ポリオールベース技術を用いた化粧品用途向けのフェノール化合物および酸化防止剤のマイクロ波支援抽出

今日、美容業界では環境意識への世界的な傾向があり、メーカーは持続可能な代替品を使用して植物成分を抽出するためのグリーンテクノロジーに焦点を当てるようになりました¹。通常、エタノール、メタノール、ヘキサンなどの従来の溶媒は、植物フェノール成分と天然抗酸化物質を抽出するために使用されます²。それにもかかわらず、植物抽出物中の溶媒残留物の存在は、人間の健康に潜在的なリスクをもたらし、特に化粧品への意図された用途に関して、皮膚や眼の炎症を誘発します³。その結果、抽出物からこのような溶媒残留物を除去することは困難であり、このプロセスには時間、エネルギー、および人的資源に多大な投資が必要です⁴。近年、過熱水、イオン液体、深部共晶溶媒、およびバイオ由来溶媒が、グリーン溶媒抽出の有望なアプローチとして浮上しています⁵。しかし、水系プロセスでの製品分離により、その使用は依然として制限されています。これらの課題に対処するために、すぐに使用できる抽出物の開発が実行可能な解決策として浮上しています⁶。

ポリオールは、その優れた極性と環境からの水分を保持する能力があるため、保湿剤として化粧品の配合物によく使用されます⁷。さらに、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール、メチルプロパンジオール、イソペンチルジオール、ペンチレングリコール、1,2-ヘキサンジオール、ヘキシレングリコールなどのポリオールを植物抽出に利用できます。それらは、^{植物抽出8}に使用するための無毒で、生分解性で、環境にやさしく、非反応性で、安全な溶媒と考えられています。さらに、ポリオールは沸点と極性が高いため、マイクロ波支援抽出(MAE)中に発生する熱に耐えることができます⁹。これらのポリオールは、米国食品医薬品局(FDA)によって一般に安全(GRAS)化学物質として認められています。エタノールやメタノールなどの従来の溶媒とは異なり、ポリオールは、その潜在的に有害な影響のために抽出物からの厳密な除去を必要とする場合があり、溶媒除去プロセスに関連するエネルギー、時間、およびコストを最小限に抑えるという利点を提供する¹⁰。これにより、抽出プロセスが合理化されるだけでなく、抽出方法の全体的な効率と持続可能性も向上します。これまでの研究では、 Camellia sinensis の花¹⁰ およびコーヒーパルプ¹¹からの生理活性化合物の抽出において、プロピレングリコールやブチレングリコールなどのポリオールを溶媒として使用しており、植物抽出プロセスにおける持続可能な代替溶媒としての役割に大きな可能性が明らかになっている。したがって、ポリオール-水溶媒システムの継続的な開発と最適化は、グリーンケミストリーと持続可能な産業慣行の大幅な進歩の可能性を秘めています。

一般に、植物に見られる生理活性化合物は二次代謝産物として合成されます。これらの化合物は、テルペンとテルペノイド、アルカロイド、およびフェノール化合物の3つの主要なグループに分類できます¹²。植物から特定の生理活性化合物を単離するために、さまざまな抽出方法がさまざまな条件下で利用されます。植物材料からの生理活性化合物は、従来の技術または非従来の技術のいずれかを使用して抽出できます。従来の方法には、浸軟、還流抽出、および水蒸留が含まれますが、非従来型の方法は、超音波支援抽出、酵素支援抽出、マイクロ波支援抽出(MAE)、パルス電界支援抽出、超臨界流体抽出、および加圧液体抽出¹³で構成されます。これらの従来とは異なる方法は、より安全な溶剤と助剤を利用し、エネルギー効率を改善し、生物活性成分の劣化を防ぎ、環境汚染を減らすことにより、安全性を高めるように設計されています¹⁴。

