方法論記事

in vitroでのTh17分化の研究のためのレトロウイルスCRISPR/Cas9媒介遺伝子ターゲティング

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DOI：

10.3791/66966

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2024年11月15日

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1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

Cas9トランスジェニックマウスの初代T細胞へのガイドRNAのレトロウイルス形質導入のプロトコールを提示し、Th17分化の研究における遺伝子編集の効率的な代替手段を提供します。

要約

IL-17Aを産生するヘルパーT細胞(Th17細胞)は、免疫防御に重要な役割を果たし、自己免疫疾患に関与しています。CD4 T細胞は、in vitro で抗原と明確に定義されたサイトカインカクテルで刺激し、 in vivoでTh17細胞の分化を模倣することができます。Th17分化制御機構については、 in vitro Th17分極アッセイを用いて研究が盛んに行われています。

従来のTh17分極法では、通常、遺伝子改変マウスからナイーブCD4 T細胞を採取して、特定の遺伝子がTh17の分化と機能に及ぼす影響を研究します。これらの方法は時間と費用がかかる場合があり、ノックアウト動物の細胞外因性因子の影響を受ける可能性があります。したがって、ガイドRNAのレトロウイルス形質導入を使用して、CRISPR/Cas9ノックイン初代マウスT細胞に遺伝子ノックアウトを導入するプロトコルは、非常に有用な代替アプローチとして機能します。この論文では、レトロウイルスを介した遺伝子ターゲティング後にナイーブな初代T細胞をTh17細胞に分化するためのプロトコルと、感染と分化効率をアッセイするためのその後のフローサイトメトリー分析法を紹介します。

概要

Th17細胞は、CD4+ Tヘルパー細胞のユニークなサブセットであり、細胞外細菌や真菌の根絶に不可欠であり、さまざまな自己免疫疾患1,2,3において重要な役割を果たしています。新たな証拠は、Th17細胞が不均一性を示し、環境的および遺伝的要因の影響を受けて、病原性および非病原性の両方の条件で機能することを示唆しています。Th17細胞の分化、可塑性、不均一性を制御する制御過程を解明することは、より効果的な免疫治療戦略を進めるために重要です。

遺伝子組み換え動物は、Th17細胞の分化と機能の主要な制御因子を明らかにするために広く使用されています。遺伝子改変動物の使用には、in vivoでの完全な操作が必要であり、生理学的条件や疾患モデルにおけるその役割の信憑性と体系的な研究を提供します。それにもかかわらず、このアプローチによるハイスループットスクリーニングは、ほとんど実用的ではありません。In vitro分極アッセイは、Th17細胞分化を研究するための代替手段を提供します。インターロイキン6(IL-6)とトランスフォーミング成長因子β1(TGFβ1)の組み合わせは、非病原性Th17細胞の発達を促進することが示されていますが、IL-6、IL-1β、およびIL-23は、病原性Th17細胞(pTh17)の分化を促進することに関与しています4,5。

CRISPR/Cas9技術の登場により、特定の塩基での正確なゲノム編集が容易になりました。レトロウイルス形質導入と組み合わせることで、このアプローチは、Th17細胞の潜在的な調節因子をスクリーニングし、機能的に研究するための強力で効率的かつ経済的な遺伝的方法を提供します6,7。本研究では、Th17分極系内でのレトロウイルス形質導入の手順を改善しました。レトロウイルスシステムを用いて、マウスからCas9を発現する活性化ナイーブT細胞に感染させました。細胞には、U6プロモーターによって駆動されるガイドRNA(gRNA)コンストラクトと、EF1aプロモーターの制御下にある蛍光レポータータンパク質をコードする遺伝子を投入して、標的遺伝子のノックアウトを促進しました。次に、形質導入したT細胞を特定のサイトカイン条件下で培養し、Th17細胞への分化を誘導しました。特に、RoRγtをノックアウトすると、対照群と比較してIL-17Aの産生が大幅に減少しました。このシステムの有効性は、活性化された初代T細胞の最適化されたレトロウイルス産生と形質導入条件に依存し、Th17の分化と機能における特定の遺伝子を研究するための迅速かつ実用的なアプローチを提供します。

