方法論記事

量子ドットナノビーズに基づく蛍光ラテラルフロー免疫測定法

DOI：

10.3791/67000

⸱

2024年6月28日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Central Laboratory, Shanghai Skin Disease Hospital, School of Medicine, Tongji University, 2Department of Dermatology, Shanghai Skin Disease Hospital, Institute of Dermatology, School of Medicine, Tongji University, 3Department of Pharmacy, Changzheng Hospital, Naval Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、量子ドットナノビーズ(QDNB)の調製と、QDNBベースのラテラルフローイムノアッセイストリップを使用した疾患バイオマーカーの検出のためのプロトコルについて説明します。試験結果は、UV光照明下で定性的に評価し、蛍光ストリップリーダーを使用して15分以内に定量的に測定できます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

量子ドットは、半導体ナノ結晶とも呼ばれ、生物学的イメージングおよびセンシングのための新しい蛍光標識です。しかし、骨の折れる精製手順で調製された小さな寸法(~10 nm)の量子ドット抗体コンジュゲートは、ラテラルフローイムノアッセイストリップを使用して特定の微量疾患マーカーを検出する感度に限界があります。ここでは、ワンステップエマルジョン蒸着法を用いた量子ドットナノビーズ(QDNB)の作製方法を紹介します。調製されたままのQDNBを使用して、C反応性タンパク質(CRP)を例に疾患バイオマーカーを検出するための蛍光ラテラルフローイムノアッセイを作製しました。量子ドットナノ粒子-抗体複合体は、単一の量子ドットナノ粒子とは異なり、1つのポリマー複合ナノビーズに数百の量子ドットをカプセル化することによりシグナル増幅するため、イムノアッセイ標識としてより感度が高くなります。さらに、QDNBのサイズが大きいため、QDNBを抗体と結合させる際の遠心分離が容易になります。QDNBに基づく蛍光ラテラルフロー免疫測定法を作製し、サンプル中のCRP濃度を15分で測定しました。試験結果は、UV光照明下で定性的に評価し、蛍光リーダーを使用して15分以内に定量的に測定できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ラテラルフローイムノアッセイ(LFIA)ストリップは、特に流行時の疾患スクリーニングにおいて、ポイントオブケア1,2で重要な迅速検出ツールとして機能します。しかし、従来の金コロイドベースのLFIAテストストリップは、検出感度が低く、定性的な結果しか得られません3。LFIAの検出感度を向上させるために、着色ラテックス4,5、アップコンバージョン蛍光ナノ粒子6、時間分解蛍光マイクロスフェア7,8、量子ドット9,10,11など、さまざまな新しいナノ粒子が出現しています。量子ドット(QD)12,13は、半導体ナノ結晶とも呼ばれ、調整可能な発光波長、広い励起範囲、および高い発光効率を提供し、生物学的イメージングに理想的な標識となっています。

しかし、個々の量子ドットから放出される蛍光シグナルは弱いままであるため、イムノアッセイでの検出感度は比較的低くなります。マイクロスフェア内に多数の量子ドットをカプセル化すると、信号を増幅し、量子ドットベースのイムノアッセイの感度を向上させることができます。マイクロスフェアの内部に量子ドットを封入するために、層ごとの自己組織化14,15,16,17,18、膨潤法19,20、シリカミクロスフェア21,22,23,24カプセル化など、様々な方法が採用されてきた。例えば、量子ドット官能化シリカナノスフェア標識は、サンドイッチ免疫反応25当たりの量子負荷を増加させることによって達成することができる。超音波噴霧器を備えた噴霧乾燥機も、ナノスケールQD-BSAナノスフィア26を調製するために使用されている。しかしながら、前述の方法は、複雑な多ステップ、蛍光消光、および低い生産性に悩まされる。

我々の以前の研究27では、量子ドットをポリマーナノビーズ内に封入するためのエマルジョン溶媒蒸発法が報告された。この調製技術はシンプルで、量子ドットの蛍光効率を維持し、高いカプセル化効率を確保し、容易にスケーラブルな生産を可能にします。いくつかの研究グループは、この方法で調製されたQDNBを使用して、食品毒素検出28,29,30、感染症バイオマーカー検出31,32、環境モニタリング33などのアプリケーション向けにLFIAストリップの開発に成功しています。