さらに、MAEは、植物から生理活性化合物を抽出するための洗練されたグリーンテクノロジーの1つです。従来の抽出手順では、かなりの時間、エネルギー、および高温が必要であり、時間の経過とともに熱に敏感な生理活性化合物を劣化させる可能性があります¹³。従来の熱抽出とは対照的に、MAEは、サンプル内に局所的な加熱を発生させ、細胞構造を破壊し、物質移動を促進することにより、生理活性化合物の抽出を促進し、それによって化合物抽出の効率を高めます。熱は、植物成分¹³内の水分子に作用するマイクロ波によって植物細胞内部から伝達される。さらに、MAEは、活性化合物の抽出と分離を改善し、製品の収率を高め、抽出効率を高め、必要な化学物質を減らし、生理活性化合物の破壊を防ぎながら時間とエネルギーを節約するために進歩しました¹⁵。

この研究では、さまざまな種類のポリオールを溶媒として使用したマイクロ波支援抽出(MAE)による植物フェノール化合物と天然抗酸化物質の抽出に焦点を当てています。ポリオールベースのMAE抽出物の総フェノール含有量(TPC)、総フラボノイド含有量(TFC)、および抗酸化活性(DPPH、ABTS、FRAP)が決定されます。さらに、ポリオールベースのMAEは、水やエタノールなどの従来の溶媒を使用してMAEと比較されます。この研究は、化粧品業界での潜在的な用途のために、有害化学物質への依存を減らし、処理時間を短縮し、原材料生産におけるエネルギー消費を最小限に抑えることにより、持続可能性を促進し、天然成分の環境的に持続可能な抽出技術の開発に貢献することが期待されています。

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 実験の準備

1. 植物サンプル調製
   1. 淹れたてのコーヒーシルバースキン(Coffea arabica)を集め、トレイドライヤーで60°Cで72時間¹¹分乾燥させます。
   2. 乾燥したコーヒーシルバースキン(CS)をグラインダーを使用して微粉末に挽き、さらなる分析のために室温で保存します¹¹。
      注:この研究では、新鮮なCS(C.arabica)がタイのチェンライにあるメースアイ地区のバーンドイチャンから収集されました。CSは、籾摺り加工中に得られる副産物で、サクランボが外側の果実層¹⁶を除去するために加工された後、乾燥コーヒー豆から羊皮紙層を除去する。
2. 化学薬品
   1. 実験の溶媒を除き、分析グレードの品質の化学試薬を使用してください。
      注:実験では化粧品グレードの溶媒を使用しました。
   2. MAEによるCSの抽出には、溶媒(水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、イソペンチルジオール、1-2ヘキサンジオール、ペンチレングリコール、メチルプロパンジオール)を使用してください。

