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方法論記事

イメージングと電気生理学を組み合わせて、マウスの広がりの脱分極を視覚化および記録する

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DOI:

10.3791/67032

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2024年10月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosciences and The Center for Brain Recovery and Repair, University of New Mexico School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、軽度の外傷性脳損傷後の成体マウスにおける脱分極の拡大を確実に検出するためのイメージングと電気生理学の組み合わせを示しています。

要約

Spreading Depolarizations(SD)は、脳内で発生する大規模なイベントで、灰白質を介した伝播が遅いため、検出されないことがよくあります。SD検出は難しいため、複数の方法を用いて最適に確認します。このプロトコルは、イメージングと電気生理学を組み合わせて、ほとんどのラボが確実かつ容易に採用できる方法でSDを検出する方法を説明しています。SDは、外傷性脳損傷、脳卒中、くも膜下出血、虚血、片頭痛の前兆に続いて発生します。歴史的に、SDはDCアンプを使用して記録されており、高周波活動の遅い細胞外シフトと抑制を解決できます。しかし、DCアンプは慢性的なin vivo記録に使用することはほぼ不可能です。このプロトコルでは、高周波の抑制を確認するためのin vivo電気生理学記録用の一般的なACアンプと、SDの伝播波を検出するために必要な非侵襲的イメージングを採用しています。これらの方法は、脳損傷後のSDの有無を確認するために、ほとんどの実験的アプローチで確実に採用および/または変更することができます。

概要

広がる脱分極(SD)は、外傷性脳損傷(TBI)、脳卒中、くも膜下出血、虚血、片頭痛のオーラ1など、さまざまな神経学的状態に関連しています。SDは、脳卒中およびTBIs2における組織損傷の進行に関与しています。組織喪失の進行の根底にある正確なメカニズムは不明のままです3,4.しかし、SDは、ATP依存性のナトリウム-カリウムポンプの機能がイオン勾配を維持するのに不十分になるため、ニューロンの代謝要求が十分な酸素とグルコースで満たされない場合に発生します。組織喪失におけるSDの役割を理解するためには、科学的知識を進歩させるために不可欠なSDを測定し、研究するための正確な技術が必要です。SDは、実験デザインや機器の制限により検出されないことが多い重要な神経学的イベントです。

損傷の進行における脱分極(SD)の広がりの役割は現在解明されていますが、軽度の外傷性脳損傷(mTBI)におけるその役割は不明のままです。この原稿で説明されている技術を使用した最近の研究では、SDは、明らかな組織損傷や出血がない場合でも、閉じた頭蓋骨のmTBIマウスモデルで開始されることが示されています5,6.これらの研究は、SDが急性の神経障害や神経炎症に寄与している可能性があることを示唆しています。さらに、mTBI誘発性SDの存在は、急性の行動障害と密接に関連しています6,7。したがって、SDはすべてのTBIモデルで開始される可能性が高いですが、その役割を確認することは依然として困難です。SDの存在を確認することは、mTBIの結果を正確に評価するために重要です。

広がる脱分極(SD)は、「DCシフト」として知られる細胞外電位の大幅な低下と、高周波活動の低下によって識別されます8。「DC シフト」は通常、解決に数秒かかります (~10 秒)9。「DCシフト」を捉えるには、DCアンプと銀線電極が必要です。ただし、in vivoの電気生理学は通常、低周波イベントをフィルタリングしてモーションアーティファクトを低減するように設計されたACアンプを使用して実行されます。残念ながら、この低周波フィルタリングは「DCシフト」も除去します。さらに、銀は有毒であり、慢性的な録音には適していません。一般的に使用されているACアンプは、高周波の活動の低下を検出できますが、「DCシフト」を伴わないため、SDの存在を確認することは困難です。

広がる脱分極(SD)も、さまざまなイメージング技術を使用して検出できます。最も一般的には、SDはレーザースペックルコントラストイメージングで画像化され、無傷の頭蓋骨を通る脳血流を測定します10。SDは、脳血管系と血流に大きく影響します。マウス以外のほとんどの種では、SDはSD11の前縁に沿って移動する過灌流の伝播波を誘発します。SDは、カルシウムまたはグルタミン酸の蛍光インジケーター12を使用して画像化することもできますが、これには色素または遺伝的にコードされた蛍光インジケーターを組織にロードする必要があります12,13。興味深いことに、SDは、SD14に関連付けられた固有の光信号(iOS)により、肉眼で観察できます。iOSは、NAD(P)HやFADH15,16、組織の腫脹17、脳血流の潜在的な変化などの自己蛍光分子で構成される複雑なシグナルです。その複雑さにもかかわらず、iOSの信号は信頼性が高く、野生型マウスでキャプチャできます18。このプロトコルは、特殊なウイルスやトランスジェニック動物を必要とせずに、任意のラボで実装できるため、iOSのイメージング方法を説明しています。

