小腸および大腸単分子膜界面を用いたウシオルガノイド技術の進歩

腸管オルガノイドとして知られる3次元(3D)培養物での腸上皮幹細胞の培養は、腸の機能、栄養、および病原体との相互作用を調査するためのin vitro技術における大きな進歩を示しています^1,2。これらのオルガノイドは、自己複製し、さまざまな腸細胞系統を包含する3D形成に組織化することにより、in vivo腸上皮の複雑な構造を模倣します³。この特徴は、腸内生物学の理解を前進させる彼らの大きな可能性を浮き彫りにしています。

腸内オルガノイド技術を家畜に応用することへの関心が高まっているため、培養と維持技術の改良が必要とされている^4,5。この技術の関連性は、家畜の腸内健康の研究に潜在的な影響を与えることで強調されており、これは家畜の生産性に重要な役割を果たし、その結果、動物福祉と運用コストに影響を与えることにより、食用動物産業の経済性に重要な役割を果たします^6,7。具体的には、サルモネラ属菌や大腸菌(大腸菌)O157:H7⁸などの人獣共通感染症の腸内病原体の貯蔵庫としての役割を考えると、ウシの腸内オルガノイド培養を使用して腸内オルガノイド培養を使用することが最も重要です。これらの病原体は腸の特定の部分に局在しているため、研究の精度を高めるためには、腸内オルガノイド培養法を腸内セグメントごとに区別することが不可欠です⁹。

腸オルガノイドの研究における大きな障害は、上皮細胞の頂端表面へのアクセスが制限されていることである¹⁰。細胞外マトリックス(ECM)内で培養すると、細胞は自然に向きを変え、基底面が外側を向き、頂端面が内側を向くようになる¹⁰。この課題に対処するために、3Dオルガノイドを単一細胞に解離し、それらを半透過性の細胞培養インサートに播種する方法が提示されています。このセットアップにより、頂端面と基底外側コンパートメントとの間にインターフェースが確立されます。このプロトコルは、ウシ腸オルガノイドに由来する細胞が、経上皮電気抵抗(TEER)測定および傍細胞透過性アッセイによって証明されるように、コヒーレントな2D単層を形成できることを実証しています。さらに、オルガノイド由来の2D単層細胞におけるブラシ境界とタイトジャンクションによる細胞極性の発達は、免疫蛍光法と電子顕微鏡法によって確認されており、 これはin vivo 腸上皮の特性を反映しています。

この研究では、回腸は小腸管を表し、直腸は大腸管を意味します。これらの選択は、回腸¹¹を転座させることができるサルモネラ属菌や、主に牛の直腸⁹にコロニーを形成することが知られている大腸菌O157:H7などの関連する腸管病原体に基づいています。これらの特定の腸セグメントの選択は、研究の精度を高めるために腸内オルガノイド培養法を腸領域に合わせて調整する必要性を浮き彫りにしています。これらの方法は、これらの腸セグメントからオルガノイド由来の2D単層界面を効果的に培養する手順を詳しく説明し、牛の腸の健康、病原体感染、および腸内細菌叢と宿主との間の相互作用を調査するための堅牢なモデルを提供します。

腸内陰窩は、地元の食肉処理場で調達された余剰の腸内標本から調達され、ドナーの信号は 補足表1に記載されています。オルガノイドは、屠殺場で人道的に安楽死させた動物に由来する組織を用いて作製したものであり、この研究のためだけに動物を調達したわけではありません。したがって、この研究は IACUC レビューから免除され、倫理ステートメントは適用されません。

1. オルガノイド由来の2D単分子膜培養のための細胞培養インサートへのECMコーティング

注:すべての手順は、バイオセーフティキャビネット内の滅菌材料と無菌技術を使用して実行されます。すべての試薬は、特に明記されていない限り、手順全体を通して氷上に保管されます。

