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方法論記事

ミトコンドリアとリソソーム間の相互作用を可視化するための2色相関光顕微鏡と電子顕微鏡法

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DOI:

10.3791/67020

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2024年9月27日

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

この記事について

サマリー

このプロトコルは、相関光顕微鏡と電子顕微鏡を使用して、それぞれmEosEMとAPEX2で標識されたミトコンドリアとリソソームの相互作用を視覚化するメカニズムを説明しています。

要約

ミトコンドリアやリソソームなどの細胞小器官は、動的な構造を示します。構造解析のための透過型電子顕微鏡の分解能が高いにもかかわらず、光学顕微鏡は、ターゲット特異的な標識による動的オルガネラの可視化に不可欠です。次のプロトコルは、ミトコンドリアとリソソームとの間の相互作用を観察するために、デュアルカラー相関光顕微鏡法と電子顕微鏡法(CLEM)を組み合わせる方法を説明しています。本研究では、ミトコンドリアをmEosEM(Mito-mEosEM)で、リソソームをTMEM192-V5-APEX2で標識しました。CLEM画像から得られた結果により、外部ストレス条件下でのミトコンドリアとリソソームの相互作用の変化を観察することができます。リソソームの機能を阻害するバフィロマイシン(BFA)による治療により、ミトコンドリアとリソソームの接触が増加し、リソソーム内に閉じ込められた断片化されたミトコンドリアが形成されました。逆に、リソソームからのコレステロールの輸送を阻害するU18666Aによる治療では、リソソームがミトコンドリアに囲まれるようになり、異なる形の相互作用が示されました。この研究は、固定細胞内のミトコンドリアとリソソームの間の相互作用を観察するための効果的な方法を提示します。さらに、デュアルカラープローブによるCLEMイメージングは、オルガネラダイナミクスの将来の研究と、細胞機能および病理への影響のための強力なツールを提供します。

概要

ミトコンドリアとリソソームは、細胞の恒常性の維持に不可欠な主要な膜結合オルガネラです。ミトコンドリアは、分裂と融合のイベントによって調節される非常に動的な細胞小器官です1。一般に、ミトコンドリアは細胞の原動力と呼ばれ、酸化的リン酸化、ATP産生、およびカルシウムなどの代謝物貯蔵における重要な役割で知られています(2)。エネルギー代謝における役割に加えて、ミトコンドリアは、アポトーシス3,4、カルシウムシグナル伝達5,6、脂質代謝8など、他の多くの細胞シグナル伝達プロセスに関与しています。.同様に、リソソームは非常に動的な細胞小器官であり、タンパク質分解、オートファジー、エンドサイトーシス、および食作用を通じて細胞の清浄度を維持するための細胞リサイクルセンターとして複数の役割を果たします9。分解における役割とは別に、リソソームは、栄養素感知、恒常性10、脂質代謝11、細胞の脱分化12などの細胞生理学でも役割を果たします。

個々の細胞小器官の機能に関する数多くの研究が存在するにもかかわらず、私たちの最近の研究は、ミトコンドリアとリソソームの間のあまり理解されていないクロストークに集中しており、これは細胞生理学と病理学の両方に影響を与えることが実証されています。ミトコンドリアとリソソームの接触は、がん細胞、神経細胞、人工多能性幹細胞(iPSC)由来細胞13など、さまざまな細胞種で観察されており、主に細胞ストレス下やパーキンソン病13,14、シャルコー・マリー・トゥース病15などの神経変性疾患で観察されています。.ミトコンドリアとリソソームの接触は、2つの細胞小器官間のイオン(例:Ca2+)16、コレステロール17、および鉄18の交換を通じて、代謝恒常性の維持に重要な役割を果たします。さらに、ミトコンドリアとリソソームの接触は、細胞小器官の品質管理に重要な役割を果たします。例えば、損傷したミトコンドリアは、オートファゴソームに飲み込まれてリソソームに送達され、分解されるマイトファジーの過程を通じて分解の標的とすることができます。その結果、機能不全のミトコンドリアの除去は、細胞または正常なミトコンドリアにさらなる損傷を引き起こす前に促進することができます。このミトコンドリアとリソソームの相互作用は、細胞の恒常性を維持し、機能不全のオルガネラの蓄積を防ぐために重要です。したがって、損傷したミトコンドリアのみが選択的に除去され、健康なミトコンドリアが細胞内で最適に機能するようになります。

