウスには、Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 2つのAAV5ベースのシステムが使用されました(図1A-C)。脳卒中の亜急性モデルでは、Neurod1をCre-Flex AAVシステムにパッケージ化し、脳卒中後7日目に野生型マウスに送達しました(図1B)。2番目のFlexベクターには、ヘテロタイプの逆平行loxP型組換え部位に隣接するCAGプロモーターによって駆動されるGFPの逆配列が含まれています(図1B)。両方のウイルスコンストラクトは、脳卒中後に同時に注射されます。形質導入細胞でCreが発現すると、GFPは反転して組換え部位で切除され、配列がセンス方向に向けられるため、GFPの発現が可能になります。したがって、Creを発現する細胞はGFP陽性となり、Cre-Flexベクターによって形質導入されたことを示します。亜急性モデルでは、形質導入後21日(すなわち、脳卒中後28日)にマウスを屠殺し、脳卒中損傷脳の実質において、形質導入細胞(GFP+)の数とNeuN+GFP+(NeuNを発現する形質導入細胞)細胞の数をカウントしました。図2Aに見られるように、ニューロンは虚血性損傷の部位で失われます。Cre-Flex AAVシステムを使用した亜急性パラダイムにおける形質導入細胞の定量化は、Stroke-Cre対照マウスと比較して、Neurod1治療マウスの有意に多くの標識ニューロン(NeuN + GFP + / GFP +細胞)を明らかにします(43.05 +/- 5.50%対18.43 +/- 3.03% NeuN + GFP + / GFP +細胞、Stroke-Neurod1対。Stroke-Cre(対照)処理マウス、それぞれ)(p = 0.0172)(図2B、C)。

別の一連の実験では、脳卒中の慢性モデルでAtN変換が行われました(図1B、C)。転写因子 Neurod1 は、脳卒中後21日目にET-1脳卒中傷害tdTom-Creレポーターマウスに送達されました(図1C)。野生型マウスに用いられたCre-Flexシステムと同様に、 Neurod1 の発現は短鎖GFAPプロモーターによって駆動されました。しかし、このシステムでは、 Neurod1 に続くCreリコンビナーゼとともに単一のAAVコンストラクトが使用されました(図1B)。したがって、GFAP発現細胞はCreリコンビナーゼを産生し、AAV形質導入された細胞を示すtdTomレポーターを誘導します。マウスは脳卒中後77日(AAV後8週間)に屠殺されました(図1C)。 図3Aに見られるように、tdTom-Creマウスでは脳卒中後77日目に皮質病変が観察されます。ニューロンマーカーであるNeuN+を発現する形質導入細胞の数を定量化し(脳卒中後の慢性期における(NeuN+tdTom+/tdTom+細胞の相対割合))、Stroke-Neurod1 を投与されたマウスは、Stroke-Cre 対照マウスと比較して有意に多くの標識ニューロンを有することを発見しました(74.81 +/- 4.835% vs. 53.05 +/- 5.028% NeuN+tdTom+/tdTom+ cells.Stroke-Cre (対照)処理マウス、それぞれ)(p = 0.0355)(図3B、C)。

全体として、この結果は、野生型およびtdTom-Creレポーターマウスの亜急性期および慢性脳卒中後期の両方で、ニューロンのベースライン形質導入と、 Neurod1 送達を伴うNeuN+を発現する形質導入細胞の数が多いことを実証しています。これは、2つの異なるAAVベースのシステムを用いています。