このプロトコールでは、量子ドットナノビーズ(QDNB)、QDNBおよび抗体の結合、QDNBベースのLFIAの調製、およびヒト血漿サンプル中のC反応性タンパク質(CRP)の測定のための特定の調製ステップを示します。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本試験は、上海皮膚病病病院の治験審査委員会(No.2020-15)により承認されました。ヒトの血液サンプルを含むすべての実験手順は、バイオセーフティレベルIIの実験室で実施されました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. QDsナノビーズの作製

注:QDナノビーズ合成のために、エマルジョン溶媒蒸発法を用いて、油相と水相の比率が1:5のQDナノビーズを合成した。ミニエマルジョンは超音波 処理によって 生成され、ナノビーズは溶媒(クロロホルム)蒸発によって固化されます。水酸化ナトリウムは、ナノビーズ表面上の無水物基の加水分解を触媒し、それらをカルボキシル基に変換するために利用されました。

  1. 油相および水相溶液の調製
    1. 1 mLの油相を調製します:0.4 mLのポリ(無水スチレン-コ-マレイン酸)(PSMA)溶液(50 mg / mL)、0.1 mLのQDs溶液(100 mg / mL)を調製し、1 mL未満の任意の容量にクロロホルムを充填します。.
    2. 5 mLの水相を調製します:SDS水溶液(0.5重量%)。
  2. エマルジョンと凝固の調製
    1. バイアル(15mL)に油相1mLと水相5mLを加え、マグネチックスターラーにバイアルを置きます。マグネチックスターラーの電源を入れます。
    2. 油相と水相が完全に混合された後、直ちにフラスコをプログラムされた超音波処理(60秒、3秒パルス、続いて3秒の一時停止、50%振幅)に移し、電源を入れます。
    3. 超音波処理後の溶液を観察します。当初は深紅色の溶液は、赤みがかった色調をまだ保持している乳白色の段階に移行しました。
    4. バイアルを室温のマグネチックスターラーに戻し、一晩中連続的に攪拌します。クロロホルムを徐々に蒸発させ、エマルジョンを固めて複合ナノビーズにしました。
  3. ナノビーズの表面改質
    1. 0.1 mLの0.1 mM水酸化ナトリウムをナノビーズ懸濁液に1時間加えます。ナノビーズの表面の無水物基は、カルボキシル基に加水分解されます。
  4. ナノビーズの精製
    1. マグネチックスターラーをオフにし、固化したナノビーズを遠心分離管に移します。チューブを13523 x g で室温で10分間遠心分離し、上清を捨てます。
    2. 初期量の脱イオン水を沈殿物に加え、チューブを蓋で覆い、超音波水浴に沈め、沈殿物が完全に分散するまで浸漬を維持します。
    3. 手順1.4.1〜1.4.2を2回繰り返し、最後にナノビーズをガラス瓶に移します。使用するまで4°Cで保管してください。
  5. ナノビーズの特性評価
    1. 透過型電子顕微鏡(TEM)イメージング22を用いて、QDsナノビーズのサイズと形態を特徴づける。
      注:QDs溶液とPSMA溶液の割合を変更することにより、異なるサイズのナノビーズを得ることができます。QDsナノビーズのサイズは、動的光散乱(DLS)27によっても決定することができる。

