わさび-アルコール味-匂い相互作用を研究するための動物行動評価と畳み込みニューラルネットワークの統合

サマリー

この記事では、わさびによって引き起こされる刺痛感に対するアルコール飲料の嗅ぎ分けの抑制能力を測定するための一連の方法について説明します。

要約

食品の調理に一般的に使用される市販のわさびペーストには、消費時に刺激的な感覚を引き起こす化学感覚イソチオシアネート(ITC)の相同化合物が含まれています。食事のアルコール飲料を嗅ぐことがわさびの辛さの感覚に与える影響は研究されていません。ほとんどの官能評価研究は個々の食品と飲料に別々に焦点を当てていますが、わさびを飲みながら酒を嗅ぐ嗅覚研究に関する研究は不足しています。ここでは、動物行動学と畳み込みニューラルネットワークを組み合わせて、マウスが酒を嗅ぎながらわさびを摂取するときの表情を解析する方法論を開発しました。この結果は、学習済みで検証済みの深層学習モデルが、ワサビ陰性酒陽性グループのクラスに属するワサビとアルコールの共治療を描いた画像の29%を認識し、事前の学習教材のフィルタリングを必要とせずに認識することを示しています。選択したビデオフレーム画像から得られたマウスのしかめっ面スケールスコアの統計解析により、酒の有無との間に有意差(P < 0.01)が明らかになりました。この知見は、マウスのワサビ誘発反応に対して、食事性アルコール飲料が減少効果を有する可能性を示唆している。この組み合わせ方法論は、将来、個々のITC化合物のスクリーニングやスピリット成分の官能分析に可能性を秘めています。しかし、アルコールによるわさび辛味の抑制の根本的なメカニズムを調査するには、さらなる研究が必要です。

概要

一般にわさびとして知られているワサビジャポニカは、食品調理で認知されています^1,2。涙を流したり、くしゃみをしたり、咳をしたりすることを特徴とする、消費時に引き起こされる強烈な感覚体験はよく知られています。わさびのこの独特の辛味は、化学感覚イソチオシアネート(ITC)の相同化合物に起因する可能性があります。それらは揮発性有機硫黄植物化学物質であり、ω-アルケニルとω-メチルチオアルキルイソチオシアネート³に分類できます。これらの化合物の中で、アリルイソチオシアネート(AITC)は、西洋わさびやマスタード⁴などのアブラナ科に属する植物に最も多く見られる天然ITC製品です。市販のわさびペーストは一般的に西洋わさびから調製されるため、AITCはこれらの市販製品の品質管理に使用される化学マーカーとなっています⁵。

食事性アルコール飲料とわさびを注入した料理を組み合わせることは、文化的気質の一例と見なすことができます⁶。主観的には、この組み合わせはわさびとスピリッツの間の辛さと熱さを補完し、全体的な料理体験を向上させる可能性があります。動物定性的行動評価(QBA)は、短期または長期の外部刺激に対する被験者の行動変化を^{数値7を用いて}調べる、包括的な全動物的方法論的アプローチである。この方法には、疼痛テスト、運動テスト、学習および記憶テスト、およびげっ歯類モデル⁸用に特別に設計された感情テストが含まれます。しかし、味覚と嗅覚の相乗的官能評価を調査した研究は、これまで文献に乏しいままです^9,10。化学感覚に関する研究のほとんどは、個々の食品と飲料の消費を別々に調べることに限定されています¹¹。そのため、わさびを飲みながら酒の匂いを嗅ぐ行為を含む味覚と匂いの相互作用に関する研究は不足しています。