2.抽出プロセス

1. サンプルと溶媒の調製
   1. MAE手順用のサンプルと溶媒を、以前に報告されたプロトコル⁹ に従って調製し、いくつかの変更を加えます。
   2. 各溶媒を60 mLを蒸留水で希釈し、容量を100 mLに調整して三重抽出することにより、各溶媒を60%濃度で調製します。
      注意: 水の抽出には100%蒸留水を使用してください。
   3. 0.67 g の CS を秤量し、各抽出溶媒 20 mL と 1:30 の比率で MAE の反応容器 (図 1A) で混合します。
      注:各容器の最大固液量は、2 gのサンプルと20 mLの溶媒です。
   4. 各容器にマグネチックスターラーバーを追加して、サンプル内の熱と溶媒が均一に分布するようにすることで、抽出プロセスの効率を高め、抽出収率を向上させます。
      注:抽出プロセスに非極性溶媒を適用する場合は、マグネチックスターラーバーの代わりにテフロンスターラーバーを使用して、マイクロ波システムを介して効果的な加熱を提供できます。
   5. 各容器を特別な工具(図2)でしっかりと閉じ、すべての容器をMAEチャンバーに入れます(図1B)。
2. マイクロ波支援抽出装置と手順のセットアップ
   1. いくつかの変更を加えた参照プロトコルに従って抽出手順を実行する⁹。
   2. モニター画面を開き、トップバーの ツールボックス アイコンをクリックし、アクセサリセクションで SK eTローター を選択してメソッドを設定します(図3A、B)。
   3. スター ラー セクションをクリックして 20% と入力し、スターラーバーの攪拌速度を選択します(図4A)。
      注:攪拌速度は0%から100%まで選択できます。
   4. ドアロックセクターをクリックし、80°Cを超える温度でアクティブになるように設定します(図4B)。
      注:この設定により、内部温度が80°Cを超えたときにチャンバードアが自動的に閉じられます。
   5. トップバー(図5A)のテーブルアイコンをクリックし、温度勾配(T1)を抽出時間を10分、マイクロ波電力を1800W、温度を120°Cに設定します。
   6. 緑色のライトが表示されるまで スターラー ボタンをクリックして、スターラーをアクティブにします。
   7. ブロワーファンの速度をレベル3(最大)に設定します(図5B)。
   8. 抽出時間を保持するには、抽出時間を15分、マイクロ波電力を1800W、温度を120°Cに設定して、目的の抽出温度(T2)を選択します。
   9. セクション2.2.6および2.2.7に記載されているように、スターラーとファンの速度を設定します(図5A、B)。
      注:最大温度とマイクロ波電力は260°Cと1800Wです。
   10. 画面の左下隅にある 冷却 ボタンをクリックし、 10分間 の時間を選択して、冷却時間を設定します(図6)。
   11. 画面の右上隅にある 保存 アイコンをクリックして、メソッドを保存します(図7A)。
   12. メソッド条件を保存した後、抽出条件グラフが右下隅の再生ボタンで画面に表示されることを確認します(図7B)。
   13. 使用する容器の数を選択して、抽出プロセスを開始します(図7C)。
       注:1回の抽出で最大15個の容器を使用でき、必要な数の容器を使用する場合は、チャンバー内の容器をバランスよく配置してください。
   14. 抽出後、抽出物を4°C、9072 x gで、冷蔵遠心分離機を使用して15分間遠心分離します。
   15. 上清を10 mLのガラス製ピペット(図8)で収集し、-20°Cで冷凍庫に保存してさらに研究します。
       注:植物残渣の粒子サイズと密度に応じて、抽出物はより長い遠心分離時間(20〜30分)を必要とします。