プロトコル

すべての手順は、実験動物福祉倫理委員会、仁済病院、上海交通大学医学部によって承認され、機関のガイドラインに準拠しています。

1. レトロウイルスの産生

  1. レトロウイルスコンストラクトの調製
    1. CRISPickツール(https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)を使用して、RORγtノックアウト8のsgRNAを設計します。参照ゲノムをMouse GRCm38と指定し、PAM配列をCRISPRkoガイドシステムに基づくNGG(for SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA)として選択します。標的遺伝子の名前またはその他の標的遺伝子のフォーマットを検証し、有効なインプットを提出してsgRNA候補を取得します。その他のパラメータをデフォルト値に設定し、sgRNA targetをRORγt(Rorc, Gene ID: 19885)に設定してTh17の分化を乱し、マウスGeCKO v2ライブラリからノンターゲティングsgRNA(略称:sgNT、配列:GCGAGGTATTCGGCTCCGCG)を選択します。
      注:このツールは、ガイドRNAを設計するためのさまざまなクリック可能なオプションを提供し、特定の要件を満たすように便利にカスタマイズできます。
      1. Quick Gene Lookup列の下の検索ボックスにターゲット遺伝子名を入力します。システムは、正確な選択を確実にするために、ターゲット遺伝子の遺伝子IDとフルネームを表示します。
        注:さまざまな標的遺伝子フォーマットを検証するための追加オプションが利用可能です。
    2. Rorc(略称:sgRorc)配列を、高い組み合わせランクとピック順に従って1つ選択し、オフターゲットマッチを回避し、オンターゲットの有効性を高めます(sgRorc配列:GTCATCTGGGATCCACTACG)。sgRorcおよびsgNTの2つのオリゴヌクレオチドを合成します:フォワードオリゴについては、各ガイド配列の5'末端に「gttttagagctagaaatagcaagttaaaat」という配列を付加します。リバースオリゴについては、各ガイド配列の3'末端に"tttcgtcctttccaagatatataaagc"という配列を付加します。
      注:通常、sgRNA配列には複数の選択肢があります。ノックアウト効率を評価するには、同じ遺伝子型を標的とする2つまたは3つのsgRNA配列を選択することが不可欠です。予備実験では、 Rorc を標的とする2つのgRNAを比較対象として選択しました(sgRNA配列1:GTCATCTGGGATCCACTACG、sgRNA配列2:CTTGAGTATAGTCCAGAACG)。実験結果から、現行の方法で提示されたgRNA(sgRNA配列1)は、両者間でより高いノックアウト効率を示すことが示されました。
    3. 上記のプライマーを用いてDNAポリメラーゼを用いてsgRorcおよびsgNTコード配列を増幅し、mCherry蛍光タンパク質を用いたフレーム内のpMX-U6-MCSベクター(U6プロモーターとgRNAスキャフォールドの領域間)にそれぞれクローニングします9。反応系(50 μL)を 表1のようにセットアップします。これらのプライマーは、sgRNAをベクターに挿入できるsgRNA配列(3')と、完全長ベクターフラグメントを増幅できるベクター配列の一部(5')で構成されています。さらに、フォワードプライマーとリバースプライマーは、sgRNA領域内で約18 bpのオーバーラップ(ただし、完全にはオーバーラップしない)で設計し、ライゲーションプロセス中の直鎖状クローニングベクターの組み立てを容易にします。
      注:約5,551 kdのPCRによるプライマーを含むsgRNA配列の部位で直鎖状化されたベクターフラグメントが得られるはずです。
    4. ゲル抽出キットを使用してコンストラクトを精製し、クローニングキットを使用して環状化します。組換え製品は形質転換アッセイにご使用ください。
    5. プレートから単一クローンを取り出し、U6プロモータープライマー(配列:ATGGACTATCATATGCTTACCGTA)を使用して、第1世代シーケンシングによりsgRorcまたはsgNTコード配列を確認します。
