薄層クロマトグラフィーによるバイオコントロールのための天然物のバイオアッセイガイド下同定-ダイレクトバイオオートグラフィー

真菌性の農業病原体は、世界中で作物の品質と収量に大きな損失をもたらし、安定した世界的な食料生産システムの経済的および供給上の課題に貢献しています^1,2。病原体の被害は、感染に耐性のある品種を育種し、病原体の増殖を抑制するための輪作や土地管理の実践を含む統合作物管理システムを使用することで防ぐことができる^3,4。これらの方法は作物への被害を軽減しますが、化学農薬は一般的に併用して、野外で真菌の生殖構造を積極的に殺し、被害と収量の減少をさらに防ぎます。化学農薬の使用は効果的ではあるが、周囲の生態系へのダメージ、土壌肥沃度の低下、それに伴う人間の健康リスク、病原体耐性の発現など、多くの欠点があり、後者は毎年大量の農薬が必要になる原因となる^5,6,7。

微生物ベースの害虫および病原体管理製品は、合成農薬の潜在的な代替品または補完物と長い間考えられてきました。1900年代初頭以来、 Bacillus thuringiensis は、種子処理、葉面散布、および直接^{土壌処理8}として、農業害虫や病原体の防除に広く使用されてきました。このような製品は生物農薬と呼ばれ、対象となる害虫や病原体の活力を殺したり、抑制したり、減らしたりできる天然に存在する微生物または生化学物質として特徴付けられています。生物農薬は、さまざまなメカニズムを通じて病原体の増殖を制御することができますが、最も一般的には二次代謝産物の分泌によって制御されます⁹。二次代謝産物は、しばしば天然物と呼ばれ、一次代謝に関与していませんが、他の微生物に打ち勝つための進化上の利点として産生されます¹⁰。

生物農薬は、合成農薬に比べて多くの利点があります。それらは、合成害虫^{管理製品9,10}と比較して、環境、動物相、および人間への毒性リスクが低い。ほとんどの生物農薬は何千年もの間環境中に自然に存在してきたため、微生物代謝産物の生分解経路は環境中に存在し、土壌や生態系の汚染の可能性を制限し、合成農薬が環境を破壊する原因となる滞留時間を短縮します¹¹。さらに、病原体感染を緩和するために使用される多くの生物農薬も植物の成長促進特性を示し、栄養素のバイオアベイラビリティを高め、植物の全身耐性を誘導する可能性があります¹²。

最も一般的には、生物農薬は微生物接種物の形で適用され、NPはin situ12,13の生きた微生物によって分泌されます。このような場合、生物農薬の活性源を特定することは大きな価値があります。そうすることで、生物農薬の作用機序についての洞察が得られ、特許を持つ微生物の保護のケースを構築するのに役立ち、その構造が新規である場合には、科学的な大きな影響を与えることができます。しかし、最も重要なことは、生物活性源の同定が、下流の生物農薬製品の製剤化の可能性を知らせることです。NP自体が活性化すれば、微生物を大規模な生物農薬生産のための生体分子工場として利用することができます。さらに、生物的防除のために研究されている多くのNPは、人間の医療にも応用できる可能性があり、経済的にさらに価値があります⁸。

薄層クロマトグラフィーダイレクトバイオオートグラフィー(TLC-DB)アッセイは、バイオペストリクティカル代謝物のバイオ活性ガイドによる単離と同定のための安価で簡単な方法です。この技術は、植物化学物質の生物活性試験を粗植物抽出物から分離するために一般的に使用されていますが、微生物抽出物の分析にも大きな可能性を秘めています¹⁴。TLCは、粗微生物抽出物中のNPを迅速かつ安価に分離し、培地病原体懸濁液でコーティングした後、活性代謝物を含むゾーンを容易に可視化することができます。これらのゾーンをプレートから掻き取り、超高速液体クロマトグラフィーと質量分析(UPLC-MS)を組み合わせて化学分析を行い、既知の代謝物を同定することができます。以前に報告された化合物と一致しない代謝物は、液体クロマトグラフィー を介して 大量に分離し、核磁気共鳴分光法やX線結晶構造解析などの技術を用いた構造解明研究を受けることができる¹⁵。

本稿では、TLC-DBと Bacillus spp.および農業病原体 Sclerotinia sclerotiorumを用いて、生物農薬NPを発見・同定するためのモデルシステムについて述べる。 図 1 は、TLC-DB 手順の概略図を示しています。

図1:TLC-DBの手順のステップ4〜7の概略図概要この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 微生物バイオコントロール候補の選定