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図1: Neurod1、ベクトル、およびタイムラインの異所性発現 (A)マウス運動皮質へのエンドセリン-1(ET-1)注入による脳卒中誘発のグラフ表現。アデノ随伴ウイルス(AAV)は、ET-1注射部位と病変の周囲、前方および後部1mmの3つの部位に送達されます。運動皮質にAAV-Neurod1 を導入された細胞を示す拡大パネル。(B)野生型マウスに送達されたCre-Flexシステムの2つのAAVベクターの概略図(上面)。AAV5ベクター1には、短いGFAPプロモーター、 Neurod1 転写因子、およびloxP部位(黒の三角形)とlox2272部位(白の三角形)に挟まれたCreリコンビナーゼ配列が含まれています。AAV5ベクター2は、loxPおよびlox2272サイトのペアに隣接する逆GFP遺伝子レポーター配列を運びます。細胞内で両方のベクターを形質導入すると、Creを介した切除と逆転が起こり、形質導入細胞を標識するためのGFP発現が可能になります。 Neurod1 は、1つのAAV5ベクターを使用してtdTom-Creマウスにも導入されました(下パネル)。AAV5ベクター1では、短いGFAPプロモーター、 Neurod1 転写因子、およびCreリコンビナーゼ配列がパッケージ化されています。形質導入細胞におけるCreの発現は、loxP部位(黒色の三角形)のStopコドンの切除を促進し、tdTomatoの発現を可能にします。(C)Cre-Flexシステムは、脳卒中後の亜急性期(脳卒中後7日目)にAAVを注射した野生型マウスでテストされました。野生型マウスは、AAV形質導入の21日後(脳卒中後28日)に屠殺されました。脳卒中後の慢性期(Post-Stroke Day 21)にtdTom-CreマウスにAAVを送達し、AAV形質導入後56日(脳卒中後77日)にマウスを屠殺しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:脳卒中後の亜急性期にCre-Flex AAVを使用した異所性Neurod1送達は、NeuNを発現する形質導入細胞の数の増加につながります。 (A)脳卒中後28日目に運動皮質を介した冠状脳切片の免疫染色をStroke-Creコントロール(左)およびStroke-Neurod1(右)マウスから。病変の部位にニューロンの喪失が観察されます(白い破線)。皮質には、形質導入細胞(GFP+、緑)、ニューロン(NeuN+、赤)、および共局在するNeuN+GFP+(オレンジ)細胞が見られます。スケールバー:250μm.(B)ニューロン(NeuN+、赤)とAAV形質導入GFP+(緑)を示すStroke-Creコントロール(上)とStroke-Neurod1(下)の脳組織の代表的な画像。白で縁取られたインセットは、各チャネルのセルのクローズアップを示しています。白い矢印はAAV形質導入細胞(GFP+)を示します。白い矢印は共局在したNeuN+GFP+細胞を示しています。スケールバー:125 μm. (C) Stroke-CreおよびStroke-Neurod1マウスにおけるNeuN+GFP+/GFP+細胞の定量。N = グループあたり3匹のマウス。データは、平均± SEM. Shapiro-Wilk Test (p = 0.3223) で表されます。対応のないt検定、*p < 0.05。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:脳卒中後の慢性期におけるtdTom-Creレポーターマウスへの異所性 Neurod1 の送達は、NeuNを発現する形質導入細胞の数の増加につながります。 (A)脳卒中後77日目の運動皮質を介した冠状脳切片の免疫染色 脳卒中-Cre コントロールおよび脳卒中-Neurod1 マウスによる。虚血性損傷部位(白い破線)にニューロンの喪失が見られます。形質導入細胞は、梗塞周囲でtdTom(赤)で標識されます。NeuN+tdTom+(オレンジ色)は、神経細胞マーカーを発現する形質導入細胞です。スケールバー:250μm.(B)ニューロン(NeuN+、緑)とAAV形質導入細胞(tdTom+、赤)を示すStroke-Cre コントロール(上)とStroke-Neurod1 (下)の脳組織の代表的な画像。白で縁取られたインセットは、各チャネルのセルのクローズアップを示しています。白い矢印はAAV形質導入細胞(tdTom+)を示します。白い矢印は共局在したNeuN+tdTom+細胞を示しています。スケールバー:125μm.(C)慢性パラダイムにおけるNeuN+tdTom+/tdTom+細胞の定量は、 Neurod1 処理マウスにおいてNeuN+(NeuN+tdTom+/tdTom+細胞)を発現する形質導入細胞が有意に多いことを示しています。N = グループあたり3匹のマウス。データは平均±SEMで表されます。 Shapiro-Wilk Test(p = 0.2044)。対応のない t検定、*p < 0.05。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、軽度から中等度のET-1皮質脳卒中モデルのコンテキストでNeurod1の異所性発現を調査するための2つのAAVシステムとマウスモデルについて詳しく説明します。ET-1 脳卒中に関連する多くの重要なステップは、損傷の再現性と一貫性のために考慮することが重要です。バリ穴は、意図しない外科的損傷を防ぐために、硬膜に穴を開けずに慎重に穴を開ける必要があります。一貫したランドマーク(この場合はbregma)を使用して、同様の関心領域(この研究では感覚運動皮質)を確保することが重要です。これは、病変の位置とサイズが機能的転帰に影響を与えるため、行動評価を使用した研究では特に重要です13,22,25,27。最も重要なことは、再現性のある結果を得るためには、ET-1の注入速度と外科医がシリンジに加える圧力が一貫している必要があるということです。注目すべきは、シリンジの針が詰まる可能性があり、正確なET-1送達を確実にするために動物間で洗浄する必要があることです。組織の細胞解析中に脳卒中病変が観察されない場合、手術中に針が詰まった可能性があります。問題が解決しない場合は、過去にロット依存性の効力の問題が観察されているため、製造元から新しいロットのエンドセリン-1を入手してください。