    6. LBブロスで増幅する目的のシングルクローンを選択します。エンドトキシンフリープラスミドキットを使用して、細菌細胞から高品質のプラスミドDNAを抽出します。
      注:プラスミド溶液が高品質であることを確認してください。プラスミド溶液の濃度は少なくとも1 μg/μLにすることをお勧めします。
  2. パッケージングセルの調製
    1. 次の手順を使用してPlatinum-E(Plat-E)細胞を調製します:10%ウシ胎児血清(FBS)、100ユニット/ mLペニシリン、および0.1 mg / mLストレプトマイシンを含むDulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM培地)でPlat-E細胞を培養します10 cm培養皿。以下では 細胞培養培地 と呼ぶ。
      注:適切なトランスフェクション効率を得るためには、15継数未満の対数増殖期の細胞を使用することをお勧めします。
    2. トランスフェクションの1日前に、10 cm Plat-E細胞(~2.6 × 107 細胞)のフルプレートを適切な比率で新しい10 cmディッシュに分割し、翌日にトランスフェクションに最適な条件である約80%の細胞密度を達成します。新しい10cmディッシュに対して1:3の比率で細胞継代を行います(トランスフェクションの前日に新しい10cmディッシュに8~8 × 106 個の細胞を播種します)。
      注:分割比は細胞の増殖条件に左右され、堅固な増殖を示す細胞ではより高いトランスフェクション効率を達成できます。10cmのディッシュに対して、1:3の比率で細胞継代を行います。6 cmディッシュなどのさまざまな細胞培養ディッシュでは、トランスフェクションの前日に1.5 × 106 Plat-E細胞を播種することをお勧めします。
  3. トランスフェクション
    1. トランスフェクションの1時間前に、トランスフェクション試薬に干渉する可能性があるため、ペニシリン-ストレプトマイシンを含まないフェノールレッドを含まない8 mLの還元血清培地で細胞培養培地を置き換えます。使用前に、還元された血清培地を37°Cに温めてください。
    2. ミックス1とミックス2を含むトランスフェクション混合物を調製します:ミックス1には、18 μgのプラスミドDNA(pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry/pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry)と6 μgのpCL-Ecotropic Retroviral Vector(pCL-Eco)が1,000 μLの還元血清培地に含まれています。Mix 2 には、1,000 μL の還元血清培地に 48 μL のトランスフェクション試薬が含まれています。ミックス2を1滴ずつミックス1に加え、穏やかによく混ぜます。複合体を20〜25°Cで15〜20分間インキュベートします。
    3. 混合物をPlat-Eセルに慎重に滴下し、プレートを穏やかに渦巻かせて均一に分布させます。細胞を37°Cで5%CO2 の下で6〜12時間インキュベートします。
    4. 培地を10 mLの新鮮細胞培養培地と交換し、細胞を37°C、5%CO2 で48時間インキュベートし続けます。
    5. Plat-E細胞のトランスフェクション効率を評価するには、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーでプロキシとして機能するレトロウイルスベクタータグを検出します。
      注:pMX-U6-MCSベクターをトランスフェクションしたPlat-E細胞のかなりの割合で、強いmCherry蛍光(蛍光陽性が80%を超える)シグナルが検出され、トランスフェクションが成功したことを示しています。
    6. ウイルス含有培養上清を回収し、1,500 × g で10分間遠心分離して細胞断片を除去します。ウイルス上清をバイアルあたり1 mL分量し、-80°Cで保存します。
      注:ろ過は、細胞の破片を除去するための代替方法です。0.45 μmの孔径とポリエーテルスルホン(PES)メンブレンを備えたシリンジフィルターを使用して、フィルターメンブレン上のウイルス粒子の保持を最小限に抑えることをお勧めします。