1. コンペティションプレートアッセイを使用して、目的の病原体に対して拮抗作用を示す微生物分離株を選択します。
   注:このプロトコルを実証するために、S. sclerotiorumに対して拮抗作用を示した9つのBacillus分離株が選択されました。これには、Bacillus atrophaeus、mojavensis、およびsubtilis種が含まれます。

2. 培地の準備

1. ジャガイモデキストロース寒天(PDA)を、水1リットルあたり39gの培地を溶解して調製します。
2. 水1リットルあたり45gの培地を加えて、シュードモナスF寒天培地を調製します。
3. 24 gの培地と水1リットルあたり0.24 gの寒天を加えて、1%寒天でジャガイモデキストロースブロス(PDB)を準備します。
4. 酵母-グルコース-マンガン(YGM)ブロスを準備します。100mLの水に2.5gのKH2PO4と2.5gの_K2HPO4からなる緩衝液と、0.58gのMnSO4からなる塩溶液を作成します。H₂0、0.5 gのNaClおよび0.05 gのFeSO_{4.7H 2}0を100 mLの水に。
   1. 次に、酵母抽出物1g、デキストロース1.25g、水400mL、緩衝液5mL、塩溶液5mL、水90mLを加えて、金属塩が溶液中に沈殿しないようにします。
5. 培地をオートクレーブ滅菌し、寒天を100 x 15 mmのペトリプレートに注ぎ、室温まで冷ましてから使用します。

3.病原体の準備

1. Sclerotinia sclerotiorumの5プレートをPDA(ステップ2.1で調製)で培養し、25°Cで3日間インキュベートします。

4.天然物抽出物の準備

1. 各細菌分離株をPseudomonas F Agar(ステップ2.2で調製)で培養し、個々のコロニーが観察されるまで増殖します。
2. 単一細菌コロニーを遠心分離機または培養チューブで25 mLのYGM培地に継代培養し、3日間振とうしながらインキュベートします。
3. 各抽出物の5 mLのアリコートを1 LのYGMに移し、同じ条件でさらに3日間インキュベートします。
4. 各培養物を3000 x g で15分間、25°Cで遠心分離し、細胞をペレット化します。
5. 上清をデカントし、酢酸エチルで3回洗浄して、培地から代謝物を抽出します。
6. それぞれの酢酸エチル層をロータリーエバポレーションで組み合わせて乾燥させます。
7. 抽出物を最小限のメタノールに再溶解し、小さなシンチレーションバイアルに移し、ロータリーエポベーションによって再度乾燥させます。
   注:抽出物が乾燥して油性または樹脂性の材料になる場合は、材料を凍結乾燥して、正確に計量できる乾燥粉末を得てください。

5. TLCプレートの準備

1. 20cm×20cmのTLCプレートは、プレートの下から2cm、上から2cmのところに線を引いて準備します。一番下の行に、2cm間隔で9つのドットを配置します。一番上の線の上に、4つのドットを4cm離して配置します。
2. 各抽出物5 mgを15 μLのメタノールに溶解し、ピペットを使用して、下部の行にマークされた9つのドットに各抽出物5 μLを塗布します。各抽出物をTLCプレート上でスポット乾燥させ、同じスポットにさらに5μLのアリコートを塗布します。すべての材料がTLCプレートにロードされるまで繰り返します。
3. ジクロロメタンとメタノールの1:2溶液を使用して、液溶媒がプレートの上部から2cmの線に達するまで(約45分)、現像タンクでTLCプレートを現像します。
4. 開発が完了したら、TLCプレートを取り外し、溶媒ラインの上にマークされた4つのドットに一連のポジティブコントロールを適用します。同じコントロールの4つの濃度が使用されます。 S. scl.の場合、 0.5 μg/mL、5 μg/mL、50 μg/mL、および500 μg/mLのハイグロマイシンBがポジティブコントロールです。
5. プレートからすべての溶媒が蒸発する前に、エタノール滅菌したTLCプレートボックスに入れます。

