このプロトコルは、マイクロコントローラーベースのビヘイビアボックスを提供し、ボックスの下のセンサーから加速度データを収集することにより、プリパルス阻害(PPI)を評価します。このデータは、社会的に隔離されたラットの感覚ゲーティング障害を評価し、行動障害に関する神経生理学研究を進めるために、データをニューロン活動と同期させる方法が追加されています。
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このプロトコルは、マイクロコントローラーベースのビヘイビアボックスを提供し、ボックスの下のセンサーから加速度データを収集することにより、プリパルス阻害(PPI)を評価します。このデータは、社会的に隔離されたラットの感覚ゲーティング障害を評価し、行動障害に関する神経生理学研究を進めるために、データをニューロン活動と同期させる方法が追加されています。
幼少期の苦痛は、神経発達障害の潜在的な前兆として認識されています。この状態を動物モデルで調査するアプローチの1つは、離乳後の社会的孤立です。げっ歯類におけるこの幼少期の苦痛は、統合失調症患者で観察されるものと同様、前頭前野の体積の減少、樹状突起脊椎密度の減少、腹側被蓋領域でのドーパミン作動性活性の増加など、神経変化を引き起こすことが示されています。プレパルス阻害(PPI)パラダイムは、ヒトモデルと動物モデルの両方で感覚ゲーティングの欠損を評価するための確立された方法です。PPIとは、より弱い音響事前刺激(例えば、65dBパルス)が先行する場合に、より強い音響刺激(例えば、120dBパルス)に対する驚愕反射の抑制を指す。この現象は、精神疾患患者や精神疾患の動物モデルではしばしば軽減されます。この記事では、統合失調症のアクセス可能で費用対効果の高い動物モデルの使用と、モデルからのニューロン記録(電気生理学的記録など)と行動ボックスの同期を可能にする、PPI研究用の行動ボックスを構築するためのプロトコルを紹介します。このカスタマイズされた行動ボックスは、離乳後の分離を受けた自由に行動するげっ歯類の驚愕反応を効果的に検出し、同時にニューロンを記録するPPI評価を促進しました。
統合失調症(SCZ)と診断された人は、しばしば感覚運動障害を呈します。感覚刺激に対する反応の低下と、多様な感覚入力からの関連情報の識別の困難さは、これらの患者でしばしば報告されます1,2。健康な人にとっては、強い刺激の前に弱い刺激を与えると、強い刺激に対する通常の驚愕反射が減少します3。この現象はプレパルス阻害 (PPI) として知られており、SCZ 患者および SCZ4 の動物モデルにおける感覚ゲーティング欠損の調査に使用されています。
音響PPI課題では、単一の強い音響パルス(例えば、~120dB)に対する驚愕反応と、同じ刺激が短い間隔(30〜500)で弱い刺激(例えば、~65dB)によって先行された場合の驚愕反応と比較される3,4。健康な人では、弱いプレパルスが提示されると、パルスに対する驚愕反応は減少します(単一の強いパルスのみに対する驚愕反応と比較した場合)。この現象は、SCZの個人では抑制され、強いパルス1,5,6,7,8の前に弱いプレパルスが提示される場合でも、驚愕反応の抑制が少なくなります。
SCZ患者と同様に、中脳辺縁系ドーパミンの過剰活動を持つラットも音響PPI9の低下を示し、このパラダイムは統合失調症の動物モデルにおける行動的および生理学的変化を調査するための有用なツールとなっています。一般に、PPI用の市販の装置は、センサー、スピーカ、および実験パラメータ(パルス間間隔や刺激強度など)の設定、げっ歯類の驚愕反応の記録、およびデータの処理のためのソフトウェアを含む音響チャンバーで構成されています。ただし、商用システムでは、カスタマイズ オプションが限られていることが多く、コストがかかります。柔軟な研究装置を構築するためのDIY(Do-It-Yourself)アプローチは、機器へのアクセスを増やし、知識を移転しています10。PPIのような感覚運動ゲーティングメカニズムを研究するためのDIYソリューションは、有効性と信頼性を確保するためにいくつかの重要な要素を考慮する必要があります。重要な考慮事項には、設計仕様、環境と光の制御、音の減衰、刺激供給システム、行動測定センサー、データ収集と分析などがあります。
行動ボックスのDIYソリューションは、オペラント舐め実験11、聴覚識別課題12、前肢機能13など、さまざまな機能のために開発されてきた。ビデオトラッキング14に焦点を当てたDIYアプローチがいくつかありますが、このタイプのデータを分析するには高い計算リソースが必要です。オープンソースのハードウェアおよびソフトウェアプラットフォームを使用して、カスタマイズされた実験15,16,17をテストし、自由に行動する動物のニューロン記録を同期させる柔軟性を備えた低コストのPPI行動ボックスを構築することができます。
この記事では、SCZ様症状の発症に寄与する早期ストレスである離乳後隔離ラットモデルを調査するための低コストのプラットフォームでPPIを評価するための行動ボックスを開発する方法を紹介します。
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動物実験は、「実験動物の世話と使用に関するガイド」に従って実施しました。このプロジェクトは、CEUA Santos Dumont Instituteの倫理委員会によって承認されました(承認番号04/2016)。PPI試験では、35匹のWistarラット(3か月齢、290-490 g、雄19匹、雌16匹)をPPIボックスで個別に評価しました。35匹のラットはすべて、離乳後の隔離のプロトコルを受け、温度23°C、湿度70%の12/12時間の光サイクルの下で、食物と水に 自由 にアクセスできる制御された施設で個別に飼育されました。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。
1. PPIボックス