この方法の全体的な目標は、軽度の外傷性脳損傷(mTBI)に続く広がりの脱分極(SD)の有無を、イメージングと電気生理学の同時使用を使用して実験的に確認することです。高度な増幅器によって促進されるin vivo電気生理学は、一般的に使用される技術です。しかし、これらのアンプは、特徴的な「DCシフト」を検出することができないため、このプロトコルに記載されているイメージング技術を用いて、SDの有無を自信を持って確認することができます。イメージングと電気生理学を組み合わせる利点は、イメージングがSDの伝播を検出できるのに対し、電気生理学は関連する高周波うつ病を特定できることです。

全体として、この方法は、外傷性脳損傷(TBI)に続く広がりのある脱分極(SD)の存在を調査するのに適しています。その応用は、TBIおよびSD後の皮質ネットワーク機能の理解を高める可能性があります。このプロトコルは、閉じた頭蓋骨の衝撃モデルから、制御された皮質衝撃、流体パーカッション、体重減少などの他のモデルに適合させることができます。このプロトコルを複数の検査室に導入することで、さまざまなTBI重症度におけるSDの役割を解明できる可能性があります。確立された任意のTBIモデルを使用し、その後、このプロトコルで説明されているiOSイメージングおよび電気生理学手順を使用できます。

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プロトコル

すべての手続きは、ニューメキシコ大学の研究所の動物管理および使用委員会(IACUC)に従って行われました。C57BL/6Jマウスは市販の情報源から入手しました。8〜14週の年齢範囲内で、同数の雄マウスと雌マウスを使用しました。すべてのマウスの体重は約20gでした。この研究で使用された動物、試薬、および機器の詳細は、資料表に記載されています。補足ファイル1には、略語のリストが含まれています。