2. 活性化CD4 + T細胞のレトロウイルス感染とTh17の分化

  1. 初代ナイーブCD4+ T細胞の調製と活性化
    1. 24ウェル細胞培養プレートの各ウェルに2 μg/mLの抗CD3eと4 μg/mLの抗CD28を滅菌済みの500 μL PBSでコーティングし、プレートをパラフィルムで包んで蒸発と汚染を防ぎ、ナイーブCD4+ T細胞を単離する前日にプレートを4°Cで一晩(またはCD4+ T細胞をプレーティングする1〜2時間前に37°C)インキュベートします。
      注:このステップは、ウイルス形質導入を行う前にマウスT細胞に対してプレート結合刺激を行うために必要です。
    2. 翌日、生後6-8週齢のCas9発現マウス(R26-CAG-Cas9マウス)をCO2 窒息により安楽死させ、70%エタノールで滅菌する。
    3. マウス脾臓を採取し、2% FBSと100 μM EDTA(FACS buffer)を含むPBSに入れます。
    4. 滅菌したすりガラス(つや消し側)でFACS緩衝液中で脾臓を粉砕し、組織を単一細胞懸濁液に均質化し、細胞懸濁液を70μmの細胞ストレーナーで50mLのチューブにろ過します。
      注意: ティッシュを湿らせておくために、ティッシュを優しく一貫して挽いてください。組織を激しく粉砕すると、細胞の生存に劇的な影響を与える可能性があります。
    5. 脾臓細胞懸濁液を800 × g で5分間遠心します。上清を取り除き、細胞ペレットを2 mLの赤血球溶解バッファーに再懸濁します。室温で5分間放置した後、FACSバッファーを添加して総容量15mLにします。脾細胞を800 × g で5分間遠心分離します。
    6. 脾細胞を再懸濁し、40μmのセルストレーナーでろ過します。CD4+ T細胞の単離の最終容量を1 mLに調整します。
    7. 市販の試薬キットを使用してCD4+ T細胞を単離するには、マニュアルの指示に従ってください。
    8. CD4+ T細胞を蛍光抗体混合物(CD4、CD25、CD44、およびCD62L)で4°Cで30分間標識し、細胞をFACSバッファーで洗浄し、フローセルソーターを使用してナイーブCD4+ T細胞を単離します。これにより、CD4+CD25-CD62Lの高CD44低ナイーブT細胞が得られます。
    9. プレート結合刺激上清を24ウェル細胞培養プレート(ステップ2.1.1で調製)から取り出し、各ウェルを500 μLのPBSで2回すすぎます。24ウェル細胞培養プレートのウェル中のリンパ球培養培地1 mL中の1 x 106 ナイーブCD4+ T細胞をプレートします。セルインキュベーターで細胞をインキュベートします。
      注:リンパ球培養培地には、10%FBS、100単位/ mLペニシリン、0.1 mg / mLストレプトマイシン、1 mMピルビン酸ナトリウム、10 mM HEPES、および50 μM β-MEがRPMI 1640培地に含まれています。
  2. レトロウイルス感染症
    1. 18〜24時間後、活性化細胞の各ウェルを1.5mLチューブに集めます。800 × g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
    2. 細胞ペレットを1 mLの感染混合物(10 μg/mL 臭化ヘキサジメトリン、ウイルス上清中の10 mM HEPES)に再懸濁し、混合物1 mLを48ウェル細胞培養プレートの新しいウェルに加えます。その間、ネガティブ(形質導入されていない)コントロールとして十分な数の細胞を保存します。
      注:ウェルあたり1 x 106 の活性化ナイーブCD4+ T細胞を1個未満にすることは可能ですが、ウェルあたり0.5 x 106 個の細胞未満を使用することは推奨されません。さらに、48ウェル培養プレートの周辺ウェルに細胞を播種しないでください。
    3. プレートをパラフィルムで包み、800 x g で32°Cで90分間遠心分離します。 加速と減速を3に設定します。遠心分離後、パラフィルムを取り出し、インキュベーター内で細胞を4時間インキュベートし、分化ステップを進めます。
  3. 感染細胞のTh17細胞への分化
    1. レトロウイルス感染時に抗原提示細胞(APC)を調製します。まず、手順2.1.2から2.1.4の指示に従って、野生型マウスから脾細胞を採取します。15 mLチューブに50 μg/mLマイトマイシンを含む1 mLのリンパ球培養培地で脾臓細胞を再懸濁します。脾臓細胞を5%CO2 の下で37°Cで1時間インキュベートします。
    2. 1時間後、PBSを15mLのマークまで加えて脾細胞を洗浄し、800 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、1 mLのリンパ球培養培地で脾臓細胞を再懸濁し、細胞数をカウントします。APC細胞の調製に成功しました。
    3. 細胞インキュベーションの4時間後(ステップ2.2.3と同様)、形質導入したCD4+ T細胞を1.5 mLチューブに回収し、800 x g で5分間遠心分離します。上清を捨て、感染した細胞を600μLのPBSに再懸濁して洗浄します。800 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
    4. 0.5 × 106 形質導入CD4+ T細胞を1 mLのリンパ球培養培地に、1.5 x 106 APC細胞とともに24ウェル細胞培養プレートのウェルに入れます。2 μg/mL の抗 CD3e、2 μg/mL の抗 CD28、および Th17 細胞分化カクテル (10 μg/mL の抗 IFNγ、10 μg/mL の抗 IL-12/IL23 p40、10 μg/mL の抗 IL4、2.5-3 ng/mL の hTGF-β、および 20-30 ng/mL の IL-6 を添加します。細胞を2日間培養します。
    5. 細胞の各ウェルを1.5 mLチューブに集め、800 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。新しい1 mLのリンパ球培養培地を、3 ng/mL TGF-βおよび30 ng/mL IL-6のみでリフレッシュします。細胞を新しいウェルの24ウェル細胞培養プレートに入れ、培養期間を延長します。培地交換の2日後に細胞を分析します。

