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方法論記事

経上皮電気インピーダンスモニタリングによる多孔質基板ベースのエレクトロポレーション

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DOI:

10.3791/66971

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2024年9月27日

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 3Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University

この記事について

サマリー

多孔質基質エレクトロポレーション(PSEP)は、一貫したハイスループットデリバリーと高い細胞生存率を兼ね備えています。経上皮電気インピーダンス(TEEI)測定の導入により、PSEPの中間プロセスに関する洞察が得られ、ラベルフリーの送達が可能になります。この記事では、PSEP送達実験とTEEI測定解析を同時に行う方法について説明します。

要約

多孔質基板エレクトロポレーション(PSEP)は、高スループットと一貫した送達を提供する新しいエレクトロポレーション方法です。他の多くの種類の細胞内送達と同様に、PSEPは、送達の成功を判断するために蛍光マーカーと蛍光顕微鏡法に大きく依存しています。エレクトロポレーションプロセスの中間ステップに関する洞察を得るために、経上皮電気インピーダンス(TEEI)モニタリングを統合したPSEPプラットフォームが開発されました。細胞は、多孔質膜を備えた市販のインサートで培養されます。完全にコンフルエントな細胞単層の形成を可能にするための12時間のインキュベーション期間の後、インサートをPSEPデバイスのウェルにあるトランスフェクション培地に入れます。次に、細胞単層をユーザー定義の波形にさらし、蛍光顕微鏡で送達効率を確認します。このワークフローは、PSEPプロセスに関する追加データを収集するために、パルス顕微鏡と蛍光顕微鏡の間のTEEI測定によって大幅に強化でき、この追加のTEEIデータは、送達効率や生存率などの送達指標と相関しています。この記事では、TEEI測定でPSEPを実行するためのプロトコルについて説明します。

概要

エレクトロポレーションは、細胞を電場にさらす技術で、細胞膜に一時的な孔を作り、タンパク質、RNA、DNAなどのカーゴが通過できるようにします1,2。最も広く使用されているのは、バルクエレクトロポレーション(BEP)です。BEPは、数百万個の細胞を含む電解質をキュベットに充填し、電解質を高電圧にさらし、拡散またはエンドサイトーシスを通じて貨物を細胞内に侵入させることによって実行されます1。BEPには、ハイスループットや多数の市販システムなど、多くの利点があります。ただし、BEP 配信には制限があります。電極に対する細胞の位置に一貫性がなく、隣接する細胞からの電界遮蔽により、BEP 3,4中の電界ばく露に大きなばらつきが生じます。BEPに必要な高電圧は、細胞の生存率にも大きな悪影響を及ぼします5。2011年6月の開始以来、多孔質基質エレクトロポレーション(PSEP)と呼ばれるエレクトロポレーション法への関心が高まっているが、局在エレクトロポレーションやナノまたはマイクロエレクトロポレーション1,7,8などの他の名前で呼ばれることもある。BEPの細胞懸濁液とは対照的に、PSEPは多孔質基質に接着した細胞上で行われます。接着状態は、大多数のヒト細胞株9にとって好ましいだけでなく、基質の細孔も電流に焦点を合わせ、膜貫通電位(TMP)を細胞膜の特定の領域に局在させる10,11。この局在化により、印加電圧の大幅な低減が可能になり、損傷が減少し、細胞の生存率が向上します。この効果の組み合わせは、細胞膜の細孔形成を制御するのに役立ち、その結果、より一貫性のある効率的な送達が実現します1,5,12。

最近の研究では、市販の多孔質膜インサート13 (図1A、B)を保持するための6ウェルの金メッキ電極アレイを備えたPSEPデバイスが導入されました。これは、Vindisらによって最初に導入された方法です14。このデバイスは、パルスを印加し、経上皮電気インピーダンス(TEEI)として知られる細胞単層全体の電気インピーダンスをリアルタイムで測定できます13。デバイスのユーザーインターフェースにより、エレクトロポレーション波形と極性を完全に制御できます。重要なのは、リアルタイムのインピーダンス測定を使用して、高価な試薬や蛍光マーカーを必要とせずに送達結果を予測できることです。これはラベルフリー送達15として知られています。