2. QDNB抗体複合体の調製

  1. カルボキシル基の活性化
    1. 調製したQDNB 100 μL (10 mg/mL) をリン酸バッファー 200 μL (PB、20 mM、pH 6.0) に加え、さらに 6 μL の EDC (20 mg/mL) を添加します。
    2. 混合物をロータリーミキサーで室温で30分間インキュベートします。
    3. インキュベーション後、混合物を13523 x g で室温で10分間遠心分離し、上清を捨てます。
    4. 100 μLのPB(20 mM、pH 6.0)を沈殿物に加え、チューブを蓋で覆い、沈殿物が完全に分散するまでチューブを操作可能な超音波ウォーターバスに浸します。
  2. 抗体とナノビーズの結合
    1. 100 μgの抗体を200 μLのPB (20 mM、pH 6.0)に分散させ、ステップ2.1で得られた活性化QDNB懸濁液を抗体溶液に加えます。
    2. 混合物を室温で30分間、連続回転させてインキュベートします。6010 x g で5分間(室温)遠心分離して余分な抗体を除去し、上清を慎重に廃棄します。
  3. ナノビーズのブロッキング
    1. 残渣(ステップ2.2.2で得られた)に200 μLの1%カゼイン溶液(20 mM PB緩衝液、pH 7.4)を加え、チューブを蓋で覆い、残渣が完全に分散するまで操作可能な超音波水浴に浸します。
    2. 混合物を室温で2時間、連続回転させてインキュベートします。
      注:このステップの目的は、QDNBの表面上の未反応の部位をブロックすることです。
  4. コンジュゲートの保管
    1. 100 μLの保存剤溶液 (20 mM PBバッファー、pH 7.4、1% BSA、5% トレハロース、6% スクロース、0.1% S9、pH 7.4) を混合物に加え、4°Cで保存して使用してください。

3. ラテラルフローイムノアッセイストリップの作製

注:イムノクロマトストリップは、ニトロセルロース(NC)メンブレン、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、吸収パッド、およびポリ塩化ビニル(PVC)ボードで構成されています(図1)。すべての溶液は直ちに調製し、使用する必要があります。ラテラルフローイムノアッセイストリップは、湿度が制御されたクリーンルームで調製することをお勧めします。

  1. NCメンブレンの調製
    1. テストライン(Tライン)とコントロールライン(Cライン)のコーティング溶液を調製する:CRP捕捉抗体とヤギ抗ウサギIgGをPBで希釈し、最終濃度1 mg/mLにします。
    2. PVCボードを適切に配置し、PVCボードの端から25mmの位置にある保護紙をはがします。NCメンブレンを残りの保護紙の下端に沿ってPVCボードに位置合わせして接着します。
    3. TラインおよびCラインコーティング溶液をNCメンブレンに1μL/cmの噴射速度で分注し、上端から20mm離して配置し、テストライン(幅1mm)を形成します。
    4. NCメンブレンを湿度30%未満、温度範囲18〜26°Cの条件に置き、乾燥させます。乾燥時間は少なくとも24時間でなければなりません。
      注意: NCメンブレンの上端と下端が、隣接する領域の対応する端と同じ高さになっていることを確認してください。NCメンブレンは手で触れないでください。このステップ中の湿度は、45%から65%の範囲で制御する必要があります。先に進む前に、Tラインコーティング溶液、Cラインコーティング溶液、およびNC膜を同じ温度に平衡化する必要があります。
  2. コンジュゲートパッドの調製
    1. コンジュゲートパッドをコンジュゲートパッド処理溶液(20 mM PBバッファー、pH 7.4、1%BSA)に浸します。
    2. 浸したコンジュゲートパッドを乾燥オーブンに入れ、乾燥処理(室温)を一晩します。
    3. 変更されたコンジュゲートパッドをPVCボードにそっと接着します。
    4. 調製したQDNB抗体標識溶液を保存溶液(20 mM PBバッファー、pH 7.4、1% BSA、5%トレハロース、6%スクロース、0.1% S9、pH 7.4)で希釈します。
    5. QDNB抗体標識溶液を1 μL/cmの噴射速度で標識パッドに分注し、標識パッドを24時間乾燥させます。
      注:比希釈比は検出対象に応じて調整する必要があります。
  3. サンプルパッドの準備
    1. サンプルパッドをサンプルパッド処理溶液(20 mM PBバッファー、pH 7.4、1%BSA、5%トレハロース、6%スクロース、0.1%S9、pH 7.4)に浸します。
    2. 浸したサンプルパッドを乾燥オーブン(45°C)に入れ、24時間乾燥させます。
  4. カードを組み立てて短冊状にカットする
    1. 図1に示すように、NCメンブレンでPVCボード上に吸収紙(吸収パッド)、コンジュゲートパッド、サンプルパッドを順次配置します。
    2. カードを3.8mm幅のストリップにカットします。
  5. ストリップの包装
    1. テストストリップをプラスチックカセットに包み、乾燥剤が入ったアルミホイルポーチを密封します。