わさびによる刺痛感覚は侵害受容の一種であると考えられているため¹²、動物の行動評価は、げっ歯類の動物における侵害受容性感覚反応の評価によく適している^8,13,14。マウスの侵害受容を評価するための方法は、マウスしかめっ面スケール(MGS)スコアリングとして知られている、Langfordら^{によって開発されました15,16}。この行動研究法は、実験マウスが示した表情の解析に依存した、痛みに関連する評価アプローチです。実験のセットアップは簡単で、透明なケージとビデオ録画用の2台のカメラを使用します。自動データ収集のための先進技術^17、18、19を組み込むことにより、定量的および定性的な行動測定を得ることができ、行動モニタリング²⁰における動物福祉を向上させることができる。したがって、MGSは、動物に対するさまざまな外部刺激の影響を中断することなく自由に研究する際に適用できる可能性を秘めています。ただし、採点プロセスでは、パネリストによる評価のために数枚(10枚未満)のビデオフレーム画像を選択するだけであり、事前のトレーニングが必要です。大量のサンプル画像のスコアリングは、手間がかかる場合があります。この時間のかかる課題を克服するために、いくつかの研究では、MGSスコア^21,22を予測するために機械学習技術が採用されています。ただし、MGSは継続的な尺度であることに注意することが重要です。したがって、マルチクラス分類モデルは、わさびを摂取し、酒の匂いを嗅ぐマウスの画像が正常なマウスの画像に似ているかどうかを判断するなど、論理的およびカテゴリー的な問題を評価するためにより適しています。

本研究では、マウスにおける味覚と匂いの相互作用を調査するための方法論を提案した。この方法論は、動物の行動研究と畳み込みニューラルネットワーク(CNN)を組み合わせて、マウス被験者の顔の表情を分析します。2匹のマウスは、通常の行動条件下で、ワサビ誘発性侵害受容の経験中、および特別に設計されたケージ内で酒を嗅いでいるときに3回観察されました。マウスの表情を動画に記録し、生成されたフレーム画像を活用して深層学習(DL)モデルのアーキテクチャを最適化しました。その後、独立した画像データセットを使用してモデルを検証し、実験グループから取得した画像を分類するためにデプロイしました。わさびの摂取中にマウスが同時に酒の匂いを嗅いだ場合のわさび辛味の抑制の程度を決定するために、人工知能によって提供される洞察は、別のデータ分析方法であるMGSスコア¹⁶との交差検証を通じてさらに裏付けられました。

プロトコル

本研究では、体重17-25gの7週齢ICR雄マウス2匹を動物行動評価に利用した。すべての住居と実験手順は、教育と研究における人間と動物の被験者の使用に関する香港バプテスト大学委員会によって承認されました。動物の部屋は、12時間の明暗サイクルで25°Cの温度と40%〜70%の部屋の湿度に維持されました。

1.ケージの設計

1. ケージ構造用の3つの異なる寸法のアクリロニトリルブタジエンスチレンレンガを準備します:8 mm x 8 mm x 2 mm、16 mm x 16 mm x 6 mm、および32 mm x 16 mm x 6 mm。
2. ケージベースとしてアクリロニトリルブタジエンスチレンプレート(312 mm x 147 mm x 2 mm)を準備します。
3. 底板として使用する厚さ2mmの239mm×107mmの不透明アクリル板を用意します。
4. 天板として使用する厚さ5mmの239mm×107mmの透明アクリル板を用意します。
5. 端子板として使用する厚さ7mmの107mm×50mmの透明アクリル板を用意します。
6. レンガを54mmの高さに積み重ねて、2つの不透明な側壁を構築します。
7. アクリル板をアクリロニトリルブタジエンスチレンベースのケージに埋め込みます( 図1Aに示すように)。
8. 図1Bに示すように、厚さ2mmの90mm×50mmの透明アクリル板5枚で構成されたチャウズチャンバーを準備します。透明アクリル板5枚のうち、側面に2枚、上部に1枚、下部に1枚、端子に1枚のプレートを使用します。
9. チャウ導入プレートとして60mm×50mm×2mmの透明アクリルプレートを用意し、チャウの部屋に置きます。