3. 形質導入効率と分化結果の評価

  1. 培地交換後2日後、細胞を採取し、800 × g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。分化した細胞を、37°Cインキュベーターの24ウェル培養プレートの新しいウェルで、500 ng/mLホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)、500 ng/mLイオノマイシン、および5 μg/mLブレフェルジンAを500 μLのリンパ球培養培地で4時間処理します。フローサイトメトリー解析のために細胞の半分を回収し、残りの半分をqPCR解析用のRNA抽出バッファーで溶解します。
  2. フローサイトメトリー解析用
    1. 細胞を1.5mLのチューブに集めます。1 mLのFACSバッファーをチューブに加え、800 × g で5分間遠心分離して細胞を洗浄します。
    2. 細胞ペレットを蛍光抗体混合物(CD4およびFixable Viability Dye in 100 μL of PBS)で再懸濁し、細胞を4°Cで30分間染色します。
    3. 細胞を300 μLのPBSで洗浄し、300 μLの2%リン酸緩衝ホルムアルデヒド(FA)で4°Cで少なくとも60分間固定します。
    4. 1時間後、細胞をPBSで洗浄し、600μLの1x透過化緩衝液で再懸濁し、800 × g で5分間遠心分離します。
    5. 上清を捨て、1x透過化バッファー100μLに抗IL-17Aを100 μLで室温または4°Cで一晩染色します。
    6. 翌日、細胞を1x透過化バッファーで洗浄し、200 μLのPBSに再懸濁します。フローサイトメトリーによる細胞の解析10.「代表的な結果」セクションを参照してください。
  3. qPCR解析では、RNA抽出キットの指示に従ってRNAを抽出します。RNAをcDNAに逆転写して、保存またはその後のqPCR解析を行います。これらのプライマーの設計は、一般的なqPCRプライマーの設計原則に準拠しながら、gRNAを介した切断が発生したと予想されるインデル部位にまたがる領域を特異的に標的とする必要があります。この部位での増幅効率の低下やシグナルの損失は、ノックアウト成功の指標となる可能性があります。qPCRプライマーは以下の通りです。
    ロール F: TCCACTACGGGGTTATCACCT;R:AGTAGGCCACATTACACTGCT。
    IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG;R:CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT。

結果

本研究では、sgRNAターゲットをRorcにクローニングし、sgRNAノンターゲティングコード配列をmCherry蛍光タンパク質を用いたpMX-U6-MCSベクターにクローニングしました(図1A,B)。レトロウイルスの作製は、図2に概説したプロトコルに従って行った。トランスフェクションは0日目に開始され、レトロウイルスの収穫は2日目に行われました。トランスフェクション効率は、mCherryの蛍光強度で試験できます(図1C)。ウイルスを回収する前に、ナイーブなCD4+ T細胞を選別し、活性化しました。次いで、これらの活性化CD4+ T細胞をスピン感染を用いて感染させ、続いて、説明したように分化ステップを継続させた。最後に、形質導入の効率と分化の結果について、フローサイトメトリー解析とqPCR解析を用いて評価しました。

図3は、ナイーブCD4+ T細胞の選別に適用されるゲーティング戦略を示しています。メイン細胞集団と一重項細胞を選択した後(図3の最初の2つのゲートに示すように)、FVD-CD4+細胞をゲートして、Th17細胞に分極したCD4T細胞とAPC細胞のCD4T細胞を区別しました。最後に、CD4 T細胞によって産生されるIL-17AはTh17の分化効率を表しており、これはノックアウト効率を示しています。mCherry陽性細胞の割合はレトロウイルス感染の効率を反映し、ノックアウト効率はIL-17A陽性細胞の割合で示されます。細胞生存率を高め、ソーティング時間を最小限に抑えるために、マウスCD4+ T細胞単離キットを使用して脾細胞を濃縮したところ、濃縮効率は90%を超えました。