光・電子顕微鏡(CLEM)は、光学顕微鏡(LM)と電子顕微鏡(EM)の利点を組み合わせ、異なるスケールで詳細な構造情報を提供する研究手法として近年注目されているイメージング技術です。CLEMでは、まずLMを使用してサンプルをイメージングし、特定の関心領域を同定し、次に固定、脱水、包埋などのEMサンプル調製ステップを行います。次に、同じサンプルを電子顕微鏡で観察します。最近、生細胞CLEM法が報告されていますが19,20,21,22 しかし、非常にダイナミックな生体試料の光学画像と固定細胞の電子顕微鏡画像を1つの平面に正確に組み合わせることは依然として困難です。ミトコンドリアやリソソームのような非常にダイナミックなオルガネラの場合、光学顕微鏡でライブ観察すると正確な局在が変わる可能性があり、固定に必要な短い遅延時間でも動き続けます。

したがって、このプロトコルでは、イオン(例:Ca2+)16、コレステロール17、およびiron18の交換を通じて代謝恒常性を維持する重要な役割を果たすミトコンドリアとリソソームとの間の相互作用を視覚化するために、固定溶液内で活性を保つ2つの異なる分子タグが使用されました。これらの細胞小器官の間。コンストラクトTMEM192-V5-APEX2とMito-mEosEMを使用して、培養細胞内のミトコンドリアとリソソームの相互作用をEMレベルとLMレベルの両方で観察しました。ミトコンドリアについては、固定液およびOsO423でのEMサンプル調製中に蛍光シグナルを保持できる能力のために、mEosEMタグを選択しました。リソソームについては、約28 kDaのタンパク質であるAPEX2タグを使用して、EMレベルとLMレベルの両方で特定のタンパク質の局在を調べました24。過酸化水素の存在下では、APEX2の基質であるAmplex-Redが不溶性ポリマーを形成し、タグの標的位置で共焦点顕微鏡で観察できます。このプロトコルでは、2色CLEMを使用して、固定細胞内のリソソームとミトコンドリアの間の相互作用の構造を視覚化しました。

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プロトコル

サンプル調製のステップバイステップのワークフローは、図1に示されています。

1. 細胞培養とトランスフェクション

  1. 10%ウシ胎児血清および100 U/mLのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDMEMを含む35 mmガラス格子底培養皿に、1 × 10 5細胞の密度でHeLa細胞を37°Cで培養します。
  2. 細胞を播種した翌日、製造元の指示に従って、トランスフェクション試薬を使用してTMEM192-V5-APEX2およびMito-mEosEMプラスミドと30%のコンフルエンシーで細胞を共トランスフェクションします(TMEM192-V5-APEX2およびMito-mEosEMプラスミドDNA各1μgと3μLのトランスフェクション試薬)。トランスフェクション後、細胞をDMSOまたはU18666A(2 μg/mL)で処理し、バフィロマイシンA1(100 nM)で18時間処理します。