2.動物行動評価

1. 7週齢のICRオスマウス2匹の同腹仔を通常のケージに一緒に入れます。
2. 2匹のマウスの同腹仔に、1週間の適応期間中、餌のペレットと水道水への無料アクセスを提供します。
3. 1週間後、2匹のマウスの同腹仔をエタノールのボトル(~40% v/v)で導入します。
   注:飲酒が制限されている間、提供された水性エタノールを 自由 自在に嗅いだり吸い込んだりすることが許可されていることを確認してください。
4. 9〜10週齢のマウスモデルと 、図1Aに示されている透明なキュービクルケージを使用して行動実験を行います。
5. アクリル板とアクリロニトリルブタジエンスチレン板を全て分解し、よく清掃してください。まず、超純水で3回以上すすぎ、ペーパータオルで乾かします。次に、75%エタノールをスプレーし、レンズペーパーで洗浄します。最後に、少なくとも15分間風乾させます。
6. 行動実験の各再現前に、マウスの体重を量り、体重を記録します。
7. わさびとピーナッツバターの混合物を、市販のわさび1gとピーナッツバター4.5gの重さで新たに調製します。ジッパー付きのビニール袋に混ぜます。
   注:わさび中のイソチオシアネートは揮発性があるため、市販のわさびは-20°Cの冷凍庫で保存することが重要です。
8. 図1B、Cに示すように、0.5gのピーナッツバターペースト2個、またはわさびとピーナッツバターの混合物をチャウ導入プレートに秤量し、提供します。
9. 図1B、Cに示すように、準備したチャウ導入プレートをチャウの部屋に置き、各ビデオ録画セッション中に2匹のマウスが自由に餌にアクセスできるようにします。
10. 図 1B、C に示すように、純水または酒 (~42% v/v エタノール) のいずれかの 30 mL の液体で下の溝を満たし、同時吸入を容易にします。
11. 各端末の電話スタンドに設置された2台のスマートフォンのカメラを使用して録画を開始します。
    注:ビデオの仕様は次のとおりです:フレーム幅、1920年。フレームの高さ、1080;データレート、20745 kbps;フレームレート、30.00フレーム/秒(fps)。
12. 訓練された2匹の同腹仔マウスを、設計された動物行動研究プラットフォームに上から慎重に配置し、ケージをトッププレートで迅速に固定します。
    注: この手順が 15 秒以内に完了していることを確認してください。
13. 各ビデオを2〜3分間録画します。
    注:ピーナッツバターとわさびの混合物の調製からビデオ録画の完了まで、実験の全期間が5分に制限されていることを確認してください。
14. 実験全体を3回繰り返します。
    注:実験の各反復が少なくとも6時間離れていることを確認してください。
15. さまざまなシナリオを模倣します。
    注:たとえば、この研究では、マウスのペアを4つのグループで使用し、上記の実験設定を使用して模倣した4つの異なるシナリオを使用しました。これらのシナリオには、バックグラウンド研究のシナリオ A、ポジティブ コントロール研究のシナリオ B、ワサビ-アルコール 味-匂いの相互作用研究のシナリオ C、ネガティブ コントロール研究のシナリオ D が含まれます。 表 1 に、これらのシナリオの概要を示します。

3. 画像認識

画像処理に関する多くの研究23,24,25と同様に、分類モデルはCNNの訓練によって達成された。DL 操作のスクリプトは、Jupyter Notebook (anaconda3) 上の Python v.3.10 で記述されました。これは、次のGitHubリポジトリで入手できます:git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git。CNN の構築とトレーニングには、numpy v.1.21.5、seaborn v.0.11.2、matplotlib v.3.5.2、cv2 v.4.6.0、sklearn v.1.0.2、tensorflow v.2.11.0、keras v.2.11.0 などのオープンソース ライブラリが使用されました。これらのライブラリは、画像認識のためのCNNを開発およびトレーニングするために必要なツールと機能を提供しました。

1. 収集したビデオ クリップから一連のビデオ フレーム イメージをエクスポートし、提供されている Jupyter Notebook ( Step1_ExtractingAndSavingVideoFrameImages.ipynb) を使用してモデル トレーニング用のデータ セットを生成します。
2. 提供されたペーストを消費するマウスが少なくとも1つある画像のみを選択します。選択された画像の例を 、補足図1、補足図2、補足図3、補足図4、補足図5、補足図6、 および 補足図7に示します。
3. Jupyter Notebook で提供されているスクリプト Step2_DataAugmentation.ipynb を実装して、生成された画像を水平方向に反転することでデータ拡張を実行します。
4. 1 秒ごとにレプリケートするイメージ データを、外部の独立した CNN モデルの検証用に予約します。各 1 回目と 3 回目の反復の画像を使用して、内部モデルのトレーニングとテストを行います。
5. CNN モデリングで使用される画像データを前処理するには、Jupyter Notebook で Step3_CNNmodeling_TrainTest.ipynb という名前のスクリプト (画像のサイズ変更、黒色変換、画像信号の正規化など) を実行します。
6. トレーニング資料を内部トレーニングデータセットとテストデータセットに 8:2 の方法でランダムに分割します。
7. CNN のアーキテクチャを初期化します。調査するシナリオの数に基づいて、CNN の出力数を設計します。
   注:たとえば、この研究では、ニューラルネットワークが3つのクラスを分類するように指定されました。クラスの重みに関するデータの不均衡を処理するスクリプトがコンパイルされていることを確認します。
8. CNN 構築の内部テスト サンプルで損失が最小になるハイパーパラメーターの組み合わせを見つけます。
9. CNN アーキテクチャの構築に最適なハイパーパラメーターの組み合わせを採用します。
10. 提供されている Jupyter Notebook Step4_CNNmodel_ExternalValOriginal.ipynb と Step5_CNNmodel_ExternalValFlipped.ipynb を開きます。動物行動実験の2回目の複製からの独立した(元の画像と反転した)画像を使用して、達成されたモデルを検証します。
11. Jupyter Notebook Step6_CNNmodel_Application.ipynb を使用して、実験グループから生成されたビデオ フレーム画像を分類するための、達成され検証されたモデルをデプロイします。
    注:たとえば、この作品のシナリオCです。