レトロウイルス感染の効率は、mCherry陽性細胞の存在によって示され、通常約40%です(図4A)。ウイルスを集中させることで感染効率を高めることができますが、このアプローチでは実験期間が長くなり、コストが高くなります。私たちの実験では、Th17細胞分化カクテルなしで培養した感染細胞がTh17分化陰性コントロールとして機能し、Th0と命名されました。ノンターゲティングsgRNAをポジティブコントロールとして用いた、これをsgNTと呼んだ。遺伝子編集には、RORγt遺伝子を標的とするgRNA(sgRNA-Rorc)を採用しましたが、これによりTh17の分化効率が大幅に低下しました(図4A)。この介入により、 Rorc と IL-17a の発現レベルも大幅に低下しました (図 4B)。

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図1:レトロウイルスベクターにサブクローニングされたsgRNAの例とトランスフェクション効率。 pMX-U6-MCS ベクトルを初期構成体として使用しました。gRNAスキャフォールドは、(A)スクランブル部位と(B) Rorcを標的とするsgRNA配列(オレンジ色の部分)とともに、U6プロモーターの下流に挿入されました(緑色の部分はU6プライマーによるシーケンシングのための切片として)。sgRNA含有プライマーおよびシーケンシングプライマー部位の位置は、環状ベクターの下に示されています。略語:AmpR =アンピシリン、カルベニシリン、および関連する抗生物質に対する耐性。LTR = 長い端子の繰り返し;MMLVψ = モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル; gag = 開始コドンを欠く切断されたモロニーマウス白血病ウイルス(MMLV) のgag 遺伝子。(C)プラスミドDNAトランスフェクトPlat-E細胞におけるmCherryの顕微鏡イメージング。スケールバー: 500 px。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:プロトコルの概略図。 トランスフェクションの前日に、Plat-E細胞の密度を適切な範囲に調整する必要があります。翌日(0日目)にトランスフェクションを行い、12時間後に培地を交換します。1日目に、Cas9発現マウスのナイーブT細胞を選別し、活性化します。続いて(2日目)、ウイルス含有培養上清を回収し、活性化されたT細胞と結合してレトロウイルス形質導入を行います。その後、感染した細胞をTh17細胞に3〜4日間分化させ、FACSを用いて解析します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:CD4ナイーブT細胞を選別するためのゲーティング戦略。 濃縮されたCD4 T細胞に対して表面染色を行い、CD4、CD25、CD44、およびCD62Lを標識しました。採用されたゲーティング戦略は次の通りでした:最初に、リンパ球は前方散乱および側方散乱パラメータに基づいてゲートされました。続いて、FSC-HおよびFSC-Wを用いて単一細胞を同定した。次に、CD4+CD25- 細胞をゲーティングして、制御性T細胞(Treg)を排除しました。最後に、CD44低CD62L高 ナイーブT細胞が同定されました。単離されたCD4+ ナイーブT細胞は、その後の実験のために収集されました。略語:FSC =前方散乱;SSC = サイドスキャッター。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:活性化T細胞の形質導入とTh17の分化の成功例。 (A)Th17の分化効率は、RORγt gRNA(mCherry+ IL-17a+集団のゲーティング)によって編集され、大幅に低下します。(B)Th0(Th17細胞分化カクテルなしで培養した感染細胞)、sgNT(ノンターゲティングsgRNA)、およびsgRNA-Rorc( RORγt 遺伝子をターゲットとするsgRNA)におけるRorγtおよびIL-17aの相対的mRNA発現。p < 0.001 (対応のない両側スチューデントの t 検定; データは SEM ±平均として表されます)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

PCR反応成分PCRプログラム
コンポーネント容量 (μL)歩一時。時間サイクル
2 × Phanta Mix(ダイプラス)25195°C3分間1
ddH2020295°C15秒
プライマー-F (10 μM)2356°C15秒
プライマー-R (10 μM)2472°C5 分 30 秒ステップ 2 に進みます
35×
テンプレート (~30 ng)1572°C5分間1
612°C∞

