このプロトコルは、軽度の外傷性脳損傷後の成体マウスにおける脱分極の拡大を確実に検出するためのイメージングと電気生理学の組み合わせを示しています。
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方法論記事
イメージングと電気生理学を組み合わせて、マウスの広がりの脱分極を視覚化および記録する
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
Spreading Depolarizations(SD)は、脳内で発生する大規模なイベントで、灰白質を介した伝播が遅いため、検出されないことがよくあります。SD検出は難しいため、複数の方法を用いて最適に確認します。このプロトコルは、イメージングと電気生理学を組み合わせて、ほとんどのラボが確実かつ容易に採用できる方法でSDを検出する方法を説明しています。SDは、外傷性脳損傷、脳卒中、くも膜下出血、虚血、片頭痛の前兆に続いて発生します。歴史的に、SDはDCアンプを使用して記録されており、高周波活動の遅い細胞外シフトと抑制を解決できます。しかし、DCアンプは慢性的なin vivo記録に使用することはほぼ不可能です。このプロトコルでは、高周波の抑制を確認するためのin vivo電気生理学記録用の一般的なACアンプと、SDの伝播波を検出するために必要な非侵襲的イメージングを採用しています。これらの方法は、脳損傷後のSDの有無を確認するために、ほとんどの実験的アプローチで確実に採用および/または変更することができます。
概要
広がる脱分極(SD)は、外傷性脳損傷(TBI)、脳卒中、くも膜下出血、虚血、片頭痛のオーラ1など、さまざまな神経学的状態に関連しています。SDは、脳卒中およびTBIs2における組織損傷の進行に関与しています。組織喪失の進行の根底にある正確なメカニズムは不明のままです3,4.しかし、SDは、ATP依存性のナトリウム-カリウムポンプの機能がイオン勾配を維持するのに不十分になるため、ニューロンの代謝要求が十分な酸素とグルコースで満たされない場合に発生します。組織喪失におけるSDの役割を理解するためには、科学的知識を進歩させるために不可欠なSDを測定し、研究するための正確な技術が必要です。SDは、実験デザインや機器の制限により検出されないことが多い重要な神経学的イベントです。
損傷の進行における脱分極(SD)の広がりの役割は現在解明されていますが、軽度の外傷性脳損傷(mTBI)におけるその役割は不明のままです。この原稿で説明されている技術を使用した最近の研究では、SDは、明らかな組織損傷や出血がない場合でも、閉じた頭蓋骨のmTBIマウスモデルで開始されることが示されています5,
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プロトコル
すべての手続きは、ニューメキシコ大学の研究所の動物管理および使用委員会(IACUC)に従って行われました。C57BL/6Jマウスは市販の情報源から入手しました。8〜14週の年齢範囲内で、同数の雄マウスと雌マウスを使用しました。すべてのマウスの体重は約20gでした。この研究で使用された動物、試薬、および機器の詳細は、資料表に記載されています。補足ファイル1には、略語のリストが含まれています。
1. イメージングと電気生理学のための頭蓋骨の準備
- 100%酸素中に2%〜3%のイソフルランが入ったイソフルラン誘導ボックスで動物を麻酔し、足のピンチからひるむことなく適切な麻酔の深さを確保します。
- 術前鎮痛薬(徐放性ブプレノルフィン、3.25 mg / kg、SQ)を投与してから、動物を定位固定装置フレームに配置し、麻酔を維持します(2%イソフルラン)。.
- 眼科用軟膏を追加し、体温フィードバック付きの加熱パッドで動物の体温を維持します。
- 切開が行われる頭蓋骨の上の髪を、眼の裂傷からラムダまでの正中線に沿って剃ります。
- 消毒剤と消毒剤のスクラブと溶液で皮膚を滅菌する前に、切り取った髪を取り除きます。70%エタノールで仕上げ、3回繰り返して無菌手術部位を確保します。
- #....