図1:ビヘイビアボックスの下にしっかりと取り付けられた加速度計。 この図は、データ比較用の低コストの加速度計ボード(左)とハイエンドの商用加速度計(右)を示しています。加速度計はアクリルボックスにしっかりと取り付け、フラットケーブルはアクリルに取り付けて、清掃手順や動物の交換によるアクリルの破損を防ぐ必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:統合マイクロコントローラベースのビヘイビアボックス。 アクリルボックスの中にネズミがいて、有線のヘッドステージが脳電気生理学記録システムに接続された様子を模式図で示しています。マイクロコントローラーに接続されたボックスの下にある加速度センサーは、3軸加速度センサーのデータをコンピューターに送信し、オフラインデータ処理のための刺激トリガーマークを取得します。スピーカーがノイズ、バックグラウンド、サウンドパルスを再生し、加速度計データのマーカーをトリガーします。マイクロフォンは、音響刺激を取得して電気生理学的データと同期します(たとえば、タスク中の発声行動を取得します)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. ラットの離乳後隔離法
3. 電極アレイ脳移植術の手技

図3:微小電極アレイインプラント (A)前辺縁系および下辺縁系PFC、VTA、AMY、NAcc、およびhipc用の50μmのタングステンワイヤー32本を備えた微小電極アレイ。(B)脳のターゲット、ブレグマ、ラムダを示すラットの頭蓋骨。(C)頭蓋切除術とネジの穴あけ位置。(D)微小電極アレイインプラントと頭蓋切除術の図面をサポートするためのネジ。(E)硬膜のない頭蓋骨の開口部。(F)脳を貫通する微小電極。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. PPIとニューロンの記録

図4:聴覚刺激の種類。 7分間のホワイトノイズと5種類のプレパルス+パルスの組み合わせのイラストセッションがランダムに提示されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
5. 電気生理学的・行動学的解析



図5:3軸加速度計のデータとRMS。 (A)例示的な三軸加速度計(x、y、z軸(g))のデータは、ベースラインとランダムホワイトノイズ80 PPI刺激の6分間に記録されました。(B) 3 つの加速度計軸 (x、y、z で強調表示された灰色の列、 B で展開) からの RMS 計算を驚かせます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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プレパルス阻害は、パルス5(120dBのみ)と比較してパルス1と3に差は見られませんでしたが、パルス2とパルス4(p < 0.05)には統計的な差が示されました(図6)。