1. イメージングと電気生理学のための頭蓋骨の準備

  1. 100%酸素中に2%〜3%のイソフルランが入ったイソフルラン誘導ボックスで動物を麻酔し、足のピンチからひるむことなく適切な麻酔の深さを確保します。
  2. 術前鎮痛薬(徐放性ブプレノルフィン、3.25 mg / kg、SQ)を投与してから、動物を定位固定装置フレームに配置し、麻酔を維持します(2%イソフルラン)。.
  3. 眼科用軟膏を追加し、体温フィードバック付きの加熱パッドで動物の体温を維持します。
  4. 切開が行われる頭蓋骨の上の髪を、眼の裂傷からラムダまでの正中線に沿って剃ります。
  5. 消毒剤と消毒剤のスクラブと溶液で皮膚を滅菌する前に、切り取った髪を取り除きます。70%エタノールで仕上げ、3回繰り返して無菌手術部位を確保します。
  6. #10メスの刃を使用して、吻側から尾側への正中線を切開し、直後に医療グレードのシアノアクリレート接着剤を切開部に塗布します。皮膚を横に広げて頭蓋骨を露出させます。
  7. 頭蓋骨にシアノアクリレート接着剤をもう1滴または2滴加えて、頭蓋骨に保護を追加します.
    注:接着剤の塗布は、10秒以上空気にさらされると頭蓋骨が不透明になり始めるため、時間に敏感です。これにより、イメージング手法によるSDの視覚化が不明瞭になります。
  8. 接着剤が乾燥している間に、滅菌手術用ハサミを使用して、小脳の切開サイズを大きくします。接着剤がセットされたら、頭蓋骨スクリュー電極の埋め込みを開始します。
    1. 頭蓋骨のネジをビーズ滅菌器で20〜30秒間滅菌します。
    2. SD開始部位から離れた領域に頭蓋骨のネジを配置して、視覚的な窓を開いた状態に保ちます。
      注:一次視覚野の慢性的な記録には、3本の頭蓋骨ネジが使用されます。最初のネジは、小脳内のブレグマから約y = -6.00 mmに配置され、参照電極として機能します。記録電極は、ブレグマからy = -2.79 mm、正中線からx = ±2.5 mmの位置、左右の半球内に配置されます。
    3. 0.8mmサイズのドリルビットで、頭蓋骨に下穴を開けます。下にある組織に損傷を与えないようにするには、z軸で-0.5mmが理想的です。ステンレス鋼線で金ピンに事前にはんだ付けされている#00-90ネジを使用してください。
    4. 頭蓋骨にネジを回します.1.5-2完全に回すと、ネジが頭蓋骨を通り抜け、皮質表面に接触します。
    5. 余分なワイヤーをネジの周りに巻き付け、後でヘッドステージを配置するためにワイヤーにいくらかのたるみを許します。
    6. 同じ手順で、他の頭蓋骨のネジを取り付けます。
    7. すべての頭蓋骨ネジを所定の位置に取り付けたら、すべての金色のピンを目的のヘッドステージコネクタに差し込みます。定位固定装置アームを使用してコネクタを所定の位置に保持し、ワイヤが接触しないようにしながら、コネクタピンをネジ頭の上で保持します。
    8. シアノアクリレート接着剤で全体を密封し、頭蓋骨ネジの前のイメージング領域を乱さないようにします。
    9. 金ピンの基部の周りに歯科用セメントを積み重ね、頭蓋骨ネジの金ピンがヘッドステージの金ピンに接続されないようにします。
    10. ヘッドステージコネクタを取り外す前に、歯科用セメントが硬化するのを待ちます。
    11. 動物を定位固定装置フレームから取り外し、ホームケージに戻して回復させます。標準的な術後ケアに従い、麻酔から回復するまで動物を温熱パッドの上に置いてください.
      注:手術後、動物はシングルハウスで飼育され、毎日痛みがないか監視されました。鎮痛に関する地域の施設ガイドラインに従ってください。.徐放性ブプレノルフィンモニターを痛みに使用し、72時間で追加投与する可能性がある場合。
  9. ハウジングや濃縮物など、電極に引っかかる可能性のある物体をすべて取り除きます。標準的な寝具を使用し、食料と水に自由にアクセスできるようにしてください.
    注:手術から録画までの間に2日間の回復期間を設けてください。

2. 固有光信号(iOS)イメージングとAC電気生理学による拡散脱分極の検出

  1. 100%酸素中の2%イソフルランで動物に麻酔をかけます.
    注:この手順のイメージング部分には~5分かかり、イソフルランの曝露量は一貫している必要があります。
  2. 動物を定位固定装置フレームに入れます。ノーズコーンを通して、酸素中の1%〜2%のイソフルランを維持します.
    注:イソフルランはSDを減少させることが知られているため、麻酔の適切な深さを維持することが重要です。
  3. 動物をカメラの下に置き、フォーカスリングを調整してカメラが皮質表面に焦点を合わせていることを確認します。
  4. イメージング領域に鉱物油を塗布して、透明性を高めます。
  5. コンピュータ、LEDパネルボード、電気生理学機器の電源を入れます.
    注意: LEDパネルボードは、頭上のライトがオフのときにイメージングウィンドウを照らすために動物の前に配置すると最適に機能します。ライトは ~2,400 ルクス (95% の電力) に設定され、冷却温度は 4,000K に設定されました。
  6. Micro-Managerを使用したiOS用のロード設定19,20,21,22
    1. [ライブ]を押すと、カメラの下にマウスが表示され、動物の頭蓋骨がカメラの下に中央に配置されます。「ライブ」ウィンドウを閉じます。
    2. Multi-D Acqを押します。
    3. [Multi-Dimensional Acquisition] ウィンドウで、目的の時点を選択します。
      注: 250 ミリ秒間隔で 750 枚の画像をカウントすることをお勧めします。
    4. 画像を目的のファイルパスと名前のプレフィックスに保存します。
  7. 動物からの金色のピンをヘッドステージコネクタに接続し、次にヘッドステージに接続します。
  8. Intanソフトウェアのロード設定。
      [
    1. ファイル形式の選択] アイコンをクリックし、ポップアップ ウィンドウで [信号タイプ形式ごとに 1 つのファイル] を選択します。これにより、MATLABでさらに使用するために、ファイルが「.dat」として保存されます。
    2. [BW]タブの[Hardware Bandwidth]で、0.13〜500 Hzのアンプ帯域幅を選択します。
    3. [Filter Display Selector] で [WIDE] を選択すると、最も広い範囲の信号がカバーされます。
    4. 保存するファイルパスを選択するには、[ファイル名の選択]アイコンをクリックします。
  9. 電磁インパクターを使用して衝撃を行います.
    注:インパクターの設定は、4 m/sの衝撃速度と5 mmのたわみです。
    1. インパクターをオンにし、3方向トグルをフリックして先端を引っ込めて先端を伸ばすことで、先端が適切に収縮および伸縮することを確認します。動物を先端の下に置く前に、先端を伸ばす必要があります。
    2. 素早く移動して、動物をフォームベッドに置き、ベッドを先端の下にスライドさせます。
    3. インパクターの先端を正中線とブレグマの1mm吻側に合わせます。
    4. インパクターの先端を動物の頭のてっぺんにしっかりと触れるまで下げます。
      注意: 先端を頭に押し込まないでください。
    5. レバーを押してインパクターの先端を引っ込め、インパクトレバーを作動させる前に手動で5mm下げます。
    6. 衝撃からSDが開始されるため、すぐに動物をフォームベッドから取り出し、動物をカメラの下に置き、5秒以内にイメージングします。
  10. iOSイメージングを開始するには、Multi-Dimensional AcquisitionウィンドウでAcquire!をクリックします。SD全体をキャプチャするために4分間の画像。
  11. Intanソフトウェアの[記録]アイコンをクリックして、電気生理学の記録を開始します。
  12. フォームパッドから動物を取り外し、動物がオープンアリーナまたはホームケージで回復するのを待ちます.
    注:皮質ネットワーク機能を回復させるために、電気生理学を少なくとも1時間記録することをお勧めします。.
  13. 録音が完了したら、動物をヘッドステージとコネクターから抜き、動物をケージに戻します。
    注意: 各衝撃と録音セッションの間に24時間かかることをお勧めします。動物は、録音セッション以外でずっと家のケージにとどまることができます。