PSEPプラットフォームは、パルス発生器とTEEI測定装置を収容するデバイスの本体と、多孔質基板が挿入され、エレクトロポレーションが発生する電極アレイの2つの主要なカスタム電気部品で構成されています。すべてのカスタム電子機器と3Dプリントコンポーネントの図は、GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI にあります。カスタム電子機器に加えて、プラットフォームが正しく機能するためにはコンピューターも必要です。このカスタムソフトウェアを実行するには MATLAB (バージョン 2021a 以降) が必要であり、解析用のデータを保存してアクセスするには Microsoft Excel が必要です。このプログラムは、カスタム電子機器を制御し、設定を調整するためのグラフィカルユーザーインターフェース(GUI)を提供します。これらのプログラムは、GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI でも公開されています。

予備データでは、このプロセスはさまざまなタイプの接着細胞で可能であることが示唆されていますが(図1C)、この記事では、Brooksらがこの細胞株に最適であると判断したパラメータを使用したA431細胞の調製についてのみ説明します13。さらに、ヨウ化プロピジウム(PI)カーゴは細胞毒性があるため、2つの実験が行われ、1つ目は高濃度のPIトランスフェクション培地を使用して送達効率を定量化し、もう1つは細胞培養培地のみを使用してより長い時間スケールでTEEIを測定します。これらの実験では、同一のエレクトロポレーション波形を使用しているため、結果を相関させることができます(図1D)。

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図1:電極アレイの組み立て図と基本データ(A)電極アレイのウェル内のインサートのCADモデル。(B)電極アレイのCADモデル。(C)選択した細胞株のPSEPによるインピーダンスの増加、細胞株あたりn = 3。エラーバー:平均の標準誤差。(D)配送効率とTEEI は相関データを増やします。送達効率は、送達実験からPI画像とカルセイン画像の両方で標識された細胞の数を、Hoechstで同定された細胞の総数で割ることによって計算されました。セル数は、カスタム CellProfiler パイプライン (電圧あたり n = 6) を使用して決定しました。エラーバー:(x軸とy軸)平均の標準誤差。この図は、Brooks et al.13から許可を得て転載しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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プロトコル

本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 試薬の調製と細胞培養

  1. 50 mLのウシ胎児血清(FBS)と5 mLのペニシリン-ストレプトマイシンをDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)の500 mL容器に加えて、細胞培養培地を調製します。汚染のリスクを減らすために11個の50 mLアリコートを製造し、4°Cで冷蔵します。
  2. 製造元の指示に従って、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ストック溶液中に25 μg/mLのヒト血漿フィブロネクチン1 mLを作成します。
  3. DMEMストック溶液中に0.1 mg/mLのヨウ化プロピジウムを15 mL調製し、さまざまなカーゴ濃度での実験を可能にします。
  4. 調製した細胞培養培地12 mLを含むT75フラスコでA431細胞を培養します。細胞は1〜2日ごとに継代され、50%のコンフルエンシーが維持されました。