4. アッセイ操作と定性評価

注:ヒトの血液サンプルを含む操作は、バイオセーフティレベルIIの実験室で実施することをお勧めします。ヒト血漿サンプルは、臨床検査室(匿名化されたヒト被験者)から採取されました。.典型的には、ヒトの血液はEDTA真空管を用いて採取され、血漿は標準プロトコル34に従って単離された。3,000 × g で室温で10分間遠心分離し、プラズマ分離を行います。ピペットを使用して黄色の血漿上層を採取し、使用するまで-80°Cで1.5 mLのチューブに血漿を保存します。.

  1. 10 μL の血漿サンプルまたはキャリブレーター溶液を、0.1% Tween 20 を含む PBS バッファー 1 mL にピペットで移します。次に、調製した希釈サンプル100μLをテストストリップのサンプルパッドに移します。
  2. 15分間のラン後、紫外線曝露下でTラインとCラインの蛍光シグナルを観察し、定性的な結果を得ます。
  3. ストリップカードを蛍光ラテラルフローアッセイリーダーに挿入して、定量分析のための蛍光強度を取得します。
    注:この例では、サンドイッチイムノアッセイ法が採用されています35,36;1本の赤い線(制御線)は陰性の結果を示し、2本の赤い線(テスト線と制御線)は陽性の結果を示します。コントロールラインがない場合は、実施されたテストが無効であることを示します。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

QDNB の調製手順を 図 1A に概略的に示しています。クロロホルム中のQDsおよびポリマーを含有する油相を水相と混合し、超音波処理によりミニエマルジョンを得た。エマルジョンは、クロロホルムの段階的な蒸発によって固化した。QDNBの透過型電子顕微鏡写真(TEM)を 図2Aに示します。QDNBは球状形態を持ち、平均直径は96 nmで、TEM画像では50個以上のQDNBで測定されました。量子ドットナノ粒子はナノビーズの内部ではっきりと観察され、カプセル化に成功していることを示しています。 図2B および 図2D は、それぞれQDNBの蛍光スペクトルと吸収スペクトルを示しています。

QDNBと抗体は、 図1Bに示すように、カルボジイミドケミストリーを用いて標識しました。QDNBベースのLFIAを調製するために、QDNB抗体コンジュゲートを使用しました。LFIA の構造を 図 1C に示します。CRP抗原がサンプル中に存在する場合、QDNB抗CRPコンジュゲートはテストラインに蓄積します。

図3に示すように、希釈したサンプル100μLをサンプルホールに加えることで測定を行います。15分の反応時間の後、UV光照明下で試験結果を定性的に読み取ることができます。定量結果は、蛍光ストリップリーダーを用いて得ることができ、サンプルの濃度は、ストリップリーダーソフトウェア37、38に埋め込まれた較正式を用いて計算することができる。

figure-results-1
図1:量子ドットナノビーズに基づく蛍光ラテラルフローイムノアッセイの図(A)QDNBの調製手順。(B)QDNB抗体複合体の原理。(C)CRP検出のためのQDNBベースのLFIAの原理。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:QDNBの特性評価 (A)QDNBのTEM像 スケールバー:100 nm。(B)QDNBの蛍光発光スペクトル。(C)QDNBの吸収スペクトル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:CRPのラテラルフローイムノアッセイの手順(A)検出の図。(B)UV光の下で0〜30 mg / Lの範囲のCRPサンプルを検出するQDNBベースのLFIAストリップの写真。(C)結果を定量化するための蛍光リーダー。(D)定量結果の写真。(E)ロジスティック変換とそれに続く線形回帰を用いたC反応性タンパク質(CRP)の検出。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、量子ドットナノビーズ(QDNB)27の調製と、蛍光ラテラルフロー免疫測定法(LFIA)の調製のためのQDNBの使用のためのプロトコルについて説明します。サンプル中のCRPの定性的および定量的測定が実証されています。このQDNBベースのLFIAは、他の疾患バイオマーカー25,32、食品毒素29,30、ウイルス16,27などにも適用できます。