AAV を送達するための外科的処置の手順は、ET-1 脳卒中導入プロトコルの手順と似ています。したがって、前述の考慮事項は重要です。さらに、AAVウイルスの力価と量は、形質導入効率をグループ間で比較できるように一貫している必要があります。このプロトコルでは、急性期研究には 1 x 109 GC/μL の AAV を投与し、慢性研究には 1 x 1010 GC/μL の AAV を投与しました。ウイルスの投与量は、人工的な誤発現を最小限に抑えるのに十分な低さでありながら、十分な細胞形質導入を確保するのに十分な高用量を選択し、実験グループ間の違いを検出できるようにすることが重要です。このような研究に最適なウイルス用量範囲は、107-10 10 GC /μL13,24であると決定されています。.AAVの力価が高いと、対照群のニューロンが広範囲に標識されるだけでなく、アストロサイトーシスを誘発し、血液脳関門を破壊し、炎症反応をアップレギュレートすることも示されています28,29。脳卒中後のウイルス媒介性転写因子送達を調査した研究では、AAV注射に異なる送達部位が使用されています。1件の研究では、脳卒中病変部位13への単回AAV注射を用いた形質導入細胞の標識が成功したことが報告されている。他の研究は、梗塞領域30の周りの1〜3つの領域を対象としています。本明細書では、AAVを3つの場所で送達し、ET−1注射部位の座標に1回、病変部位を囲む2回(1回は前方1.0mmに注射し、1回は後部1.0mmに注射)して、病変周囲グリア境界9の反応性星状細胞を形質導入することを目標とした。組織の細胞解析中に、蛍光細胞がまったく観察されないか、または非常に少ない(1〜10細胞/切片)場合は、注射中に針が詰まっているか、AAVが凍結融解されすぎているため、ウイルスが不活化されている可能性があります。

形質導入の効率は、軽度から中等度の脳卒中モデルで異なる時期に検討され、その結果は、脳卒中後の亜急性期と慢性期の両方で、Neurod1で治療された脳で有意に多くのニューロンが標識されることを示しました。ここで紹介する研究は、脳卒中後の慢性期におけるNeurod1形質導入を初めて実証した研究であり、脳卒中後8週間という期間でNeurod1を異所性に発現するニューロンを明らかにしたものです。脳卒中傷を負った脳では、Neurod1を投与された脳と対照ベクターを比較して、形質導入されたニューロンの数の増加が見られるという知見は、Neurod1がAtN変換に関与していることと一致していますが、細胞の結果を解釈するには、実験パラダイムの限界について十分な知識が必要です。AtN変換を調査した発表された研究の大部分は、脳卒中を含む神経変性疾患の反応性星状細胞でGFAPがアップレギュレーションされるため、GFAPをプロモーターとして利用しています4,31。しかし、低GFAP発現はニューロンでも起こることが示されている32。これは、ここで報告された知見と一致しており、そこでは、対照群(Stroke-Cre)における形質導入細胞の割合が既存のニューロンである32。具体的には、このプロトコルのStroke-Cre対照群は、NeuN+Reporter+細胞の18.43 +/- 3.03%および53.05 +/- 5.028%の標識を示し、これは既存のニューロンの標識を表し、ニューロンにおけるGFAPプロモーター駆動発現を示している。実際、Neurod1の標的発現は、ウイルスの親和性を含む多くの要因に依存します。AAV5は、感覚運動皮質を含む異なる脳領域で異なる効率でニューロンを形質導入することが示されており、AAV血清型が局所的な細胞親和性を有することを示しており、これは転写因子の異所性発現を誘導する研究で考慮する必要がある31,33。マウス系統は、AAV形質導入にも影響を与えることがある14,34。野生型(C57BL/6J)マウスとFVB/Nマウスの線条体におけるAAV形質導入を比較した研究では、2つの系統で細胞親和性と形質導入効率にばらつきがあることがわかった34。

Cre-Flexシステムの利点は、野生型マウスの長期標識に使用できることであり、これによりCre-reporterマウス系統15,35に存在する非特異的なCre発現の問題が軽減される可能性があります。Cre-Flexシステムの欠点は、ウイルス産生中にウイルス粒子の0.1%〜0.8%が組換えLoxP部位を有するため、Cre非依存性の導入遺伝子発現が起こる可能性があることである36。これらの知見は、例えば、Aldh1l1-CreERT2マウス系統を用いてAAV投与前にアストロサイトを事前に標識し、結論を報告する際にAtN変換が過大評価されないようにするなど、系統追跡実験の重要性を強調している15。研究は、下流の遺伝子(Neurod1など)によるシス調節によるヒトGFAPプロモーター(これらの研究で使用されているもの)の活性化が、内因性ニューロンにおけるGFAP発現をもたらし、治療群15,32における標識ニューロンの数の増加につながる可能性があることを示唆している。まとめると、これらの研究と本明細書の知見は、系統追跡実験、例えば、AAV投与前に星状細胞またはニューロンを事前に標識することの重要性を強調しており、分析中に既存のニューロンと内因性のニューロンを区別するためのものである15。