4.手動マウスしかめっ面スケールスコアリング

注:CNNモデル予測によって提供される洞察を検証するために、以前にLangfordらによって開発および検証された別の方法が適用されました¹⁶。この方法では、5つの特定のマウスフェイシャルアクションユニット(AU)に基づいてMGSをスコアリングします:眼窩の引き締め、鼻の膨らみ、頬の膨らみ、耳の外側への引き締め、ひげの変化。各AUには、AUの不在、中程度の存在、または明らかな存在を示す0、1、または2のスコアが割り当てられます。このスコアリングシステムにより、各AUの定量化とスケーリングが可能になり、マウスが経験した侵害受容または不快感のレベルを評価できます。

1. 各ビデオクリップのペーストを摂取している同腹仔の3つのビデオフレーム画像をキャプチャします。各フレームが 3 秒以上離れていることを確認してください。
2. "shuffleSlides.pptm" という名前の提供されたテンプレート ファイル (補足ファイル 1) を使用し、埋め込まれたマクロ コードを実行することにより、ブラインド コードを作成し、さまざまなシナリオ クラスの画像を順番にランダムに並べ替えます。
3. 少なくとも 10 人のパネリストを招待して、サンプル画像を採点してもらいます。
4. MGS を使用して画像サンプルをスコアリングするようにパネリストをトレーニングします。パネリストに、MGSに関する元の記事とそのマニュアル^15,16を含むトレーニング資料を提供します。
5. キャプチャされたフレーム内の各動物の被験者のMGSスコアを、対応する5つの顔のAUのすべてのスコアポイントを平均して計算します。MGS スコアを平均±標準測定誤差 (SEM) として表示します。
6. 異なるシナリオのクラス間で統計的に有意な差が存在するかどうかを、Bonferroniの多重比較の事後検定による一元配置分散分析(ANOVA)により判断します。
   注: P < 0.05 の値は、統計的に有意であると見なされます。

結果

この研究の主な目的は、マウスの味覚と嗅覚の相互作用を調査するための堅牢なフレームワークを確立することです。このフレームワークには、人工知能とQBAの使用が組み込まれており、予測分類モデルが開発されています。さらに、DLから得られた洞察は、内部の独立した分析のための定量的MGS評価と交差検証されます。この方法論の主な応用は、マウスが食事性アルコール飲料を嗅いだときにワサビが引き起こす侵害受容の抑制の程度を調べることです。

深層学習モデルによるワサビ陰性酒陽性群のクラスに属するワサビアルコール共治療画像の29%の認識
顔の過剰反応は、市販のわさびペーストを消費すると、人間に発生する可能性があります。同様の経験はマウスでも観察できました(補足ビデオ1)。侵害受容感覚はげっ歯類の顔の表情とよく相関しているため、2匹の同腹仔の行動を監視して、市販のわさびを含むまたは含まないチャウを提供した場合の反応を決定しました。この研究では、DL技術を使用してCNNを訓練しました。各シナリオで 3 回の反復が行われたため、^{1 回目} と 3^回目の 反復の画像材料は、CNN モデルのハイパーパラメーターの調整とモデリングの内部トレーニングとテストに使用されました。この調査における CNN アーキテクチャの進化を 表 2 に示します。CNNの最適化されたアーキテクチャは、解像度が268 x 268ピクセルの入力レイヤーと、それぞれに8つのフィルターを持つ4つの2次元畳み込みレイヤーで構成されていました。さらに、2つのプーリング層、2つのドロップアウト層、1つのフラット化層、および2つの高密度層が3クラス分類タスクに組み込まれました。CNN アーキテクチャについては、 補足ファイル 2 を参照してください。