このプロトコールの重要なステップは、QDNBおよびQDNB抗体複合体の調製です。QDNBの粒子サイズとナノビーズ中のQD含有量を最適化して、LFIAでバックグラウンドシグナルの少ない高蛍光QDNBを得る必要があります。捕捉抗体と検出抗体のペアはイムノアッセイにとって重要であり、さまざまなベンダーから最適なものが得られるようにスクリーニングする必要があります。抗体とQDNBの結合は、抗体/QDNB比、バッファーpH、ブロッキング試薬など、最適化する必要があります。具体的には、結合手順でバッファーのpH、塩濃度、反応時間を最適化することにより、QDNBと抗体の凝集を回避する必要があります。

量子ドットナノビーズの他の調製方法と比較して、このプロトコルには、単純さ、操作の容易さ、および高い生産性という利点があります。さらに、ポリマー複合ナノビーズは、通常ポリマーによる追加の表面改質を必要とするシリカナノビーズとは異なり、生体適合性があります。ただし、このプロトコルを使用して調製したQDNBは、ポリマー19 またはシリカ21 テンプレートナノビーズを使用して調製したQDNBほど単分散ではありません。QDNBの粒子径は通常70nmから200nmの範囲です。

QDNBベースのラテラルフローイムノアッセイ(LFIA)ストリップは、他の蛍光LFIAと同様に調製されます。QDの高い量子収率とQDNBのシグナル増幅により、このプロトコルを使用するQDNBベースのLFIAは、時間分解蛍光マイクロスフェアやフルオレセインマイクロスフェアなどの他の蛍光マイクロスフェアベースのLFIAよりも感度が高くなります。さらに、QDNBの安定性は従来のフルオレセインよりも優れているため、QDNBベースのLFIAの保存時間が長くなります。

しかし、量子ドットの表面にあるカドミウムは、特に水溶液環境において、タンパク質中のスルフヒドリル基とキレート化されやすい傾向があります。高濃度のタンパク質の使用を避けることは、QDNBベースのLFIAの安定性にとって重要です。カドミウムは毒性があり、状況によってはその使用が制限されているため、高い量子収率と安定性を備えたカドミウムフリーの量子ドットを調製する必要があります。

要約すると、量子ドットナノビーズをワンステップで調製する汎用性の高い方法が提供されており、工業生産にスケーラブルです。調製されたままのQDNBを使用して、疾患バイオマーカーの定性的および定量的検出のための蛍光ラテラルフローイムノアッセイストリップを作成しました。LFIAに最適なQDNBは、蛍光消光なしで多数のQDでカプセル化された小型ナノビーズです。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pengfei Zhang は Shanghai Kundao Biotech の創設者であり、この会社と潜在的な金銭的利益を持っています。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、上海科学技術委員会(STCSM)のプロジェクト(22S31902000)および上海皮膚病病院の臨床研究インキュベーションプログラム(NO.lcfy2021-10)の支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
(ジメチルアミノ)プロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩Sigma-Aldrich03450
吸光度紙 Kinbio BiotechCH37K
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichB2064
カゼインSigma-AldrichC8654
CdSe/ZnS 量子ドット蘇州メソライト株式会社CdSe/ZnS-625
CholoroformSino Pharm10006818
CRP抗体Hytest Biotech4C28
蛍光ラテラルフローアッセイリーダー蘇州ヘルメンス精密機器FIC-H1
グラスファイバーパッドKinbio BiotechSB06
ヤギ抗ウサギIgGサンゴンバイオテックD111018
ニトロセルロースメンブレン SatoriousCN140
ポリ(スチレン-マレイン酸無水物)共重合体 Sigma-AldrichS458066
Rabbit IgGSangon BiotechD110502
ドデシル硫酸ナトリウムSino Pharm30166428
水酸化ナトリウムSino Pharm10019718

参考文献

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