3. フェノール化合物の定量

1. 総フェノール含有量の測定
   1. CS抽出物の総フェノール含有量を、いくつかの修飾を含むプロトコルを参照することにより決定する¹⁷。
   2. 蒸留水で希釈して、サンプルを10倍希釈して調製します。
   3. 希釈したサンプル10 μLを希釈したFolin-Ciocalteu試薬20 μLと混合し、3分間反応させます。
   4. 次に、100μLの7.5%Na₂CO₃ 溶液を96ウェルプレートの各ウェルの混合物に加えます。
   5. 没食子酸の標準濃度範囲( 表1 および 表2を参照)に対して、蒸留水で希釈することにより、異なる濃度を調製します。
   6. これらを20 μLのFolin-Ciocalteu試薬と混合し、3分間反応させます。
   7. 次に、100μLの7.5%Na₂CO₃ 溶液を96ウェルプレートの各ウェルの混合物に加えます。
   8. 反応を室温の暗所で30分間インキュベートします。
   9. マイクロプレートリーダーを使用して、765 nmでの反応溶液の吸光度を測定します(図9A)。
   10. 765 nm での標準試料と吸光度の濃度を使用して、標準試料の検量線をプロットします(図 10A)。
   11. 結果をサンプルの g あたりの没食子酸当量(GAE)の mg として表し、次の式¹⁸ を使用して計算します。
       注:サンプル1gあたりの没食子酸当量(GAE)のmg=[((_A765-c )/ m))(没食子酸換算μg×反応ウェルの総容量(mL)x乾燥サンプルの希釈×重量(1g)x抽出物の結果容量(mL)]/[(各ウェルに添加されたサンプルの量(mL)x乾燥サンプルの実際の重量(g)×μgからmg(1000)への変換係数]
       ここで、c = y 切片、m = 傾き
2. 総フラボノイド含有量の決定
   1. いくつかの変更を加えたプロトコルに従って、CS抽出物の総フラボノイド含有量を決定する¹⁷。
   2. 蒸留水で希釈することにより、サンプルを5倍希釈して調製します。
   3. 希釈したサンプル50 μLを5% NaNO₂ 15 μLに加え、暗所で5分間インキュベートします。
   4. 10% AlCl₃ 溶液15 μLを反応液と混合し、室温で6分間保存します。
   5. 次に、100 μLの1 M NaOH溶液を反応液に加え、さらに10分間インキュベートします。
   6. 510 nmでの混合物の吸光度を測定します(図9B)。
   7. ケルセチン標準液(表3および表4を参照)を15 μLの5% NaNO₂に添加し、暗所で5分間インキュベートすることにより、異なる濃度のケルセチン標準液を調製します(表3および表4を参照)。
   8. 15 μLの10% AlCl₃ 溶液を反応液と混合し、室温で6分間保存します。
   9. 100 μLの1 M NaOH溶液を反応液に加え、さらに10分間インキュベートします。
   10. 510 nm での標準試料の吸光度を測定します(図 9B)。
   11. 標準試料の濃度と 510 nm での吸光度を使用して、標準試料の検量線をプロットします(図 10B)。
   12. 結果をサンプルの g あたりのケルセチン当量(QE)の mg として表し、式¹⁹ で次のように計算します。
       注:サンプル1gあたりのケルセチン当量(QE)のmg=[((A_、510-c )/m))、μgケルセチン当量×反応ウェルの総容量(mL)x希釈×乾燥サンプルの重量(1g)x抽出物の結果容量(mL)]/[(各ウェルに添加されたサンプルの量(mL)x乾燥サンプルの実際の重量(g)×μgからmg(1000)への変換係数]
       ここで、c = y 切片、m = 傾き

