方法論記事

レチニリデンタンパク質の生成におけるビタミンA膜受容体およびオプシンタンパク質とそれらのリガンドとの相互作用を研究するための方法論

DOI：

10.3791/67036

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2024年10月4日

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1Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences, University of Minnesota, 2High Throughput Screening Laboratory, Institute for Therapeutics Discovery & Development, University of Minnesota

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、ビタミンA膜受容体および光受容体オプシンとそれぞれの生理的リガンドとのタンパク質-リガンド相互作用を研究するための2つの定量的手法について説明します。

要約

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食事性ビタミンA/オールトランス レチノール(ROL)の全身への分布は、末梢組織のレチノイド機能を維持し、視覚機能のためのレチニリデンタンパク質を生成するために重要です。RBP4-ROLは、ROLと血液中に存在するレチノール結合タンパク質4(RBP4)との複合体です。肝臓のレチノール結合タンパク質4受容体2(RBPR2)と眼のレチノイン酸6レチノール(STRA6)による受容体の2つの膜受容体は、循環器系RBP4に結合し、このメカニズムはROLを細胞に取り込むために重要です。レチノイド恒常性に対するビタミンA受容体の生理学的機能を理解するためには、受容体-リガンド動態を調べる方法を確立することが不可欠です。Surface Plasmon Resonance(SPR)アッセイを用いて、ビタミンA膜受容体とその生理的リガンドRBP4との結合親和性および速度論的パラメータを解析することができます。

これらの方法論は、ビタミンA欠乏症の病態を理解するために重要なRBPR2およびSTRA6のRBP4結合モチーフの新しい構造的および生化学的情報を明らかにすることができます。眼では、内在化されたROLは、光受容体のオプシンに結合してレチニリデンタンパク質であるロドプシンを形成する視覚発色団である11-シスレチナールに代謝されます。光の吸光度は、11-シスレチナールのシスからトランスへの異性化を引き起こし、ロドプシンの立体配座変化とそれに続く光伝達カスケードの活性化を誘導します。血清および眼のROLの濃度の低下は、レチニリデンタンパク質の形成に影響を与える可能性があり、その結果、ロドプシンの誤局在化、アポタンパク質オプシンの蓄積、夜盲症、および視細胞の外側セグメントの変性を引き起こし、網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障につながる可能性があります。

したがって、網膜内のGタンパク質共役受容体オプシン-11-シス 網膜複合体を定量するための分光光度法は、上記の病理学的状態における網膜細胞変性のメカニズムを理解するために重要です。これらの包括的な方法論により、研究者は、ヒトの視覚機能を維持するために重要な光受容体のレチニリデンタンパク質濃度の生成と維持に重要な全身および眼のレチノイド恒常性を維持するための食事性ビタミンA供給をより適切に評価できるようになります。

概要

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食事から得られるビタミンA/オールトランスレチノール/ROLは、視覚機能に重要な役割を果たす成分です1,2。食性ビタミンAの代謝産物である発色団11-シスレチナールは、Gタンパク質共役受容体(GPCR)オプシンに結合して、光受容体でレチニリデンタンパク質であるロドプシンを生成します。光が眼に当たると、ロドプシンの構成は、その11-シス-レチナール成分がオールトランス-レチナールに変換されることで根本的な変化を遂げます。この配置変化は、桿体視細胞内で光伝達カスケードを引き起こし、光を電気信号に変換し、視神経3,4,5,6,7,8,9,10を介して脳内の視覚野に伝達される.血清および眼のROLの濃度の低下は、レチニリデンタンパク質の形成に影響を与える可能性があり、それが次にオプシンの誤局在、アポタンパク質オプシンの蓄積、夜盲症、および光受容体OS変性を引き起こし、網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障を引き起こし、失明を引き起こす可能性があります3,10。