3. iOS画像の視覚化と定量化

  1. ImageJ19,20,21,22 で、[ファイル] > [インポート] > [イメージ] シーケンスをクリックしてイメージ スタックを開きます。
  2. 画像を手動でスクロールして、動きの欠如やその他のアーティファクトを確認します。
  3. SD のプロットを生成するには、カーソルを使用して正方形を描画して ROI を作成します。
    注: 30 x 30 ピクセルの正方形を使用することをお勧めします。どのような形やサイズでもかまいませんが、ROIのサイズが動物間で変わらないようにしてください。
  4. プロットを作成するには、Image > Stacks>Plot Z-axis Profileをクリックします。新しく作成したグラフで、ライブボタンをクリックします。SDの画像スタックに戻り、グラフにSD曲線が表示されるまでROIを移動します。プロットは、最初の上昇に続いてベースラインを下回り、数分以内にベースラインにゆっくりと戻るSin波のように見えます
    注:プロットは、任意の単位(AU)として、またはベースライン平均として最初のいくつかの画像を使用してパーセントベースラインとして表すことができます。
  5. 生成されたプロットで、[リスト]をクリックして、他のグラフ生成ソフトウェアまたはMatlabでプロットできる値のリストを生成します。
  6. 視覚化するには、Fire>Image Tables > Lookup Tables を使用して、グレースケール画像を ImageJ のルックアップテーブルに変換します。

4. 電気生理学解析

注:Buzsaki研究室の専門知識とMATLABで生成されたコードを、電気生理学データの視覚化と分析に大いに活用することをお勧めします。解析には、機関のアクティベーションコードとBuzsakiラボの「Buzcode」zipファイルをGitHub(https://github.com/buzsakilab/buzcode)からダウンロードしたMATLABをダウンロードする必要があります。