2. サンプル調製

  1. フィブロネクチンコーティング
    1. 12種類のインサートと2種類の24ウェルプレートを選択します。インサートを1つのウェルプレートにセットし、6つの列を2列作成します。2 番目のウェルプレートは、後で置いておきます。
    2. 1.5 mLチューブに52 μLのフィブロネクチンストック溶液と1,248 μLのPBSを混合して、1 μg/mLのフィブロネクチン溶液1,300 μLを作製します。
    3. 100 μLのフィブロネクチン溶液を各インサートに分配します。ウェルプレート内のインサートを37°Cで3時間インキュベートします。
  2. 細胞密度を最適化するための細胞濃度の調整
    1. フィブロネクチンのインキュベーションが完了する約1時間前に、A431細胞のT75フラスコをインキュベーターから取り出して細胞抽出します。
    2. フラスコ内の培地を吸引器で取り出し、5mLのPBSで洗浄します。同様にPBSを取り出し、トリプシン3mLを追加します。フラスコの側面を軽くたたいて細胞を完全に剥離する前に、3〜4分間インキュベートします。
    3. 6 mLの細胞培養培地をフラスコに加え、ピペットで激しく混合して残りの細胞を分離し、内容物を15 mLの遠心チューブに移します。100 x g 、20°Cで5分間遠心分離します。
    4. 細胞ペレットを乱さないように注意しながら、吸引器を使用して細胞培養培地とトリプシンを遠心分離管から取り出します。遠心チューブに1mLの培地を加え、(気泡を出さずに)前後にピペットで動かして細胞ペレットを分裂させ、細胞を再懸濁します。
    5. 細胞懸濁液10μL、細胞培養培地40μL、トリパンブルー色素50μLを200μLのチューブにピペットで移し、ピペットで十分に混合します。
    6. 染料混合物10μLを取り出し、血球計算盤に注入します。色素混合物を10%希釈して細胞をカウントし、15 mL遠心チューブ内の総細胞数を推定します。
      注:このプロトコルでは、5,000,000細胞/ mLの濃度を想定しています。
    7. 目的の播種密度にインサートメンブレンの表面積を掛け、懸濁液中のカウントされた細胞数/mLで割り、1,000を掛けて、インサートあたりに必要な細胞懸濁液のマイクロリットルを計算します。
      1. 必要な細胞懸濁液の総量を求めるには、この数値に10を掛け(12個のインサートのうち3個が無細胞コントロールであるため、9個のサンプルに十分な細胞を確保するため)、最も近い整数に切り上げます。この場合、この実験には合計135μLの細胞懸濁液が必要です。
    8. 以前に計算した135 μLの細胞懸濁液と1,865 μLの細胞培養培地を別の15 mL遠心チューブで混合することにより、2,000 μLの調整済み細胞溶液を作成します。
  3. 細胞の播種
    1. フィブロネクチンのインキュベーションが完了したら、各インサートから余分なフィブロネクチンを取り除きます。
    2. 各インサートに100 μLの滅菌蒸留水を加えて、インサートを2回洗浄します。インサート間の洗浄時間が一定になるように、追加したのと同じ順序で水を取り除きます。
    3. 各インサートに100 μLの細胞培養培地を加えて、インサートを再度洗浄します。メディアは、インサート間で一貫した洗浄時間を確保するために、追加したのと同じ順序で取り出します。
    4. 細胞サンプルインサート
      1. 調整した細胞溶液200μLを各インサートにピペッティングして細胞を播種します。インサート間の一貫したコンフルエンシーを確保するには、分配前に遠心分離チューブ内で細胞溶液を混合し、分配後に各インサート内で再度混合します。
    5. ネガティブコントロールインサート
      1. 200 μLの細胞培養培地を各インサートにピペットで入れます。細胞サンプルインサートとの一貫性を保つには、ピペットを使用して各インサート内で細胞培養培地を混合します。
  4. ラベリングとインキュベーション
    1. 油性マーカーを使用して、2 番目のウェルプレートを 3 つのウェル幅の 2 つの列に分割する線を引きます (3 ウェルで実行される条件の場合)。各列を行に分割します。グリッド内の各領域に、関連するパラメーターのラベルを付けます。
    2. 1 mLの細胞培養培地をすべてのウェルに加えると、実験用のインサートが入ってきます。調製ウェルプレートから標識された実験ウェルプレートの適切な位置にインサートを移し、37°Cで少なくとも12時間インキュベートします。