4.抗酸化活性の測定

1. 1,1-ジフェニル-2-ピクリル-ヒドラジル(DPPH)ラジカル捕捉アッセイ
   1. いくつかの変更を加えたプロトコルに従って、CS抽出物のDPPHラジカル捕捉活性を決定します¹⁷。
   2. サンプルを蒸留水で希釈することにより、サンプルを10倍に希釈して調製します。
   3. 希釈したサンプル20 μLを0.1 mM DPPH溶液135 μLと混合します。
   4. 135 μL の 0.1 mM DPPH 溶液と混合して、Trolox 標準濃度範囲 ( 表 5 および 6 を参照) の異なる濃度を調製します。
   5. 混合物を室温で暗所で30分間インキュベートします。
   6. 517 nmで得られた結果の吸光度を測定します(図9C)。
   7. 標準試料の濃度と阻害率(%)を使用して、標準試料の検量線をプロットします(図 10C)。
   8. DPPHアッセイの阻害率を次のように計算します。
      抑制率 = [(コントロールの吸光度 − サンプルの吸光度)/コントロールの吸光度] × 100
   9. 結果を、次の式²⁰で計算した、サンプルのgあたりのTrolox等価抗酸化能力のmgとして表します。
      注:サンプル1gあたりのトロロックス当量(TE)のmg=[((%阻害-c)/ m)(μgトロロックス当量)×反応ウェル内の総容量(mL)x乾燥サンプルの希釈×重量(1g)x抽出物の結果容量(mL)]/[(各ウェルに添加されたサンプルの量(mL)x乾燥サンプルの実際の重量(g)×μgからmg(1000)への変換係数]
      ここで、c = y 切片、m = 傾き
2. 2,2′-アジノ-ビス-3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸(ABTS)ラジカル消去法
   1. CS抽出物のABTSラジカル消去活性を、いくつかの変更を加えたリファレンス¹⁷のプロトコルを使用して決定します。
   2. 7 mM ABTSと2.45 mM過硫酸カリウム(1:2)を混合してABTS·+ストック溶液を調製し、室温で16時間暗所でインキュベートします。
   3. 5 mLのABTS·+ストック溶液と100 mLの脱イオン水を混合して、作業溶液を調製します。
   4. 160 μL の ABTS·+ ワーキング溶液を、10 倍希釈サンプルまたは Trolox 標準試料 10 μL と異なる濃度で混合します ( 表 7 および 表 8 を参照)。
   5. 反応を暗所で室温で30分間インキュベートします。
   6. 734 nmでの混合物の吸光度を測定します(図9D)。
   7. 標準試料の濃度と阻害率(%)を使用して、標準検量線をプロットします(図 10D)。
   8. 次の式を使用して、ABTSアッセイの阻害率を計算します。
      % 阻害率 = [(コントロールの吸光度 - サンプルの吸光度) / コントロールの吸光度] × 100。
      1. 結果を、サンプルの g あたりの Trolox 等価抗酸化能力の mg として表し、次の式²¹ を使用して計算します。
         注:サンプル1gあたりのトロロックス当量(TE)のmg=[((%阻害-c)/ m))μgトロロックス当量×反応ウェルの総容量(mL)x乾燥サンプルの希釈×重量(1g)x抽出物の結果容量(mL)]/[(各ウェルに添加されたサンプルの量(mL)x乾燥サンプルの実際の重量(g)×μgからmg(1000)への変換係数]
         ここで、c = y 切片、m = 傾き
3. 鉄還元酸化防止剤パワーアッセイ(FRAP)
   1. CS抽出物の鉄還元抗酸化活性を、いくつかの変更を加えたプロトコルに従って決定します¹⁷。
   2. 40 mM HCl 中の 10 mM TPTZ 溶液と 20 mM FeCl_{3.6H 2}O 溶液を 10:1:1 の比率で混合した pH 3.6 の 30 mM アセテート緩衝液を使用して FRAP 試薬を調製します。
   3. 必要になるまで、FRAP試薬を琥珀色のボトルに入れます。
      注:FRAP試薬が茶色であることを確認してください。金属イオンやその他の反応性化合物で汚染されると、試薬は紫色に変わり、廃棄する必要があります。調製したばかりの試薬のみを使用してください。
   4. サンプルを蒸留水で希釈することにより、サンプルを5倍に希釈して調製します。
   5. 希釈したサンプル10 μLまたはFeSO_{4.7H 2}Oの20 μLを異なる標準濃度(表9 および 表10)でFRAP溶液180 μLに加えます。
   6. 反応を室温で4分間インキュベートします。
   7. 593 nmでの混合物の吸光度を評価します(図9E)。
   8. 593 nm での標準試料と吸光度の濃度を使用して、標準試料の検量線をプロットします(図 10E)。
   9. 結果をサンプルのgあたりのFeSO4のmgとして表し、次の式²¹を使用して計算します。
      注:mg FeSO₄ 相当量(Fe(II)E)/gサンプル= [((A₅₉₃ - c)/ m)) μg FeSO₄ 相当量 × 反応ウェルの総容量(mL)×希釈×乾燥サンプルの重量(1 g)×抽出物の結果容量(mL)]/[(各ウェルに添加されたサンプルの量(mL)×乾燥サンプルの実際の重量(g)×μgからmg(1000)への変換係数]
      ここで、c = y 切片、m = 傾き
4. 各サンプルのすべてのアッセイ(TPC、TFC、DPPH、ABTS、FRAP)を3回に分けて実施します。この研究では、ほとんどのアッセイで水がブランクとして使用されましたが、DPPHではエタノールがバックグラウンド吸光度に対処するためのブランクとして機能しました。