この研究のモデルは、35,486枚の画像のデータセットを使用して訓練され、7つのエポックを通じて8,872枚の画像でテストされました。内部トレーニングおよびテストデータセットに対する損失、精度-再現率、精度、感度(または再現率)などのメトリックを含む、トレーニング中のトレーニング済みモデルのパフォーマンスは、 補足図8A-Dで確認できます。このモデルは、内部トレーニング セットとテスト セットの両方で、その精度、精度、感度が 1 であることを実証しました。これは、モデルの予測が、内部トレーニングデータセットとテストデータセットの両方で画像の実際のクラスと一致したことを示しています。モデルのトレーニング後、2^回目の レプリケートの画像を使用して、達成された CNN モデルでオーバーフィットが問題にならないことを確認し、個別に検証しました。このモデルは、バックグラウンド研究(シナリオA)の4,820枚の画像、ポジティブコントロール研究(シナリオB)の3,900枚の画像、ネガティブコントロール研究(シナリオD)の2,731枚の画像に対して、精度、精度、感度の値1により、予測のロバスト性を示しました。達成された予測モデルは、霊を嗅ぎ、わさびを含むピーナッツバターを消費するマウスのビデオフレーム画像(シナリオC)をさまざまな研究シナリオ、つまりシナリオA、B、およびDに分類するために展開されました。その結果、画像の0%と29%が背景研究(シナリオA、純水とワサビフリーピーナッツバター存在)とネガティブコントロール研究(シナリオD、チャイニーズスピリットとワサビフリーピーナッツバター存在)のクラスに分類され、画像の71%がポジティブコントロールグループ(純水とワサビ-ピーナッツバター混合物が存在するシナリオC)のクラスに分類されました。これらの知見は、食事性酒の存在がマウスのワサビ誘発性侵害受容を減少させる可能性を示唆している。提供されたトレーニング資料からマシンが何を学習したかを評価するために、畳み込みレイヤーごとに特徴マップが生成されました。 補足図9A-Dに示されているように、機械の注意は、眼窩、鼻、頬と体の縁、耳、そしてまた顎の接触面など、さまざまな顔の特徴に集中していることが観察されました。これらの観測結果に基づいて、別のデータ解析手法であるMGSが実施されました。MGSはマウスの顔面AUに焦点を当てており、ワサビ誘発性侵害受容に対するアルコール飲料の提示抑制能力の統計的評価とさらなる検証を可能にします。

手動マウスしかめっ面スケールスコアリングは、機械学習の予測を統計的に検証します。
ワサビ誘発性侵害受容の強度は、MGSスコアを使用して評価され、0から2の範囲のスコアが割り当てられ、スコア0が最も重症度が低く、スコア2が最も重篤な反応を示します。本研究では、24匹のマウス(すなわち、選択された12枚の画像に2匹のマウスを 補足図10、補足図11、補足図12、補足図13 として提示)のMGSスコアを、22人の訓練を受けたパネリストによって評価した。2匹のマウスの同腹仔を3回実験で分析したところ、バッチ内精度とバッチ間精度は、それぞれ0%〜25%および9%〜33%の範囲の相対的な標準導出を有することが示されました。これは、MGSスコアリングプロセスの精度と一貫性が良好であることを示しています。ピーナッツバターのペーストを与えられたマウスのMGSスコア(図3A、0.73±0.04)とワサビとピーナッツバターの混合物を与えられたマウス(図3B、1.59±0.11)との間に有意差が観察されました。これにより、動物行動研究の実験設定が検証され、侵害受容反応の誘発におけるわさびの有効性が確認されます。提供されたアルコール飲料の下から放出されるアルコール蒸気(~42% v/v of alcohol)は刺激性があるかもしれませんが、MGSスコア(図3D、0.86 ± 0.16)は対照群(図3A、0.73 ± 0.04)と比較して有意差を示さなかった。しかし、わさび-ピーナッツバター混合物を投与したマウスのMGSスコア(図3B、1.59±0.11)と、わさび摂取中にアルコール蒸気にばく露したマウス(図3C、0.95±0.07)との間には有意差が認められ、 P 値は<0.05であった。これらの知見は、わさびとアルコール飲料の併用が、わさびによる刺激を減少させる可能性があることを示唆しており、人工知能の視点と一致している。エタノールの存在に起因すると思われる、わさび辛味の抑制に寄与する提供された中国の精神内の効果的な成分を調査するには、さらなる調査が必要です。