  1. Intan電気生理学ソフトウェアで、エクスポートされた生データが「.dat」形式で保存されていることを確認します。
    注: Matlab は MathWorks の Web サイトからインストールできます。Matlabの購入と使用には、機関または個人のアクティベーションコードが必要です。この解析を実行するには、Matlabでコードを実行した経験が必要です。
  2. Buzaki code bz_LoadBinary 関数を使用して、データを Matlab.
    に読み込みます。 注:例「'data' = bz_LoadBinary('完全なデータファイルパス'、'frequency'、サンプリング周波数、nChannels、チャネル数);
  3. 60 Hzを中心とするノッチフィルタを使用してACノイズをフィルタリングします。
    注: 例 notch_freq = 60;[b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2));filtered_data = filtfilt(b, a, data);
  4. 広がりの脱分極(SD)を分析および視覚化するためのCOSBIDグループの推奨事項に従って、0.5〜100 Hzの範囲のバンドパスフィルターを使用して高周波アクティビティを分離します。
  5. MatLab の pspectrum コマンドを使用して、パワー スペクトログラムを計算します。
  6. 可視化するには、高周波スペクトログラムとパワー スペクトログラムを同じ時間スケールで 1 つの列にプロットします。
    注:プロットから、高周波のうつ病と電力の損失が拡大します。

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結果

図1は、実験セットアップの概略図を示している。記録用頭蓋骨ネジは一次視覚野に配置し、接地電極として頭蓋骨ネジ電極を1本小脳虫部に配置する。頭蓋骨ネジと金ピンは、シアノアクリレート系接着剤と歯科用セメントを用いて頭蓋骨に固定する。衝撃およびイメージングのためのスペースを確保するため、歯科用セメントの使用範囲を頭蓋骨の後方に限定することが極めて重要である。衝撃部位（正中線上に中心を置き、ブレグマから吻側へ約1 mmの位置）を図1に示す。

代表的な内在性光学信号（iOS）画像を図2Aに示す。グレースケール画像は、広延性脱分極（SD）の可視化を強化するためにFireルックアップテーブルを用いて変換されている。iOSにはNAD(P)H、FADH、組織反射などのさまざまな信号が含まれているため、これらの信号の解釈や比較は困難である。シアノアクリレート接着剤のウィンドウを通して太い血管が明確に視認でき（矢印で表示）、図...

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ディスカッション

脱分極の広がりは、外傷性脳損傷 (TBI)、脳卒中、片頭痛1 などのさまざまな疾患モデルにおいて非常に重要です。SDの正確な検出は、軽度の外傷性脳損傷(mTBI)後の急性行動障害および/または神経免疫系の活性化におけるSDの役割を理解するために不可欠です23,24。単一の方法を使用する場合にSDが欠落するリスクを軽減するには、SDを効果的に視覚化して記録するためのマルチメソッドアプローチが必要です。

技術を組み合わせることで、拡散する脱分極 (SD) を確認できますが、各技術には潜在的な落とし穴がある可能性があります。このプロトコルに記載されているイメージング技術は、ほとんどの研究室でアクセスでき、Zepedaと同僚によって詳細に説明されています25。不透明な窓は決定的な画像につながる可能性があるため、頭蓋窓の準備は非常に重要です26<...

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謝辞

この作業は、NIGMS P20GM109089と国防総省のPR200891助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
#00-90 x .118小ねじUSマイクロネジ00.90-118-M-SS-P、アマゾン
0.8mm径ドリルビットPCBドリルビットWYTP21、アマゾン
16-Aヘッドステージインタン C3335
2.1 mm バリ マイクロ ドリルビット ファイン サイエンス ツール19007-21
AC アンプIntanRHD レコーディング システム
C57BL/6J マウス ジャクソン研究所 Jax#000664
CCDカメラMightexTCE-1304-U
延長レンズZeikos ZE-ETN
Ethiqa XR (徐放性ブプレノルフィン)Midwest Veterinary Supply製品番号 267.10000.3
ゴールド コネクタ ピン (メス)A-M Systems520100
ゴールド コネクタ ピン (オス)A-M Systems520200
ImageJ2/FijiImage JNA
Impactor OneLeica39463930
LEDパネルボードSuponL122t
MATLABMathWorks, 機関または個人のアクティベーションコード
医療グレードのシアノアクリレート接着剤MasterBondMB287
Micro-Manager カメラソフトウェア画像 JNA
ネイルドリル/ポリッシャーマカートネイルドリル 電動ネイルヤスリJD700
OmneticコネクタOmneticsA79014-001
RHXデータ収集ソフトウェアIntanNA
ステンレス鋼非コーティングワイヤ(0.005インチ)AMシステム792800
固定装置フレームKopf Intruments1923-B
Teets「コールドキュア」歯科用セメントAMシステム525000、526000
XLRカメラレンズNikonNIKKOR 50mm f/1.8-16

参考文献

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