6. ダイレクトバイオオートグラフィーアッセイ

1. アッセイで使用する材料(クロマトグラフィー噴霧器のガラス部品、金属ヘラ、ペーパータオル4枚、セルロースまたはフィルターペーパー、水、メディア)を、ティンフォイルで覆われた大きなビーカーでオートクレーブします。
   注:紙の材料(ペーパータオル、セルロース紙)は、オートクレーブで濡れないように錫箔で包む必要があります。
2. エタノール滅菌PTFEチューブを使用して、空気源、圧力計、クロマトグラフィー噴霧器を接続します。クロマトグラフィー噴霧器と圧力計の間にHEPAフィルターを接続します。
3. 滅菌金属ヘラを使用して5つの病原体プレートの菌糸体マットを滅菌スパチュラを使用して50mLの遠心分離チューブに収集します。
   注:必要に応じて、菌糸体を取り除くために少量の液体ブロスを使用し、滅菌ピペットで移します。
4. 寒天と滅菌ガラスビーズで修正した25 mLのPDBを50 mLの遠心分離チューブに加え、5分間ボルテックスして菌糸体マットを破砕します。
5. 菌糸体懸濁液を針先付きの滅菌シリンジを使用してクロマトグラフィー噴霧器に移し、大きな菌糸体がクロマトグラフィー噴霧器を詰まらせないようにします。
6. 以前に開発したTLCプレートを層流フードの滅菌ペーパータオルに置き、メディア懸濁液を塗布しながらプレートとの手の接触を減らします。
7. 空気圧を約4バールに上げ、サスペンションをTLCプレートに3回塗布して、塗布の合間にプレートを完全に乾燥させます。
   注:3つの層が最適な量であることがわかりました。これより少ないと、病原体は成長するための十分な培地を持っていません。それ以上に、培地が厚すぎるため、病原体が活性代謝物と接触できない場合があります。
8. 滅菌したプラスチックプレートボックスに滅菌水500mLを入れ、滅菌した折り畳みセルロースシートまたは濾紙を両側に置き、水分を保持します。
9. 完成したアッセイプレートを、箱の中の4つの空のシャーレに置きます。
10. アッセイを3日間から1週間、または菌糸体の均一な層がポジティブコントロールと阻害ゾーン(ZOI)の周囲を除いてTLCプレート全体に均一に成長するまでインキュベートします。

7. 液体クロマトグラフィー質量分析

1. 写真を使用して、完成したアッセイを画像化します。
2. 下部のラインからZOIまでの距離を下部のラインから上部のラインまでの距離で割ることにより、各抑制ゾーンの保持係数を計算します。
3. シリカを阻害ゾーンからこすり落とし、微量遠心チューブに入れます。
4. 各チューブとボルテックスに500μLのメタノールを加えて、シリカから代謝物を抽出します。
5. 8,500 x g 、20°Cで10分間遠心分離し、上清を小さなバイアルに移します。
6. ロータリーエポベーションまたは窒素の流れの下で蒸発して乾燥させます。
7. 抽出物をLCバイアル中の50 μLのメタノールに再懸濁します。
8. LC-MSによる阻害ゾーンの代謝物を分析し、それらを粗抽出物中の代謝物と比較して、粗抽出物中のどの代謝物が病原体の阻害に関与しているかを決定します¹⁶。
9. 発生源微生物の属と種、およびZOIで同定された質量を用いて、AntibaseやDictionary of Natural Productsなどの文献や関連データベースを検索し、代謝物を特定します。

TLCによる微生物抽出物の分離時には、代謝物をTLCプレートに沿って垂直に分散させる必要があります。可視光線下では、可視光域で吸収されない代謝物を見るのが難しい場合があります。したがって、UV光下でのイメージングは、 図2A、Bに見られるように、代謝物の分離を見るのに役立ちます。 インキュベーション期間後、病原体は、 図2Cに示されているように、ポジティブコントロールと活性代謝物が存在する阻害ゾーンを除いて、プレート全体にわたって均一に成長しているように見えるはずです。

図2:TLCによる微生物抽出物の分離 (A)可視光下で画像化された9種類の バチルス 抽出物を含むTLCプレートを開発し、(B)真菌接種物の適用前に320nmのUV光下で画像化。(C)プレート全体で病原体の成長が観察されたバイオオートグラフィーアッセイの完了。ただし、ポジティブコントロールの周囲で成長が阻害されている場所、および各抽出物のZOIを除く。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

阻害ゾーンから抽出された代謝物をLC-MSで分析し、粗抽出物と比較することで、病原体に対する拮抗作用の原因となるNPを決定します。一致する代謝物は、一致と見なされるには、保持時間および分子イオン種が同じである必要があります。活性代謝物が同定されたら、細菌培養物を大量に増殖させて、構造化学や生物学的研究に関心のある活性代謝物を分離することができます。

スーザン・ボイエチコ博士は、この研究の提出前(2023年2月8日)に亡くなりました。他のすべての著者は、利益相反がないと宣言しています。