既に使用可能なコードの例。現在の提出物に関連付けられた画像認識を実行するためのすべてのコードは、公開 GitHub リポジトリ (git@github.com:TommyNHL/imageRecognitionJove.git) で入手できます。更新は、この作業の最終的なDOIの引用とともに、GitHubリポジトリでも公開されます。

図1:疼痛関連動物行動学試験の実験装置(A)各端末に設置した2台のスマートフォンのカメラを用いて、2匹のマウスの表情を動画記録するための全体の設定。(B)ピーナッツバターまたはわさびとピーナッツバターの混合物の0.5gペースト2個を2匹のマウスに自由自在に供給するために使用したチャウチャンバーと、ペーストの下の溝に30mLの液体(水または~42%v/vの液体)を充填して同時吸入した。(C)30mLの液体で満たされ、わさび-ピーナッツバター混合物のペーストが2つ含まれていた溝を詳しく見てください。混合物は、1gの市販のわさびを4.5gのピーナッツバターに混合することによって調製されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:畳み込みニューラルネットワークモデルのアーキテクチャとその入力と出力。 トレーニングには、バックグラウンド研究のシナリオA、ポジティブコントロール研究のシナリオB、ネガティブコントロール研究のシナリオDの3つの異なるシナリオの画像が使用されました。わさび-アルコール-味-匂いの相互作用研究のシナリオCの画像は、モデルトレーニング後にシナリオA、B、またはDに分類されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:異なるチョーを与えられたマウスのしかめっ面スケール(MGS)スコア。 MGS スコアは 0 から 2 で、スコア 0 は最も深刻度の低いスコアを表し、スコア 2 は最も深刻度が高いことを示します。参照MGSスケールは、Langford et al. (2010)¹⁶から採用されました。提供されたマウスのしかめっ面は、(A)消費用のピーナッツバターのスコアは0.73±0.04でした。(B)わさびとピーナッツバターの混合物(ピーナッツバター4.5gに市販のわさび1g)を摂取すると、スコアは1.59±0.11でした。(C) わさびとピーナッツバターの混合物を摂取し、アルコールの吸入は提供されたスピリッツ(~42% v/v のアルコール)の下から利用可能であったが、0.95 ± 0.07;(D)アルコールの吸入が下から利用可能であった間、消費用のピーナッツバターは、提供されたスピリットが0.86±0.16を獲得しました。*、 P < 0.05;**、 P <0.01; ns、95%信頼区間の下でのBonferroniの多重比較事後検定による一元配置分散分析による有意差はありません。エラーバーは、測定の標準誤差(SEM)を表していました。各シナリオで2匹のマウスに対して三重測定を行いました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:動物の行動評価で模倣された4つのシナリオの要約。 備考: ^この 混合物は、1gの市販のわさびを4.5gのピーナッツバターに混ぜて調製しました。 ^b ~42% v/v アルコールを含むチャイニーズスピリッツ。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 2: モデルのパフォーマンスの概要。 バッチサイズ64のハイパーパラメータ、ドロップアウトが追従しない8の^1番目の 2D畳み込み層のフィルター番号、8の^2番目の 2D畳み込み層のフィルター番号、0.1ドロップアウトの8の3^番目の 2D畳み込み層のフィルター番号、8^{の4番目の} 2D畳み込み層のフィルター番号、8の4番目の2D畳み込み層のフィルター番号、 また、0.5 ドロップアウトの密な層 64 のフィルター番号は、内部分割テスト セットの損失が最も低かった。次に、これらのハイパーパラメータを採用して、シナリオCの画像を予測するための3グループ(シナリオA、B、およびD)分類モデルをトレーニングしました。シナリオBはポジティブコントロール試験でした。シナリオDはネガティブコントロールスタディ用でした。シナリオCは、わさび-アルコール、味-匂いの相互作用研究でした。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図1:シナリオAのクラスの深層学習のための学習教材の例(背景研究)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:シナリオBのクラス(ポジティブコントロール研究)の深層学習のトレーニング資料の例。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:シナリオDのクラス(ネガティブコントロールスタディ)の深層学習の学習教材の例。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4:モデル検証のためのシナリオAのクラス(バックグラウンドスタディ)の予測と例の独立した資料。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図5:モデル検証のためのシナリオB(ポジティブコントロールスタディ)のクラスの予測と例の独立した材料。