表1: gRNAベクター構築のためのPCR反応コンポーネントとPCRプログラム。

ディスカッション

レトロウイルス導入によるCRISPR/Cas9ゲノム編集は、ヘルパーT細胞の役割を探るための堅牢な方法です。このプロトコルは、Th17の分化と機能に関与する特定の遺伝子を調べるための迅速かつ効果的なアプローチを提供します。最適な結果を得るには、いくつかの重要な手順を慎重に実行する必要があります。まず、遺伝子ノックアウト効率を高めるためには、gRNAを慎重に選択する必要があります。CRISPR/Cas9遺伝子編集におけるオフターゲット効果のリスクを考慮すると、さらなる実験11,12では、プロトコルセクション1.1.1で特定されているように、高スコアの2〜3個のgRNAを選択することが賢明です。第二に、感染を成功させるには、高いウイルス力価が不可欠です。Plat-Eパッケージング細胞株の適切なメンテナンスは非常に重要です。トランスフェクションの日には、細胞数が不十分で多すぎるとウイルスの力価が低下するため、細胞は約80%のコンフルエントに達するはずです。Plat-E細胞が利用できない場合、ヒト胚性腎臓293T細胞をpCL-Ecoベクターと同時トランスフェクションすると、高いウイルス力価13,14も産生されます。プラスミド濃度を1 μg/μL以上に維持することは、高いウイルス力価を達成するために重要です。ウイルスはpH変化に対して感受性を示すため、ウイルス懸濁液がレモンイエローに変わる前に収穫することが不可欠です。したがって、培地のpHは適切な範囲内で慎重に調整する必要があります。ウイルスは、その完全性を維持し、凍結融解サイクルの繰り返しから保護するために-80°Cで保存する必要があります15。

第三に、高い感染効率を達成するためには、初代細胞を適切に活性化する必要があります。細胞の活性化が不十分であると、ウイルスの感染効率が大幅に損なわれます16。ウイルス感染前に、活性化細胞は不活性化細胞よりも著しく大きいサイズを示すため、T細胞の活性化状態を顕微鏡で確認する必要があります。なお、当社のTh17分化プロトコルはC57BL/6マウスに特化して最適化されているため、他のマウス系統については調整が必要な場合があります。第四に、望ましいTh17分化結果を達成するためには、最適な細胞条件を維持することが重要である。スピン感染中は、細胞の生存率を維持するために、細胞を中央近くのウェルに配置することが重要です。スピン感染後、細胞を4時間インキュベート(プロトコールステップ2.2.4)することは、細胞の回復に不可欠です。さらに、細胞を移管する際には、細胞の生存率を維持するために、穏やかなピペッティングが重要です。さまざまな刺激条件がTh17の分化に影響を与える可能性があります。この実験では、抗原提示細胞を分化系に組み込むことで、抗CD3eおよび抗CD28プレート結合刺激と比較して、分化効率が大幅に向上しました。最後に、輸送および保管中も使用するすべてのサイトカインが機能し続けるようにすることが重要です。サイトカインは、凍結融解サイクルの繰り返しや不適切な再構成溶液により、急速に安定性を失う可能性があります。コールドトリートメントと等量アリコートは、サイトカインが処置全体を通して機能を保持するために必要です。

特定の遺伝子ノックアウトTh17細胞を生成するためのこのプロトコルには、いくつかの制限があります。まず、マウスT初代細胞で完全な形質導入効率を達成することは困難です。一部の細胞は、Th17分化中に意図した遺伝子ノックアウトを受けない場合があります。第二に、初代T細胞の寿命は in vitroでは限られています。約1週間後、これらの細胞は死滅する傾向があり、その後の実験に課題が生じます。第三に、私たちのプロトコルはCas9トランスジェニックマウスに依存しており、Cas9配列をコアプラスミドに組み込もうとすると、ウイルス力価が大幅に減少しました。最後に、このプロトコルは、ナイーブCD4+ T細胞の活性化の初期段階に関与する遺伝子の機能解析には適していないことに気付きます。なぜなら、これらの細胞はレトロウイルス形質導入の前に活性化されなければならないからです。

その制限にもかかわらず、このプロトコルはさまざまな研究で成功裏に適用されており、Th17の分化に関与する主要な遺伝的調節因子の探索を促進しています。これにより、活性化T細胞の標的遺伝子のノックアウト後のTh17分化効率の変化を評価することができます。さらに、このプロトコルは、細胞増殖、生存、転写因子の安定性、サイトカイン分泌、免疫応答など、Th17細胞機能の他の側面を評価するのに適しています。さらに、私たちの研究室では、誘導された制御性T細胞(iTregs)のレトロウイルス形質導入と分化にその有効性を実証しました。すべてのタイプのT細胞が試験されているわけではありませんが、このプロトコールは、Th1、Th2、CD8+ T細胞などの他のサブセットにも適用できる可能性があります。全体として、この技術は免疫細胞で遺伝子ノックアウトを行うための貴重なツールとして機能し、免疫機能を調節する重要な遺伝シグナルを明らかにする大きな可能性を提供します。