3. 実験手順

  1. 配信実験
    1. 0.1 mg/mL PI 溶液 1.5 mL を電極アレイの各ウェルにピペットで移します。電極アレイの各ウェルにインサートを配置し、インサートの脚をアライメント溝に合わせ、インサートがウェルの上面と同じ高さになるようにします(図1A、B)。
    2. 上部電極プリント回路基板(PCB)を電極アレイウェルの上部にねじ込み、電極アレイをPSEPデバイスに接続します。
    3. 電極アレイを37°Cインキュベーターに少なくとも1時間置き、温度を平衡化させます。
    4. GUIの左上隅にある[Membrane]の横にあるドロップダウンをクリックし、[ 400 nm GBO]をクリックします。「Electrolyte」、「Cells」、「Cell Seeding Density」、および「Cell Duration」に対してこの手順を繰り返し、それぞれDMEM、A431、200、および12を選択します。
      注:これらの値は記録保持のみを目的としており、デバイスの機能に影響を与えることはありません。正しいデータ追跡のために、必要に応じてこれらの値を調整してください。
    5. GUI の右側にある [Post Pulse Time Duration (min)] 編集フィールドに 1 を入力して、デフォルトのパルス後測定時間を 1 分に変更します。他のすべての設定はデフォルトの状態のままにします。
      注:デフォルトのパルスパラメータは、30ボルト、20Hz、1msの持続時間、および200パルスの矩形波を作成します。デフォルトのTEEI測定パラメータは、0.5ボルト、100Hz、1,000Hz、10,000Hz、および100,000Hzです。
    6. 「実行」ボタンをクリックし、プロンプトが表示されたら、井戸 1-3 と 4-6 の適切な名前を入力します。[OK]をクリックして実験を開始します。
    7. インキュベーターから電極アレイを取り外し、プログラムの実行が終了したら、インサートを実験ウェルプレートの元の位置に戻します。
    8. 2 μL の Hoechst 33342 と 5 μL のカルセイン AM を 123 μL の細胞培養培地と 200 μL チューブで混合します。
    9. 10 μLの染色液を各ポストパルスインサートに静かにピペットで移し、インサートをインキュベーターに5分間戻します。
    10. ウェルプレートを5倍対物レンズを備えた蛍光顕微鏡のプレートホルダーに移します。明視野と各染色の蛍光を使用した画像。カメラをトリガーする前に、インサートを対物レンズの中央に配置します。
      注:PI、calcein AM、およびHoechst 33342の励起波長は、それぞれ558 nm、495 nm、および353 nmです。発光波長は、それぞれ575nm、519nm、465nmです。
  2. TEEI測定実験
    1. 1.5 mLの細胞培養培地を電極アレイの各ウェルにピペットで移します。セルサンプルインサートをウェル1〜3に、コントロールインサートをウェル4〜6に配置し、インサートの足をアライメント溝に合わせ、インサートがウェルの上面と同じ高さになるようにします。
    2. 上部電極PCBを電極アレイウェルの上部にねじ込み、電極アレイをPSEPデバイスに接続します。
    3. 電極アレイを37°Cインキュベーターに少なくとも1時間置き、温度を平衡化させます。
    4. GUIの左上隅にある[Membrane]の横にあるドロップダウンをクリックし、[400 nm GBO]をクリックします。「Electrolyte」、「Cells」、「Cell Seeding Density」、および「Cell Duration」に対してこの手順を繰り返し、それぞれDMEM、A431、200、および12を選択します。
      注:これらの値は記録保持のみを目的としており、デバイスの機能に影響を与えることはありません。正しいデータ追跡のために、必要に応じてこれらの値を調整してください。
    5. 残りの設定はすべてデフォルトの状態のままにします。
      注:デフォルトのパルスパラメータは、30ボルト、20Hz、1msの持続時間、および200パルスの矩形波を作成します。デフォルトのTEEI測定パラメータは、0.5ボルト、100Hz、1,000Hz、10,000Hz、および100,000Hzです。
    6. 「実行」ボタンをクリックし、プロンプトが表示されたら、井戸 1-3 と 4-6 の適切な名前を入力します。[OK]をクリックして実験を開始します。
    7. インキュベーターから電極アレイを取り外し、プログラムの実行が終了したら、インサートを実験ウェルプレートの元の位置に戻します。
    8. 200 μLの反応チューブに、2 μLのHoechst 33342、5 μLのカルセインAM、および10 μLのPIを113 μLの細胞培養培地と混合します。
    9. 10 μLの染色液を各ポストパルスインサートにピペットで注入し、インサートをインキュベーターに5分間戻します。
    10. ウェルプレートを5倍対物レンズを備えた蛍光イメージング顕微鏡のプレートホルダーに移します。明視野と各染色の蛍光を使用した画像。カメラをトリガーする前に、インサートをレンズの中央に配置します。
      注:PI、calcein AM、およびHoechst 33342の励起波長は、それぞれ558 nm、495 nm、および353 nmです。発光波長は、それぞれ575nm、519nm、465nmです。

4. データ分析

  1. CellProfiler パイプラインを使用した画像データの分析
    1. GitHub:https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI で提供されているカスタム CellProfiler ワークフローを使用して、配信と TEEI 測定実験画像を処理します。
  2. TEEI分析
    1. GUI の [Analysis ] タブをクリックします。
    2. GUIの下部にある インピーダンスタイプインジケータ をTEEIに切り替えます。
    3. 左上のボックスの矢印をクリックすると、データファイル内のすべての実験名が表示されます。TEEI測定実験からすべての 細胞サンプルデータ を選択します。
    4. 右側の次のボックスの矢印をクリックすると、データ ファイル内のすべての実験名が表示されます。TEAI測定からすべての 制御インサートデータ を選択します。
    5. 「実行」をクリックします。選択したセルサンプルデータを最も低い測定周波数で含む基本図が表示されます。
    6. GUI の右側にあるサンプル オプション ボックスで、矢印をクリックして、選択したすべての挿入データを表示します。外れ値を削除するには、適切なデータを選択し、下の [削除 ]をクリックします。
      注: [削除 ] ボタンを最後にクリックして解析から削除されたデータは、[ 元に戻す ] ボタンで取得できます。
    7. [ 完了 ]をクリックして、目的のデータが図に表示されたら、次の図に進みます。
    8. 残りのセルサンプルデータと制御データについて、手順4.2.6と4.2.7を繰り返します。「Done」をクリックして最終的なデータセットを確認すると、完全な分析図が表示されます。
    9. 解析図を保存します。