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図6:モデル検証のためのシナリオD(ネガティブコントロールスタディ)のクラスの予測と例の独立した材料。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図7:モデル適用のためのシナリオCクラス(わさび-アルコール、味-匂いの相互作用研究)の予測と例題。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図8:最適な深層学習モデルの予測パフォーマンス。 (A)7エポックに沿ったトレーニング損失と内部検証損失。(B)精度-再現率曲線、(C)精度、および(D)7エポックに沿ったトレーニングと内部検証の再現率。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図9:各畳み込み層の特徴マップ。 シナリオ A、B、および D の (A) 最初、(B) 2 番目、(C) 3 番目、(D) 最後の畳み込みレイヤーの特徴マップを、上から下に並べ替えます。シナリオAは、バックグラウンド調査のためのものでした。シナリオBはポジティブコントロール試験でした。シナリオDはネガティブコントロールスタディ用でした。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図10:シナリオAの手動マウスしかめっ面スケールスコアリング用に選択された画像(背景研究)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図11:シナリオBの手動マウスしかめっ面スケールスコアリング用に選択された画像(ポジティブコントロール研究)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図12:シナリオC(わさび-アルコール、味-匂いの相互作用研究)の手動マウスしかめっ面スケールスコアリング用に選択された画像。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図13:シナリオDの手動マウスしかめっ面スケールスコアリング用に選択された画像(ネガティブコントロール研究)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ1: わさび摂取後のマウスのしかめっ面と、その下に提供されたアルコール飲料の有無。0秒から8秒まで、ビデオクリップはピーナッツバターを摂取したときのマウスの正常な表情を示しました。8秒から17秒まで、わさびを摂取したときのマウスのしかめっ面を示しました。マウスは、眼窩の引き締め、鼻の膨らみ、頬の膨らみ、耳の外側への引き締め、ひげの変化を示しました。17秒から29秒まで、ワサビが誘発する侵害受容は、精神が下で利用可能である場合に抑制できることが示されました。29秒から最後まで、上記のさまざまなシナリオで顔をしかめるコレクションを示しました。なお、ご提供の動画はあくまでもイメージです。その品質は、画像認識とモデリングで説明されている品質要件とは異なります。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:shuffleSlides.pptm。「shuffleSlides.pptm」という名前の補助的な Microsoft PowerPoint マクロ対応プレゼンテーション。このファイルは、マウスのしかめっ面スケールスコアリングのブラインドテスト用の画像をシャッフルするために用意されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:CNNアーキテクチャ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この研究で味覚と嗅覚の相互作用を研究するために提案された方法は、Langfordらによって開発されたマウスの痛みの顔面表現のための行動コーディングの元の方法に基づいています¹⁶。最近発表されたいくつかの記事では、マウスの顔の自動追跡とその後のMGSスコア^{21、26、27、28}のためにCNNが紹介されています。CNN を適用すると、予測モデルのトレーニングに使用できる一連のビデオ フレーム イメージの生成に従った、独自の方法よりも利点があります。対照的に、元の方法では、MGS用に限られた数の画像を事前に選択する必要があり、主観性とバイアスが生じる可能性があります。

以前に発表されたCNNベースの方法の中で、すべては、血液循環^26,28に直接痛みを引き起こす薬剤を注射したときの苦痛または不快感の程度を評価するために開発されました。この薬剤導入アプローチの欠点の1つは、マウスの顔プロファイルを捉えていないビデオフレーム画像をフィルタリングするために多大な労力が必要になることです。この研究では、侵害受容を引き起こす薬剤である商用わさびがアドリバイタムベースで提供されます。ピーナッツバターは、揮発性成分のAITCを隠すだけでなく、マウスの被験者を引き付けて明確な正面図のジェスチャーを提示することもでき、ビデオ録画中にマウスの顔のプロファイルをキャプチャするのを容易にします。さらに、このアプローチにより、針の挿入による痛みによる潜在的な干渉が排除されます。ただし、マウスの摂取動作が鼻の膨らみや頬の膨らみのMGSスコアリングを妨げる可能性があることに注意することが重要です。これに対処するには、マウスに純粋なピーナッツバターを提供することによるベースライン制御実験を実施する必要があります。