図6:5種類のパルスにおける聴覚刺激に対する平均応答振幅。 パルス1とパルス3のPPI%はパルス5と違いはありません。パルス2と4(*)のPPI%はパルス5とは異なります。エラーバーは標準エラーを表します。
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このプロトコルは、脳データ(この例では、局所電界電位とスパイク活性)を記録しながら、自由に行動するWistarラットのプレパルス阻害課題を研究するためのDIY行動ボックスを提示しました。このボックスは、神経科学研究所で一般的に見られるコンポーネントを使用して構築およびカスタマイズできるため、入手しやすく安価です。このようなDIYソリューションにより、実験の設計とパーソナライズの柔軟性も高まります。
DIYシステムを使用すると、低コストや使いやすさなど、多くの利点が観察できます。オープンソースのソフトウェアとハードウェアにより、新しいプロトコルの構築とテストが可能になり、さまざまなアプリケーションでの利用が容易になります。一方、より高度なマイクロコントローラやシングルボードコンピュータに比べて処理能力が低いなどの欠点や制限により、複数の入力センサ(サンプルレートの高いセンサなど)を使用する、より複雑で計算負荷の高いアプリケーションでのDIYシステムの使用が制限される可能性があります。
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著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。
Edith Granados, Cinvestav Guadalajara, PPIスクリプトとデータ同期でこのプロジェクトをサポートしてくださり。この研究は、Santos Dumont Institute、Ministry of Education、CNPq、CAPES、およびFINEPによって資金提供されました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アクリルボックス | カスタムメイド | 厚さ5mmのアクリル板、20cm×25cm×25cm | |
| 粘着ゴムバンパーパッド | ゴリラのグリット | MPU6050 | 直径0.8インチ、高さ0.38インチ。アクリルボックスを安定させ、外部振動から隔離するゴムパッド。箱の下にMPU6050があるため、高さは5mm以上にする必要があります。 |
| Arduino 宇野 | Arduino | ATmega328P | ATmega328PをベースとしたArduinoマイクロコントローラボードで、14個のデジタル入出力ピン、6個のアナログ入力、16MHzのクロック速度を備えています。 |
| Cedrus stim tracker(オーディオ検出器) | セドラス | https://cedrus.com/stimtracker/index.htm | Cedrus stim trackerは、音響刺激を検出し、TTLマーカーを加速度計データに送信します。 |
| シネプレックスリサーチシステム | プレクソン | https://plexon.com/plexon-systems/cineplex-behavioral-research-system/ | 電気生理学的データと同期した動物の録画ビデオ。 |
| シアノアクリレート接着剤 | MPU6050 | 箱の下にMPU6050をしっかりと貼り付ける瞬間接着剤。 | |
| デジタルサウンドレバーメーター | 実験前に設定された刺激を校正するためのデシベルメーター。 | ||
| IBM SPSS | SPSS(社会科学統計パッケージ、米国) | IBM SPSS Statistics ソフトウェア・プラットフォーム。 | |
| マトラブ | マスワークス | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | データ解析、アルゴリズム開発、モデル作成のための MATLAB プラットフォーム。 |
| マイクロステンレス鋼ネジ | 直径1.2mm、長さ4mmのメガネネジ。 | ||
| マイクロエレトロードアレイ | 社内でカスタムメイド | オムネティクスコネクタとカリフォルニアファインワイヤーのパリレンでコーティングされたタングステン50ミクロンワイヤーを使用しています。 | |
| マイク | 電気生理学的データと同期した音響刺激を取得するためのマイク。 | ||
| MPU-6050 | インベンセンス | https://invensense.tdk.com/products/motion-tracking/6-axis/mpu-6050/ | MPU-6050は、3軸ジャイロスコープと3軸加速度計です。 |
| マルチチャンネルアクイジションプロセッサ | プレクソン | スパイク/LFP | MAP Plexonは、神経細胞の電気生理学的データSPIKE/LFPおよび補助チャネル(マイク、TTLマーカー、加速度計)を取得します。 |
| ニューロエクスプローラ | ネックス | https://www.neuroexplorer.com/ | 連続記録信号とタイムスタンプ(スパイクトレイン、行動イベント)のNeuroExplorerデータ解析プログラム |
| ニューロエクスプローラー | ネックステクノルギー | https://www.neuroexplorer.com/ | SPIKEおよびLFP神経生理学的データ解析のためのソフトウェア |
| オフラインソーター | プレクソン | https://plexon.com/products/offline-sorter/#38957t34842 | オフラインスパイク選別用ソフトウェア |
| オフラインソーター | オフラインソーター | https://plexon.com/products/offline-sorter/ | Offline Sorterは、オフラインのスパイクソーティングソフトウェアです |
| 直腸動物用SpO2センサー | KTMEDの | FS-03型 | 小動物用SpO2センサー |
| リボンケーブル | Arduinoに接続するための細いリボンケーブルMPU6050。 | ||
| ロボティドリル | ニューロスター | https://robot-stereotaxic.com/drill-injection-robot/ | ニューロスター定位固定装置に用いるロボットドリル手動ドリルで交換できます。 |
| 話者 | スピーカーの範囲は100〜40kHzで、強度は最大150dBです。 | ||
| 定位固定装置 | ニューロスター | げっ歯類の脳神経外科に使用される定位固定 |
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