2. 共焦点顕微鏡イメージング

  1. 細胞をバフィロマイシンで処理し、18時間U18666Aした後、培地を取り出し、直ちに250μLの温かい(30°C-37°C)固定液(0.1 Mカコジル酸ナトリウム溶液[pH 7.0]に2.5%グルタルアルデヒドと2%パラホルムアルデヒド)を穏やかなピペッティングで加えます。直ちに固定液を取り出し、1.5 mLの新鮮な固定液と交換し、氷上で30分間インキュベートします。次に、氷冷した0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液1 mLで細胞を10分間3回洗浄します
    注:アルデヒドフュームは有毒です。すべての実験は、換気されたドラフト内で行う必要があります。
  2. 1 mLの冷たい20 mMグリシン溶液を加えてアルデヒドを急冷し、氷上で10分間インキュベートします。冷たい0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で3 x 10分間洗浄します。
  3. 0.1 Mカコジル酸溶液に10 mM H2O2を添加し、300 μM Amplex-Redを含む新しい溶液を調製します。500 μLのAmplex-Red溶液をサンプルディッシュに加え、氷上で5分間インキュベートします。
  4. Amplex-Red溶液を取り出し、0.1 Mカコジル酸ナトリウムバッファーで3 x 10分間すすぎます。
  5. Amplex-Red染色後、共焦点顕微鏡を使用して、3 x 3タイルスキャンモードで目的の細胞の周囲をイメージングします。微分干渉コントラスト(DIC)と蛍光信号の両方を捕捉し、40倍(または60倍)の対物レンズを使用してグリッドディッシュ上のグリッドと文字を識別および記録します><。 注:これらの概要画像は、プラスチックに埋め込まれた標本の特定のターゲット細胞を特定するためのマップとして機能します。
  6. 40倍(または60倍)の対物レンズを使用してターゲット細胞を高倍率でイメージングし、Zスタック画像を取得します.
    注:この高倍率画像は、電子顕微鏡画像に重ね合わせて相関画像を作成します。

3. EMブロックのサンプル調製

  1. LMイメージング後、1 mLの1%還元型四酸化オスミウム(等量の2%四酸化オスミウム水溶液を含む0.3 Mカコジル酸緩衝液に3%フェロシアン化カリウムを含有して調製)を4°Cで1時間後固定し、4°Cの蒸留水で10分間3回すすぎます
    注:四酸化オスミウムフュームは有毒です。すべての実験は、換気されたドラフト内で行う必要があります。
  2. 室温で蒸留水で3 x 10分間すすぎ、その後、段階的なエタノールシリーズで毎回15分間(50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、および100%)室温で脱水します。
  3. エタノールとエポキシ樹脂を3:1、1:1、1:3の体積比で混合し、各混合物の合計300μLを調製します。各エポキシ樹脂を皿に注ぎ、室温で1時間インキュベートします。その後、100%エポキシ樹脂を使用して一晩含浸します。
  4. 包埋カプセルまたはPCRチューブに新しいエポキシ樹脂を充填して調製し、チューブまたはカプセルを逆さまにして目的領域に置き、60°Cのオーブンに48時間置いて重合します。

4. 切片化とTEMイメージング

  1. エポキシ樹脂が完全に重合した後、底面ガラスを液体窒素に浸してポリマーブロックから分離します。
  2. 試料ブロックをウルトラミクロトームのサンプルホルダーにセットし、トリミングブロックにセットします。カミソリの刃を使って、対象物の周囲にレジンを台形または長方形にトリミングします。
  3. トリミングした試料ブロックをサンプルホルダーに置き、ダイヤモンドブレードを調整します。試験片ブロックの先端がダイヤモンドブレードの刃と完全に平行であることを確認してください。
  4. ウルトラミクロトームを用いて、平坦な包埋細胞から約60-70nmの極薄切片を切開します。シリアルセクションをformvarコーティングされたスロットグリッドに集め、ホットプレートで乾燥させます。
  5. 造影剤で切片を2分間染色し、クエン酸鉛で1分間染色します。
  6. グリッドをTEMサンプルホルダーにセットして観察します。光学顕微鏡からのDIC画像に基づいて目的の標的細胞を同定します。1,700倍の倍率でタイル状に重なり合った画像を使用して、セル領域全体を画像化します。