1. 0.33 cm² 細胞培養インサート各100 μLをコーティングするために、基礎培地と2%(v/v)ECMベースのハイドロゲルをマイクロチューブ内で完全に混合して、ECMを調製します。
2. 滅菌した鉗子でパッケージから個々の細胞培養インサートを取り出し、24ウェルの透明で平底の細胞培養プレートのウェルに個別に入れます。
3. ステップ1.1で調製したECMコーティング100μLを、ステップ1.2で調製した各細胞培養インサートのアピカルチャンバーに塗布します。
4. 蓋を元に戻し、コーティングされた細胞培養インサートを含む細胞培養プレートを加湿インキュベーターで37°Cおよび5%CO₂ で1時間インキュベートします。
   1. 回腸オルガノイド細胞の場合、インサートは1時間のインキュベーション後にすぐに使用できます。直腸オルガノイド細胞の場合、1時間のインキュベーション後、ECMコーティングを直腸単層培養培地に交換し、一晩インキュベートします(表1)。TEER測定を実行する場合は、ブランクコントロール用の追加の細胞培養インサートを準備します。

表1:成体ウシ回腸オルガノイドおよび直腸オルガノイドに由来する2D単分子膜を作成するための最適化されたプロトコルの要約。

2. ウシ回腸オルガノイドおよび/または直腸オルガノイド細胞の播種と2D単層培養

注:このセクションで説明するプロトコルは、記載されている技術⁵を使用して48ウェルプレート上で培養および維持されたウシ回腸および直腸オルガノイドを使用します。最適な結果を得るには、最初の樹立から3回以上経過し、直近の継代から3日以上経過して培養された、安定して維持されたオルガノイドを使用することが推奨されます。

1. 成熟オルガノイドを含むECMベースのハイドロゲルドームを乱さずに、真空システムに取り付けられた使い捨てガラスパスツールピペットを使用してオルガノイド培養培地を取り出し、ウェルあたり300 μLの氷冷ECM解重合溶液を加えます。4°Cで少なくとも1時間インキュベートします。
   注:あるいは、ECM解重合溶液を添加した後、ECMベースのハイドロゲルドームを含むオルガノイドを機械的に破壊し、4°Cでインキュベートする前に15mLのコニカルチューブに懸濁液を回収します。 この方法は、2D単層培養に使用しないオルガノイドを同じプレート上で同時に培養する場合に推奨されます。オルガノイド培養の密度は、細胞培養インサートへの最適な播種に必要なオルガノイド培養ウェルの数に大きく影響します。
   1. 高密度オルガノイド培養(補足図1A)の場合、直腸細胞培養インサートは1:1〜1:2の範囲の播種比を使用します。これは、1つの培養ウェルで1〜2ウェルの播種が可能であることを意味します。回腸の場合は、比率を1:1に保ちます。対照的に、低密度の培養(補足図1B)では、より多くの培養ウェルが必要です。1つの直腸細胞培養インサート(3-4:1の比率)には3-4の直腸オルガノイド培養ウェルを使用し、1つの回腸細胞培養インサート(4-5:1の比率)には4-5回の回腸オルガノイド培養ウェルを使用します。
2. ECMベースのハイドロゲルが完全に溶解するかどうかを目視検査し、オルガノイド懸濁液を15 mLのコニカルチューブに回収します。
3. オルガノイドを200 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを10 μM Y-27632を添加した組換え細胞解離酵素溶液1 mLに再懸濁します。
4. オルガノイド懸濁液を37°Cの水浴で10分間インキュベートし、3〜5秒を断続的に振とうし、2〜3分ごとに渦を巻き起こして、効果的なオルガノイドの解離を促進します。
5. 酵素消化後、5 mLの基礎培地を加え、P1000マイクロピペットで積極的にピペットでピペット操作を行い、オルガノイドをさらに破壊して単一細胞にします。懸濁液にオルガノイドの塊がないか検査し、それでも視覚的に確認できる場合は、ピペッティングを繰り返して単一細胞の解離を促進します。
6. 50 mLのコニカルチューブと70 μmのセルストレーナーを調製します。1〜2mLの基礎培地を塗布して、ストレーナーを事前に濡らします。
7. ストレーナを介して細胞懸濁液をろ過し、残留ECMベースのヒドロゲル破片や大きな細胞塊を除去します。元の15 mLチューブと70 μmセルストレーナーを、さらに10 mLの基礎培地ですすいでください。
   注:細胞懸濁液がストレーナを容易に通過しない場合は、オルガノイドの不完全な解離を示している可能性があります。回収した細胞懸濁液を同じ70 μmの細胞ストレーナに再通過させることを試みることができます。追加の酵素的または機械的な混乱が必要になる場合があります。.
8. ペレット単細胞懸濁液を200 x g および4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を適切な量の基礎培地で再懸濁して細胞数を計数します。
9. トリパンブルー染色後に血球計算盤で生細胞をカウントし、収集された細胞の総数を計算します。
10. ペレット単細胞懸濁液を200 x g および4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞をそれぞれの単層培養培地で適切な播種密度に再懸濁します(表1)。
    1. 回腸オルガノイド細胞については、500 nM LY2157299、10 μM Y-27632、および20%ウシ胎児血清(FBS)を添加したオルガノイド培地である200 μLの回腸単層培養培地で、細胞培養インサートあたり5 x 10⁵細胞/mLの播種密度を達成するために、細胞を2.5 x 10⁶細胞/mLの濃度に再懸濁します。
    2. 直腸オルガノイド細胞の場合、100 nM CHIR99021、500 nM LY2157299、10 μM Y-27632を添加したオルガノイド培養培地である200 μLの直腸単層培養培地で、細胞培養インサートあたり3 x 10⁵細胞/mLの播種密度を達成するために、細胞を1.5 x 10⁶