5. 統計分析

1. SPSSソフトウェアを使用して、実験データの統計分析を実行します。
2. Shapiro-Wilk 検定を使用して正規性検定を実施します。
3. ポリオールベースのMAE CS抽出物と従来の溶媒ベースのMAE CS抽出物の生理活性物質と抗酸化活性を、一元配置分散分析とDuncanのマルチレンジテストを使用して比較します。
4. すべてのデータを平均± SD(n = 3)として表し、 p < 0.05 の有意水準を定義します。

総フェノール含有量、総フラボノイド含有量、DPPH、FRAP、およびABTS抗酸化アッセイに対するポリオール溶媒および従来型溶媒の影響
溶媒の極性は、植物からの生理活性物質の抽出効率を改善するために、標的活性分子の極性と一致するべきである22。各種溶媒(水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール、メチルプロパンジオール、イソペンチルジオール、ペンチレングリコール、1,2-ヘキサンジオール、ヘキシレングリコール)を用いて、MAEコーヒーシルバースキン抽出物の生理活性や抗酸化活性への影響を評価しました。

ポリオール溶媒と従来型溶媒が総フェノール含有量に及ぼす影響
異なる溶媒を用いた各抽出物の総フェノール含有量を分析しました。フェノール含有量が最も高かったのは、水性 1,2-ヘキサンジオールを含むサンプル(52.0 ± 3.0 mg GAE/g サンプル)で得られ、TPC が最も低かったのは水抽出サンプル(31.4 ± 4.3 mg GAE/g サンプル)で明らかになり、これらの値は他のすべての条件の値と有意に異なっていました。ペンチレングリコール水溶液を含むサンプルは 2 番目に高い TPC 値を示し、次いでブチレングリコール水溶液、メチルプロパンジオール、およびその他の溶媒系サンプルを示しました(図 11A)。従来の溶媒(水および水系エタノール系)とポリオール系溶媒との比較では、TPC値に大きな差が見られます(p < 0.05)。

ポリオール溶媒と従来型溶媒が総フラボノイド含有量に及ぼす影響
異なる溶媒を使用した各抽出の総フラボノイド含有量を分析しました。フラボノイド含有量が最も高かったのは、水性-1,2-ヘキサンジオール水溶液(20.0 ± 1.7 mg QE/g サンプル)のサンプルで得られ、他のすべての抽出物と有意な差が見られました。イソペンチジオール水溶液を含むサンプルは、最も低いTFC値(8.8 ± 0.7 mg QE/gサンプル)を示し、これはメチルプロパンジオール水溶液およびエタノール水抽出物と有意差がありませんでした。さらに、2番目に高いTFC値は、ペンチレングリコール水溶液を含むサンプルで見られ、次いでヘキシレングリコール水溶液、プロピレングリコール水溶液、ブチレングリコール水溶液、グリセリン水グリセリンがそれに続きました(図11B)。

ポリオール溶媒および従来型溶媒が抗酸化アッセイに及ぼす影響
ポリオールと従来の溶媒を使用した抽出物の抗酸化活性は、DPPH、ABTS、およびFRAPアッセイを使用して評価されました。DPPH アッセイの最高値は、ヘキシレングリコール水溶液を含むサンプル(13.6 ± 0.3 mg TE/g サンプル)で測定され、エタノール水溶液を含むサンプル(4.5 ± 0.2 mg GAE/g サンプル)で最も低い値を測定し、これらの値は他の抽出物と有意に異なりました(p < 0.05)。2番目に高いDPPH値は、水性-1,2-ヘキサンジオールを含むサンプルで観察され、次いでペンチレングリコール水溶液、水性メチルプロパンジオール、およびその他の溶媒系で観察されました(図11C)。