開示事項

著者は、利益相反はないと述べています。

謝辞

Shanghai Immune Therapy Instituteの中核施設のDou Liu氏、Dongliang Xu氏、Pinpin Hou氏には、機器の利用を支援していただいたことに感謝します。この研究は、中国国立自然科学基金会の助成金31930038、U21A20199、32100718、および32350007(Linrong Lu)の支援を受けました。32100718(薛暁金へ);上海SHSMU-ZLCX 20211600(Linrong Luへ)のハイレベルな地元の大学の革新的な研究チーム。内部インキュベーションプログラムRJTJ24-QN-076(Zejin Cuiへ)。図2はFigdrawで作成しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 M EDTA (pH 8.0)SolarbioE1170
100 mm 細胞および組織培養ディッシュBIOFILTCD010100
1 M Hepes (遊離酸、滅菌)SolarbioH1090
24 ウェル細胞および組織培養プレートNEST702002
48 ウェル細胞および組織培養プレートNEST748002
BrefeldinA Solution (1,000x)BioLegend420601
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD4 抗体 (RM4-5)BioLegend100546
CD3e モノクローナル抗体 (145-2C11), Functional Grade, eBioscienceInvitrogen16-0031-82
CD44 Monoclonal Antibody (IM7), PE, eBioscienceInvitrogen12-0441-83
CD62L (L-Selectin) モノクローナル抗体(MEL-14)、APC、eBioscienceInvitrogen17-0621-82 
セルカウンターNexcelom BioscienceCellometer Auto 2000
Cell Strainer (40 μm)バイオシャープBS-40-CS
セルストレーナー (70 μm)biosharpBS-70-CS
遠心分離機 エッペンドルフ5425 R
遠心分離機 eppendorf5810 R
ChamQ SYBRカラーqPCRマスターミックスVazymeQ411-02
ClonExpress IIワンステップクローニングキットVazymeC112
DH5αコンピテントセルSangon BiotechB528413
Direct-zol RNA MiniprepZYMO RESEARCHR2050
DMEM MediumBasalMediaL110KJ
EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation KitSTEMCELL19852
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660Invitrogen65-0864-18
EndoFree Mini Plasmid KitIITIANGENDP118-02
ExFect Transfection ReagentVazymeT101-01
Fetal Bovine Serum, Premium PlusGibcoA5669701
FITC anti-mouse IL-17A 抗体 (TC11-18H10.1)BioLegend506907
ホルムアルデヒド溶液MacklinF864792
HiScript IV RT SuperMix for qPCR?+gDNA ワイパー?VazymeR423-01
IonomycinBeyotimeS1672
Mitomycin CMaokang Biotechnology1950
マウス GRCm38NCBIRefSeq v.108.200622
OPTI-MEM Reduced Serum MediumGibco31985070Reduced Serum Medium
Pacific Blue anti-mouse CD4 抗体 (RM4-5)BioLegend
PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 抗体 (PC61)BioLegend102015
PE/Cyanine7 anti-mouse CD4 抗体 (GK1.5)BioLegend100422
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122
PMA/TPA BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9マウス Shanghai Model Organisms Centerカタログ番号 NM-KI-00120
組換えヒトTGF-β 1(CHO発現)タンパク質、CFR&D Systems11409-BH
組換えマウス IL-6PeproTech216-16
研究用細胞分析装置BD BiosciencesBD LSRFortessa
研究用細胞選別機SONYMA900
RPMI 1640 MediumBasalMediaL210KJ
SimpliAmp サーマルサイクラー PCR システムApplied BiosystemsA24811
ピルビン酸ナトリウム溶液 (100 mM)Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF Purified anti-mouse CD28 抗体 (37.51)BioLegend102121
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IFN-γ抗体 (XMG1.2)BioLegend505847
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-4 抗体 (11B11)BioLegend504135
Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-12/IL-23 p40 抗体 (C17.8)BioLegend505309
&β;-メルカプトエタノール (50 mM)SolarbioM8211
年7月7日 100531

参考文献

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in vitroでのTh17分化の研究のためのレトロウイルスCRISPR/Cas9媒介遺伝子ターゲティング
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