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結果

与えられたプロトコルは、TEEI測定を使用してエレクトロポレーションの中間プロセスを調べ、特にA431細胞株とPIカーゴについて送達予測を行う方法を確立します。このプロトコルの変更については、この記事で詳しく説明しますが、特定の値は変わる可能性がありますが、応答の一般的な傾向は一貫していることに注意することが重要です。例えば、初期ベースラインを下回るTEEIデータは細胞死に対応し、最小値を超えるTEEI値の最大増加は送達効率に対応する13。これらの一般的な傾向とその影響については、以下で説明します。

図2Aに示すように、PSEPプラットフォームの使用中には、さまざまなTEEI測定と細胞イメージングのトレンドが生じる可能性があります。このプロトコルの理想的な結果は、図 2Ai に示されている最適化された健康データと同様の曲線を生成することです。これは、ベースラインを下回る低下がなく、細胞死があったとしてもほとんどないこ...

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ディスカッション

図2C は、TEEIが最小値から増加し、ベースラインから減少する様子を各PSEP波形電圧についてプロットすることを示しています。TEEIの増加は放物線弧を作成し、減少する前に約20ボルトでピークに達しますが、ベースラインからのTEEIの減少は電圧が増加するにつれて指数関数的に増加します。 図 2D の供給効率とデス パーセンテージはこれらの傾向を反映しており、デンス効率は放物線状に弧を描き、約 30 ボルトでピークに達し、波形電圧が増加するとデスは指数関数的に増加します。

TEEIの増加を引き起こす根本的なメカニズムの1つの仮説は、負に帯電した基板マイクロチャネルを介した電気浸透であり、電界18,19の印加によって引き起こされる現象である。TEEI応答が、エレクトロポレーション

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

NSF(Awards 1826135、1936065、2143997)、NIH国立総合医科学研究所P20GM113126(Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication)、P30GM127200(Nebraska Center for Nanomedicine)、Nebraska Collaborative Initiative、Voelte-Keegan Bioengineering Supportからの資金援助に感謝します。このデバイスは、Nebraska Research Initiativeが一部出資しているNanoEngineering Research Core Facility(NERCF)で製造されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mL円錐形遠心分離チューブThermo Scientific339651
2チップ使い捨て血球計算盤ブルドッグバイオDHC-N01
75 cm2 組織培養フラスコフィッシャーブランドFB012937
A431 細胞ATCCCRL-1555
Calcein AMInvitrogenC3099
クラスIIのタイプA2バイオセーフティキャビネットLabgardNU-543-600
カスタムコンポーネントYangLabhttps://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
使い捨て遠心分離チューブ(50mL)fisherbrand05-539-6
DMEMギブコ11965092
ウシ胎児血清ギブコA5670401
流体吸引システムvacuubrand20727403
HERACELL 240iThermo Scientific51026331
Hoechst 33342Thermo Scientific62249
ヒト血漿フィブロネクチンSigma-AldrichFIBRP-RO
倒立蛍光顕微鏡Zeiss491916-0001-000
倒立顕微鏡LabomedTCM400
PBScytivaSH30256.02
PCR チューブ 200 µLSarstedt72.737
ペニシリン / ストレプトマイシンGibco15140148
ピペット (0.2-2 µL)fisherbrandエリートFBE00002
ピペット(100-1000 µL)fisherbrandエリートFBE01000
ピペット(20-200&マイクロ;L)fisherbrandエリートFBE00200
ピペット(2-20&マイクロ;L)fisherbrand EliteFBE00020
Propidium IodideInvitrogenP1304MP
Reaction Tube 1.5 mLSarstedt72.690.300
Sorvall ST 16R CentrifugeThermo Scientific75004240
Thincert (24-well)Greiner Bio-One662 6410.4 µm細孔径、2x106cm-2細孔密度、透明PET
組織培養プレート(24ウェル)fisherbrandFB012929
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154-20mL
TrypsinGibco15090046

参考文献

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