このプロトコールは、小腸管および大腸管から堅牢なウシ腸オルガノイド由来の2D単分子膜を確実に生成し、 in vivo 腸上皮の複雑さをエミュレートします。この方法は、最適な条件で培養された健康な牛の腸管陰窩標本から開発された成熟オルガノイドを利用しています。興味深いことに、オルガノイド由来の2D単分子膜の成功および再現性のある条件は、腸のセグメントに固有です(表1)。このことは、関心のある腸の部分に最適化された培養技術を持つことの重要性を強調しています。

解離した成熟オルガノイドを細胞培養インサートに播種してから1日後に、2D単層が形成されたように見えました(図2A)。しかし、この最初の出現にもかかわらず、回腸単分子膜と直腸単分子膜の両方のTEER測定値は、この段階では低いままでした(図1C)。さらに、傍細胞透過性アッセイにより、単層は、培養のわずか1日後に、細胞層を横切って4 kDaのFITC-デキストラントレーサーを通過させることが明らかになりました(図1C)。培養3日目までに 、両方のタイプのオルガノイド由来2D単分子膜は有意な成熟を示し、TEER値の増加と4 kDaのFITC-デキストラントレーサーに対する耐性によって証明されました。この傾向は培養5日目まで続きました。

特に注目すべきは、種間の変動性であり、ウシオルガノイド由来の2D単層培養物のTEER値が、同様の条件下でのヒトおよびイヌの対応物と比較して低いにもかかわらず12,13,14,15、膜の完全性は損なわれていない。この結論は、透過性アッセイにおける単分子膜の適切な応答から導き出され、ウシサンプルのTEER値が低いことが必ずしもバリア機能の欠如を反映しているわけではないことを示唆しています。この完全性は、機能的な上皮バリアにとって重要であり、TEER測定と並行して透過性アッセイ結果を慎重に解釈することで効果的に実証されます。

走査型電子顕微鏡による2D単分子膜の頂端表面における細胞境界とよく発達した微絨毛の可視化、特殊な微小解剖学的構造の表示、回腸および直腸オルガノイド由来の2D単分子膜の成熟をさらに強化しました(図2B)。さらに、2D単分子膜の免疫蛍光染色により、回腸(図3A)および直腸(図3B)オルガノイド由来の2D単分子膜の両方に、頂端ブラシ境界、基底外側接着接合部、および粘液産生杯細胞の存在が確認されました。これらの結果は、開発された2D単分子膜が組成と形成が複雑であり、無傷の腸上皮の主要な特徴を発現するだけでなく、多系統の細胞集団で構成されていることを補強しています。