ABTS 値の最高値は、ペンチレングリコール水溶液を含むサンプル(8.2 ± 0.1 mg TE/g サンプル)で測定され、最も低い ABTS 値は水を含むサンプル(5.6 ± 0.04 mg GAE/g サンプル)で測定され、これらの値は他の抽出物と有意に異なりました(p < 0.05)。2番目に高いABTS値は、ブチレングリコール水溶液と1,2-ヘキサンジオール水溶液で検出され、次いでグリセリン水溶液、メチルプロパンジオール水溶液、およびその他の溶媒系のサンプルが検出されました(図11D)。

最も高い FRAP 値は、ヘキシレングリコール水溶液を含むサンプル(21.1 ± 1.3 mg Fe (II) E/g サンプル)、水抽出サンプルで最も低い (11.5 ± 0.2 Fe (II) E/g サンプル) で観察され、これらの値は残りの溶媒で有意に異なりました (p < 0.05)。さらに、2番目に高いFRAP値は、ペンチレングリコール水溶液を含むサンプルで見られ、次いでブチレングリコール水溶液、グリセリン水系、およびその他の溶媒系でした(図11E)。

サンプルの抗酸化活性を従来の溶媒(水およびエタノール水)と比較すると、ポリオールを含むサンプルは、すべての抗酸化アッセイ(DDPPH、ABTS、FRAP)で有意に高い抗酸化活性を示しました（p < 0.05)。