5. imageJ Fijiを使用した画像スティッチング。

  1. 画像のステッチを開始するには、imageJ Fiji25 を起動し、[ファイル] |新着 |TrakEM2 (空白) |新しいTrakEM226プロジェクト（図2A1)を作成するために、ストレージフォルダを選択します。
  2. 生のタイル画像データをワークスペースにドラッグアンドドロップして、タイル画像データセットを開きます (図 2A2)。
  3. マウスの右ボタンをクリックし、[整列] |このレイヤー内のすべての画像をモンタージュ |elastic (非線形ブロック対応)を選択し、[OK] をクリックしてデフォルト値の残りのパラメーター (図 2A3) を受け入れます。
  4. マウスの右ボタンをクリックし、[エクスポート] |フラット画像を作成してステッチ画像を作成し、[ファイル] |[名前を付けて保存] をクリックして、画像を保存します。

6. 蛍光画像のサイズ変更

  1. 写真拡大ソフト(資料表参照)を開きます。[ファイル] |蛍光画像を開いて選択します。
  2. 幅と高さを電子顕微鏡の画像と同じサイズに入力し、リサイズ法で適用するアルゴリズムを選択します(図2B1)。
  3. [ファイル] |[Save AS] は、サイズ変更された画像を保存します。

7. Big Warpプラグインによるランドマークベースの画像登録

  1. ImageJ Fijiを開き、サイズ変更した蛍光顕微鏡写真(FM画像)とステッチされた電子顕微鏡写真(EM画像)をドラッグアンドドロップします。
  2. [プラグイン] |ビッグデータビューア |Big Wrap で登録を開始し、 ドロップダウンメニューをクリックして、 FM 画像を動画として、 EM 画像をターゲット画像として選択します (図 2C1).
    注:各FMおよびEM画像には、ランドマークを表示するための3つの新しいポップアップウィンドウ(BigWrap動画、BigWrap固定画像、ランドマーク)があります。
  3. ズーム(マウスホイール)、画像の回転(左ボタンを押しながらマウスを動かす)、移動(右ボタンを押しながらマウスを動かす)などの機能を使用してFM画像とEM画像を比較し、キーボードのスペースバーを押してランドマークモードをオンにし、マウスの左ボタンを押してFM画像とEM画像で識別された少なくとも3つのランドマークをマークします(図 2C2、ピンクの点と赤い矢印)。
  4. 識別されたすべてのランドマークをマークしたら、[ファイル] |動画のエクスポート |OKと、変換されたFM画像(図2C3)を含む新しいポップアップウィンドウが表示されます
    注:新しく作成されたポップアップウィンドウは、ランドマークに基づいて変換されたFM画像です。配置を確認し、必要に応じて、ランドマークを追加または変更し、変換を再計算して調整します。
  5. [ファイル] |[名前を付けて保存] は、変換された FM 画像を保存します。

8. CLEM画像のオーバーレイ

  1. ImageJで、変換したFM画像とスティッチしたEM画像をドラッグ&ドロップします。
  2. 画像をクリック |タイプ |LM イメージと EM イメージの両方に同じイメージタイプを設定する 8-Bit Color (図 2D1).
    注: EM イメージは、8 ビット -> RGB カラー > 8 ビット カラーの順序で 2 回変換する必要があります。
  3. 画像をクリック |カラー>|「Merge Channels」は、ドロップダウンメニューからそれぞれFM画像とEM画像を選択することにより、画像を合成画像に結合します（図2D2)。
  4. [ファイル] |[名前を付けて保存] は、CLEM イメージを保存します。

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結果

この2色CLEMプロトコルを用いてミトコンドリアとリソソームの相互作用を可視化するため、Mito-mEosEMおよびTMEM192-V5-APEX2を使用しました。固定細胞をまず光学顕微鏡で観察し、続いてEMサンプリングおよびイメージングを行いました。相関画像の結果を図3A,Bおよび図4Aに示します。上述のプロトコルに従い、外部ストレス下でミトコンドリアとリソソームの相互作用に変化が見られるかを確認しました。