2D単分子膜の開発が成功するには、細胞のECMへの接着とコンフルエンスへの成長により、無傷の上皮層が作られます。特に、細胞培養インサートでのインキュベーション中のECM分布が不均一であったり、最適でない条件であったりすると、細胞層が部分的に剥離し、特にそのエッジに沿って顕著になることがあります(図4Ai)。この問題は、細胞が最適密度よりも高い密度で播種されている場合や、播種細胞が培養表面全体に均一に分布していない場合、オルガノイドが単一の細胞懸濁液に不完全に解離することに起因していることが多いため、さらに悪化します。このような不均一な分布は、単分子膜内にギャップが形成されたり、細胞培養インサート上の3D形態形成につながる可能性があります(図4Aii)。対照的に、細胞の播種不足は、予想される培養期間にわたって単層の発達が失敗または遅延する可能性もあり、2D単分子膜システムを利用する後続の研究の効率に不注意で影響を及ぼします(図4Aiii)。さらに、培養システムの汚染は、単分子膜内にギャップの形成にもつながり、培養の後の段階で一度形成されたコンフルエント単層を破壊する可能性があります(図4Aiv)。持続的なTEER値と傍細胞透過性応答は、前述の失敗の潜在的な原因がこれらのアッセイの前に遭遇していなかった場合でも、積極的な洗浄または取り扱い技術による細胞層の乱れによって影響を受ける可能性があります(図4B)。したがって、単分子膜の形成または破壊の慎重な細胞の取り扱いと評価は、トラブルシューティング戦略の効果的な適用を通じてオルガノイド由来の2D単分子膜の開発を成功させるために最も重要です。

図2:ウシ回腸および直腸オルガノイド由来の2D単分子膜の顕微鏡的特性評価 (A)細胞培養インサート上の培養1日目および3日目(D1およびD3)の2D単分子膜の代表的な位相コントラスト顕微鏡画像。スケールバー=100μm.(B)低倍率(左)と高倍率(右)の2D単分子膜の代表的な走査型電子顕微鏡画像。微絨毛を含む詳細な細胞表面構造は、回腸(上)と直腸(下)の両方の単層で評価できます。左スケールバー = 10 μm、右スケールバー = 2 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:回腸オルガノイドおよび直腸オルガノイドに由来する2D単分子膜の免疫蛍光特性評価。 (A、B)パネル(A)は回腸、パネル(B)は直腸オルガノイドを示しています。左側では、F-アクチン繊維がファロイジン(赤)で強調表示されており、細胞骨格構造と頂端ブラシの境界形成を示しています。中央の画像は、E-カドヘリン(緑)でマークされた接着接合部の基底外側局在を捉えており、細胞間接着と単層の完全性を示しています。右側では、ムチン産生杯細胞の存在がSNA(緑)によって識別され、回腸単層におけるムチンの頂端分泌を示すzスタック画像があります。すべての画像にわたる核をDAPI(青)で対比染色しました。さらに、すべての画像にわたるzスタックイメージングは、培養インサート内の単一細胞層の形成をさらに示しています。スケールバー = 25 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:最適でない2D単分子膜形成の特性評価。 (A)(i)細胞培養インサートのエッジに沿った単層の部分的な剥離を示す代表的な位相コントラスト画像;(ii)3D伸長の発達および単分子膜内のギャップの形成。(iii)細胞の斑状の付着として指摘される最適な播種密度よりも低いため、単層形成が不完全または遅延する。(iv)一度形成された2D単層内に後の段階でギャップが形成され、汚染が疑われるためである可能性が高い。スケールバー = 100 μm. (B) TEER 測定値の低下と 3 日目以降の透過性プロファイルの上昇は、安定した機能的な上皮バリアを確立できなかったことを示しています。結果は、2 回のテクニカル反復による 1 回の実験からの平均±標準誤差(SEM)として示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:ECMベースのヒドロゲルにおけるウシ腸オルガノイド培養の密度変動。 ECMベースのヒドロゲルで培養したウシ腸オルガノイド。(A)高密度および(B)低密度。スケールバー = 100 μm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表1:要約された組織ドナーシグナル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は、宣言する利益相反を持っていません。