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結果
図1は、実験セットアップの概略図を示している。記録用頭蓋骨ネジは一次視覚野に配置し、接地電極として頭蓋骨ネジ電極を1本小脳虫部に配置する。頭蓋骨ネジと金ピンは、シアノアクリレート系接着剤と歯科用セメントを用いて頭蓋骨に固定する。衝撃およびイメージングのためのスペースを確保するため、歯科用セメントの使用範囲を頭蓋骨の後方に限定することが極めて重要である。衝撃部位（正中線上に中心を置き、ブレグマから吻側へ約1 mmの位置）を図1に示す。
代表的な内在性光学信号（iOS）画像を図2Aに示す。グレースケール画像は、広延性脱分極（SD）の可視化を強化するためにFireルックアップテーブルを用いて変換されている。iOSにはNAD(P)H、FADH、組織反射などのさまざまな信号が含まれているため、これらの信号の解釈や比較は困難である。シアノアクリレート接着剤のウィンドウを通して太い血管が明確に視認でき（矢印で表示）、図.......
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ディスカッション
脱分極の広がりは、外傷性脳損傷 (TBI)、脳卒中、片頭痛1 などのさまざまな疾患モデルにおいて非常に重要です。SDの正確な検出は、軽度の外傷性脳損傷(mTBI)後の急性行動障害および/または神経免疫系の活性化におけるSDの役割を理解するために不可欠です23,24。単一の方法を使用する場合にSDが欠落するリスクを軽減するには、SDを効果的に視覚化して記録するためのマルチメソッドアプローチが必要です。
技術を組み合わせることで、拡散する脱分極 (SD) を確認できますが、各技術には潜在的な落とし穴がある可能性があります。このプロトコルに記載されているイメージング技術は、ほとんどの研究室でアクセスでき、Zepedaと同僚によって詳細に説明されています25。不透明な窓は決定的な画像につながる可能性があるため、頭蓋窓の準備は非常に重要です26<.......
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謝辞
この作業は、NIGMS P20GM109089と国防総省のPR200891助成金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| #00-90 x .118小ねじUS | マイクロネジ | 00.90-118-M-SS-P、アマゾン | |
| 0.8mm径ドリルビット | PCBドリルビット | WYTP21、アマゾン | |
| 16-Aヘッドステージ | インタン | C3335 | |
| 2.1 mm バリ マイクロ ドリル | ビット ファイン サイエンス ツール | 19007-21 | |
| AC アンプ | Intan | RHD レコーディング システム | |
| C57BL/6J マウス | ジャクソン研究所 | Jax#000664 | |
| CCDカメラ | Mightex | TCE-1304-U | |
| 延長レンズ | Zeikos | ZE-ETN | |
| Ethiqa XR (徐放性ブプレノルフィン) | Midwest Veterinary Supply | 製品番号 267.10000.3 | |
| ゴールド コネクタ ピン (メス) | A-M Systems | 520100 | |
| ゴールド コネクタ ピン (オス) | A-M Systems | 520200 | |
| ImageJ2/Fiji | Image J | NA | |
| Impactor One | Leica | 39463930 | |
| LEDパネルボード | Supon | L122t | |
| MATLAB | MathWorks | , 機関または個人のアクティベーションコード | |
| 医療グレードのシアノアクリレート接着剤 | MasterBond | MB287 | |
| Micro-Manager カメラソフトウェア | 画像 J | NA | |
| ネイルドリル/ポリッシャー | マカートネイルドリル 電動ネイルヤスリ | JD700 | |
| Omneticコネクタ | Omnetics | A79014-001 | |
| RHXデータ収集ソフトウェア | Intan | NA | |
| ステンレス鋼非コーティングワイヤ(0.005インチ) | AMシステム | 792800 | |
| 固定装置フレーム | Kopf Intruments | 1923-B | |
| Teets「コールドキュア」歯科用セメント | AMシステム | 525000、526000 | |
| XLRカメラレンズ | Nikon | NIKKOR 50mm f/1.8-16 |
参考文献
- Pietrobon, D., Moskowitz, M. Chaos and commotion in the wake of cortical spreading depression and spreading depolarizations. Nat Rev Neurosci. 15 (6), 379-393 (2014).
- Hartings, J. A., et al. Repetitive cortical spreading depolar....
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再版と許可