図1:実験容器とMAEチャンバーでの反応。 (A)抽出前に、テフロン容器の白い層間容器にサンプルと溶媒を添加します。(B)各容器は、抽出を開始する前にマイクロ波チャンバー内に置かれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:反応容器を閉じるための特別なツール。 テフロン容器にサンプルと溶媒を加えた後、容器の上部に蓋をして容器ホルダーに入れ、工具でしっかりと固定します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:抽出方法(A)抽出方法、方法セクションを入力して作成。(B)SK eTアクセサリーはMAEプロセスに適用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:攪拌速度とドアロック機能の設定(A)各容器内のマグネチックスターラーバーは、攪拌速度を選択することで作動させることができます。(B)ドアロック機能により温度が制限され、抽出後にチャンバーを開くことができます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:抽出条件の設定。 (A)テーブルアイコンを入力し、時間、温度、マイクロ波電力などの抽出条件を設定します。(B)スターラーボタンを開き、ブロワー速度を選択します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:冷却時間の設定。 冷却時間を適用してMAEチャンバー内の温度を下げます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:抽出プロセスの開始 (A)抽出用に作成したメソッドの保存(B)再生アイコンをクリックして、抽出プロセスを開始します。(C)抽出を開始する容器の数を選択します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:MAEを使用して抽出した後の最終抽出物の写真。 遠心分離後の上清の入手。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:抽出物のTPC、TFC、DPPH捕捉活性、ABTS捕捉活性、およびFRAPアッセイを測定するための96ウェルプレート。 (A)没食子酸標準プレートのTPCを、濃度2.5〜75μg/mLおよびサンプル抽出物から決定します。(B)2.5〜50μg/mLの濃度からケルセチン標準プレートのTFCを決定し、サンプル抽出物を測定するためのTFCアッセイ。(C)0.25〜12.5μg / mLの濃度からTrolox標準プレートのDPPH捕捉活性を測定し、サンプル抽出物のDPPH捕捉活性検出プレート。(D)0.25-5 μg/mL の濃度とサンプル抽出物の ABTS 掃気活性検出プレートからの Trolox 標準プレートの ABTS 掃気活性の測定。(E)0.25〜10μg/ mLの濃度からのFeSO4標準プレートのFRAPアッセイとサンプル抽出物のFRAPアッセイ検出プレートの決定。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 10:TPC、TFC、DPPH スカベンジング活性、ABTS スカベンジング活性、および FRAP アッセイの標準検量線。 (A)没食子酸標準試料の濃度と A765 での吸光度によってプロットされた TPC を決定するための標準曲線。(B)A510におけるケルセチン標準試料と吸光度の濃度によってプロットされたTFCを決定するための標準曲線。(C)DPPH捕捉活性を決定するための標準曲線(Trolox標準の濃度と阻害率によってプロット)。(D)ABTS 掃気活性を決定するための標準曲線を、Trolox 標準の濃度と % 阻害によってプロットしたものです。(E)A593における硫酸第一鉄標準試料の濃度と吸光度によってプロットされた、FRAPアッセイを測定するための標準曲線。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図11:コーヒーシルバースキンのMAEにおけるTPC、TFC、DPPH清掃活性、ABTS清掃活性、およびFRAPアッセイに対する溶媒タイプの影響。(B)総フラボノイド含有量に対する溶媒の種類の影響。(C)DPPH掃気活性に対する溶剤の種類の影響。(D)ABTSスカベンジング活性に対する溶剤タイプの影響。(E)FRAPアッセイに対する溶媒の種類の影響。値は、平均 ± SD (n = 3) として示されます。上付き文字が異なる値は、統計的に有意な差を表します (p < 0.05)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:没食子酸標準曲線の調製。 96ウェルプレートに2.5-75 μg/mLの標準濃度範囲を調製します。B = ブランク、1-7 = 96 ウェルプレート上のウェル数。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:没食子酸標準の最終濃度計算。 2.5-75 μg/mLの標準濃度範囲を調製します。没食子酸の最終濃度(μg/mL)は、それに応じて計算されます。最終濃度(μg / mL)=(初期濃度(mg / mL)×初期容量(μL)/最終容量(μL))×(1000μg / 1mg)。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表3:ケルセチン標準曲線の調製。 96ウェルプレートで2.5-50 μg/mLの標準濃度範囲を調製します。B = ブランク、1-7 = 96 ウェルプレート上のウェル数。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表4:ケルセチン標準の最終濃度計算表。 2.5-50 μg/mLの標準濃度範囲を調製します。それに応じて、ケルセチンの最終濃度(μg/mL)が計算されます。最終濃度(μg/mL)=(初期濃度(mg/mL)×初期容量(μL)/最終容量(μL))×(1000μg/1mg)。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表5:0.25〜12.5μg/ mLの濃度範囲でのTrolox標準曲線調製。 96ウェルプレートで0.25〜12.5μg/mLの標準濃度範囲を調製します。B = ブランク、C = コントロール、1-7 = 96 ウェルプレート上のウェル数。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表6:DPPHアッセイのTrolox標準液の最終濃度計算。 Troloxの最終濃度(μg/mL)を含む0.25-12.5μg/mLの標準濃度範囲を調製します。最終濃度(μg/mL)=(初期濃度(mg/mL)×初期容量(μL)/最終容量(μL))×(1000μg/1mg)。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表7:0.25-5 μg/mLの濃度範囲でのTrolox標準曲線調製。 96ウェルプレートに0.25-5 μg/mLのストック標準濃度範囲を調製します。B = ブランク、C = コントロール、1-7 = 96 ウェルプレート上のウェル数。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表8:ABTSアッセイのTrolox標準の最終濃度計算。 Troloxの最終濃度(μg/mL)を含む0.25-5μg/mLの標準濃度範囲を調製します。最終濃度(μg/mL)=(初期濃度(mg/mL)×初期容量(μL)/最終容量(μL))×(1000μg/1mg)。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表9:FeSO4標準の最終濃度計算表。FeSO4の最終濃度(μg/mL)を含む、2.5-100 μg/mLの標準濃度範囲の調製。最終濃度(μg/mL)=(初期濃度(mg/mL)×初期容量(μL)/最終容量(μL))×(1000μg/1mg)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表10:FeSO4 標準曲線の準備。 96ウェルプレートに0.25-10 μg/mLの標準濃度範囲を調製します。B = 空白。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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