ニューロンの形質導入を減らすことができる次のステップを検討する際には、さまざまなAAV血清型および/またはあまり乱雑でない星状細胞特異的プロモーターの使用が有用であろう19。アストロサイトの不均一性を説明する報告の数の増加は、アストロサイトの異なる亜集団が一般にAtN変換に対してより感受性である場合、遺伝子発現特異性にさらに影響を与える可能性がある37,38,39,40。

また、傷害や疾患の前臨床モデルで使用される動物の年齢も重要な考慮事項であり、結果にばらつきをもたらす可能性があります。例えば、神経外傷の場合、年齢はアストロサイトの反応性に影響を与える可能性があり、これはAtN変換41の研究結果に影響を与える。さらに、Cre誘導性レポーターラインは、時間の経過とともに発現特異性を失う可能性があり、これは結果測定42に影響を与える可能性があります。今日まで、高齢の動物におけるリプログラミングは包括的に調査されてこなかった43。

このプロトコルでは、脳卒中後の 2 つのフェーズでの AAV 送達について説明しています: (1) 亜急性期 (7 日後) と (2) 虚血性脳卒中後の慢性期 (21 日後)。慢性脳卒中モデルにおけるNeurod1の異所性発現は調べられていません。したがって、この後期段階で有意に多くのニューロンが標識されるという観察結果は、慢性脳卒中の脳卒中の回復を促進することを目的とした将来の研究にとって重要な意味を持っています。脳卒中後の機能的転帰は、治療的介入13,22,25,27の成功の最も臨床的に関連性のある尺度であるため、脳卒中転帰を向上させるNeurod1の異所性発現の可能性を検討する研究では、行動評価を組み込む必要があります。

現在、脳卒中後の亜急性期および慢性期に脳卒中誘発性障害に苦しむ患者が利用できる治療法はありませんが、リハビリテーションは例外であり、利益は限られています。グリアにおける神経因性bHLH遺伝子の強制発現は、脳卒中後の機能的転帰を改善することが示されています22,30。この知見は、Neurod1の異所性発現が、対照ベクターを投与されたマウスと比較して、AAV送達後3週および7週のニューロン形質導入を増加させることを示すAtNリプログラミング研究と一致しています。最も重要なことは、いくつかの記事が、AtNリプログラミング分野17,18,19,22における研究制御、デザイン、および解釈に関する推奨事項を概説していることです。この目的のために、このプロトコルでは、脳卒中後の転写因子の異所性発現のためのAAVシステムとマウスモデルについて説明しており、観察の根底にある細胞メカニズムに情報を提供し、さらなる調査を進めるために使用できます。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、Heart and Stroke Foundation、Ontario Institute of Regenerative Medicine、Canada First Research Excellence Fund(Medicine by Design、MbD)、Connaught Innovation Award(トロント大学)の支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
#77ドリルビット(.018")David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreベクトル Biolabs
Absorbable Suture with Needle Polysorb&trade(針ポリソーブ&貿易付き吸収性縫合糸);ポリエステル CV-15 3/8 サークル テーパー ポイント ニードル サイズ 4 - 0 編組CovidienGL-881
抗 NeuN 抗体 (ウサギ) ミリポアシグマABN78 
C57BL/6 マウスチャールズ リバー027
クロルヘキシジン溶液PartnarPCH-020
Contec™ PREempt™RTU消毒液フィッシャーサイエンティフィック29-636-6212
クライオスタットサーモサイエンティフィック HM525 NX 
エンドセリン1ミリポアシグマ05-23-3800-0.5MG
フェザーセーフティカミソリミクロトームブレードフェザー12-631P
フィッシャーブランド カバーグラス:長方形フィッシャーサイエンティフィック12-545M 
蛍光実装用メディウムAgilent TechnologiesS3023 
ハミルトン シリンジハミルトン カンパニー7634-01
高速固定装置ドリルデビッド・コップフ・インスツルメンツ1474
メタカム・ソリューション (メロキシカム)ベーリンガー・インゲルハイム
O.C.T コンパウンドフィッシャー・サイエンティフィック23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreベクター・ビルダーP190924-1001suq
ポリダーム軟膏USPタロ2181908
ソムニサイエンティフィック™ 動物温度加熱パッドフィッシャーサイエンティフィック04-777-177
固定装置ビッド・コップフ インスツルメンツモデル902
スーパーフロストプラス 顕微鏡スライド、白いフィッシャーブランド12-550-15
tdTomato レポーター マウス ジャクソン研究所007914
V-1卓上実験動物麻酔システムVetEquip901806
ウデ

参考文献

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