動物行動研究のための特定のCNNベースのアルゴリズムでは、マウスの顔のアクションユニットのサブセットのみが訓練画像から選択され、キャプチャされるようにプログラムされている^21,22。これらの計算方法は、侵害受容感覚に関連する事前定義された特徴に依存している一方で、個々のマウス被験者に固有の他の重要な特徴を無視する可能性があります。その結果、情報の損失につながる可能性があります。対照的に、この研究では、マウスの顔全体の画像を使用してCNNモデルをトレーニングするという異なるアプローチを取ります。この画像のみの使用(IOU)ベースの方法は、画像分類²⁵に対してより効率的であることが示されています。したがって、本研究で提案されたCNNモデリングアプローチは、最初に領域注釈なしで画像全体を使用してCNNモデルを訓練し、次に手動の人間による評価を通じてモデルを検証するいくつかの提案された方法と類似している^27,29。このアプローチにより、画像により多くの情報を保持し、主観的な導入を防ぐことができます。

しかし、この研究の実験設定の限界は、マウスの被験者が個々の生息地ではなく、2匹の同腹仔として飼育されたことです。この決定は、マウスが社会的な動物であり、通常は集団環境で繁栄することを考慮して、意図的なものでした。興味深い発見は、動物の訓練期間中、3つのケージのうち1つのケージで2匹の同腹仔だけが中国の精神の存在に適応するように訓練されたことです。その結果、これら2匹の同腹仔に対してのみ三重実験が行われました。CNNモデリングのトレーニング資料では、セグメンテーションを行わずに、2つの同腹仔の両方を含む個々の画像も個々のサンプルとして取得されました。このアプローチにより、同腹仔同士の相互作用を捉え、彼らの行動を顔の表情とともにまとめて分析することができました。

画像ベースのMGSスコアリング法と同様に、本研究で提案されている方法は、ネコ科動物やウマなどの他の種類の動物にも転用可能であることが期待されている^30,31。提案された方法論を適用することにより、コンピュータビジョンを応用した食物誘導チャウの導入方法は、特にさまざまな動物における味覚と嗅覚の相互作用に関する動物の行動研究を促進するためのアプローチになる可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
無水エタノール(EtOH)	VWRケミカルズBDH	CAS#64-17-5
クリロニトリルブタジエンスチレンレンガ	Jiahuifeng旗艦店	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
アクリロニトリルブタジエンスチレンプレート	Jiahuifeng旗艦店	https://shop.paizi10.com/jiahuifeng/chanpin.html
アリルイソチオシアネート(AITC)	Sigma-Aldrich	CAS# 57-06-7
無水ジメチルスルホキシ	ド Sigma-Aldrich	CAS# 67-68-5
中国の精神	Yanghe Qingci	https://www.chinayanghe.com/article/45551.html
商業わさび	S&Bフーズ株式会社
ギ酸 (FA)	VWR Chemicals BDH	CAS# 64-18-6
GraphPad Prism 5	GraphPad	https://www.graphpad.com
HPLC グレード アセトニトリル (ACN)	VWR Chemicals BDH	CAS# 75-05-8
HPLC グレード メタノール (MeOH)	VWR Chemicals BDH	CAS# 67-56-1
Microsoft Excel2016	マイクロソフト	https://www.microsoft.com
Microsoft PowerPoint 2016	Microsoft	https://www.microsoft.com
Milli-Q water system	Millipore	https://www.merckmillipore.com
Mouse: ICR	Laboratory Animal Services Centre (The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China)	該当しない
ナッツバター	スキッピー	https://www.peanutbutter.com/peanut-butter/creamy
Python v.3.10	Pythonソフトウェア財団	https://www.python.org
透明アクリル板	淘宝網店	https://item.taobao.com/item.htm?_u=32l3b7k63381&id=60996545797 0&spm=a1z09.2.0.0.77572e8dFPM EHU