リソソームV-ATPase阻害剤であるBFAで細胞を処理すると、オートファジーが抑制され、その結果、ミトコンドリアの品質が低下し、ミトコンドリアとリソソームの相互作用が増加します27。DMSO処理した対照細胞（図3A）と比較して、BFA処理細胞では、リソソーム内に閉じ込められたミトコンドリアが観察されました（

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ディスカッション

このプロトコルは、遺伝的にコードされたmEosEMおよびAPEX2タグを使用して、固定細胞におけるミトコンドリアとリソソームの相互作用を観察するためのデュアルカラーCLEMを記述しています。過去数十年にわたり、顕微鏡の進歩により、細胞小器官ネットワークの変化を観察する能力が大幅に向上し32,33、細胞小器官相互作用の研究はますます興味深いものになっています。超解像顕微鏡は、ミトコンドリアとリソソームの間の非常に動的な接触の変化を観察するために使用されています34,35,36。しかし、超解像顕微鏡の使用にもかかわらず、ミトコンドリアの内膜と外膜(約22 nm)およびクリステ接合部(約28 nm)の厚さの変化を区別することは困難です37。透過型電子顕微鏡は、生体試料の構造を非常に高い解像度で観...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、韓国脳研究所によるKBRI基礎研究プログラムの支援を受け、科学情報通信部(24-BR-01-03)の資金提供を受けました。TMEM192-V5-APEX2プラスミドは、Hyun-Woo Rhee氏(ソウル国立大学)のご厚意により提供されました。TEMデータはKBRIの脳研究基幹施設で取得しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
化学薬品および試薬
25% グルタルアルデヒド電子顕微鏡科学16200アルデヒドの煙は非常に有毒です。ヒュームフードでのみ使用してください。
30%過酸化水素の解決Merck107210
4%のParaformaldehydeの解決BiosesangPC2031-100-00のldehydeの煙は非常に有毒です。ヒュームフードでのみ使用してください。
Amplex RedThermoFisherA12222
Epon 812Electron Microscopy Sciences14120
EthanolMerck100983
Fugene HDPromegaE2311Plasmid transfection
GlycineSIGMAG8898
Citrate 3%Electron Microscopy Sciences22410
四酸化オスミウム 4% 水溶液電子顕微鏡科学16320非常に有毒です。ヒュームフードでのみ使用してください。
ヘキサシアノフェレートカリウム(II)三水和物 SIGMAP3289
カコジル酸ナトリウム三水和物Sigma-AldrichC0250-500G
酢酸ウラニル電子顕微鏡科学22400
UranyLess EM 染色電子顕微鏡科学22409
Plasmid construction
Mito-mEosEMaddgene132706DOI: 10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2Sharma N.  et al.N/ADOI: 10.1016/j.chembiol.202.007
Tools
0.22 um シリンジ フィルターザルトリウス16534
35 mm グリッド カバースリップ皿MattekP35G-1.5-14-CGRD
BEEM 埋め込みカプセルテッド ペラ130
Formvar サポート シングル スロット銅グリッドテッド ペラ01705
ダイアモンドナイフ DiATOMEDU4530
超ミクロトームライカARTOS 3D
顕微鏡
倒立共焦点顕微鏡ニコンA1 Rsi/Ti-E
透過型電子顕微鏡FEITecnai G2
SoftwareAlgorithms
Fiji/Image JNIH / オープンソース
https://imagej.nih.gov/ij/ ImageJ BigWarp software packageNIH / オープンソースhttps://imagej.net/plugins/bigwarp
Photozoom Pro 8 BenVistahttps://www.benvista.com/photozoompro

代替ソフトウェア
Image Resizer : https://imageresizer.com/
Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel
ON1 サイズ変更 : https://www.on1.com/products/resize-ai/

参考文献

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