オールトランスレチノールは、食事性ビタミンAの基本的な輸送形態であり、すべての機能性レチノイドと食事性ビタミンA代謝産物が由来する源です。肝臓は、食事中のビタミンAを貯蔵するための主要な器官として機能します。肝臓のレチノールは、レチノール結合タンパク質4(RBP4)との複合体として血清を介して輸送されます。RBP4は、主に肝臓で発現し、レチノール基質およびトランスサイレチン(TTR)とホロ複合体を形成し、トランスサイレチン(TTR)は循環に入ります11,12,13,14,15,16,17。1970年代にRBP4の細胞表面受容体が報告されたことで、膜輸送タンパク質がレチノイドの細胞内外への輸送を助けるという仮説が立てられました。RBP4結合レチノール(RBP4-ROL)の細胞表面受容体は、眼の網膜色素上皮(RPE)においてレチノイン酸6レチノール(STRA6)によってSTimulatedと同定されました。STRA6は、循環中のホロ-RBP4複合体に結合し、RBP4結合レチノールをRPEを横切ってシャトルして、光受容体18,19によって利用される。STRA6の変異は、眼のROL濃度の低下に関連する無数の疾患や表現型につながる可能性があります。発生中のSTRA6変異は、無眼球症、小眼球症、およびマシュー・ウッド症候群20,21,22,23,24,25,26,27に関連する表現型と重複するその他の非眼症状を引き起こす可能性があります。STRA6は、眼のRPEなど、さまざまな臓器や組織で発現しますが、すべての組織で発現するわけではありません26,27。レチノイドの貯蔵の主要な部位は肝臓ですが、STRA6は肝臓では発現しません。

Alapattたちは、レチノール結合タンパク質4受容体2(RBPR2)がRBP4に高い親和性で結合し、RPE28のSTRA6と同様に、肝臓でのRBP4結合レチノールの取り込みに関与していることを発見しました。RBPR2は、STRA6と構造的相同性を共有することが報告されています29,30,31。RBP4は、RBPR2とSTRA6の間で部分的に保存されたアミノ酸結合ドメインであるRBPR2上の残基S294、Y295、およびL296に結合することが提案されている29,30,31。これらの研究から、1つ以上の細胞外結合残基/ドメインを含むSTRA6やRBPR2などのビタミンA膜受容体は、循環RBP4-ROLと相互作用することが提案されています。したがって、膜受容体は、肝臓や眼などの標的組織へのROLの内在化のために、循環RBP4への受容体結合に重要な役割を果たします。

この研究の最初の部分では、表面プラズモン共鳴(SPR)を利用して、2つのビタミンA膜受容体(RBPR2およびSTRA6)とそれらの生理的リガンドRBP4との相互作用を調査しました31。タンパク質のリガンド複合体への結合親和性および会合/解離速度は、SPRを用いてリアルタイムで測定することができる。この方法論は、ビタミンA欠乏症の病理学的状態を理解するために重要なRBPR2およびSTRA6のRBP4結合モチーフに関する重要な速度論的、構造的、および生化学的情報を提供することを目的としていました31,32。上述したように、循環ROLは、STRA6を介してRPEに内在化され、発色団11-cisレチナールを生成し、この発色団はオプシンに結合して光受容体33においてレチニリデンタンパク質であるロドプシンを生成する。我々は、眼鏡光度法を用いて、網膜色素変性症またはレーバー先天性黒内障眼の病理状態におけるレチニリデンタンパク質、ロドプシンの減少メカニズムを理解するために重要なマウス網膜溶解物中のGPCR-オプシンとそのリガンド11-cis網膜複合体を定量化した34。一般に、これらのプロトコルは、全身および眼のビタミンA恒常性に影響を与える変異型RBP4、STRA6、またはRBPR2の生理学的影響、または変異型ロドプシンまたはレチノイドサイクルタンパク質が視覚機能に与える影響をin vitroで研究するために適用できます35,36。

プロトコル

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1. 表面プラズモン共鳴(SPR)法

  1. マウスRBP4タンパク質の調製と精製
    1. 完全長マウスRBP4 (msRBP4) cDNA (NCBI Reference Sequence: NM_001159487.1) を作製するためのプライマーを設計します。 msRBP4 cDNAをpET28a Hisタグカナマイシン耐性発現ベクターにクローニングし、BL-21 DE3細胞で発現させます(材料表)。
    2. BL-21 DE3コンピテントセル(製造元のプロトコルによる)をライゲーションされたmsRBP4-pET28aベクターで形質転換し、次にカナマイシン50 μg/mL30,37を含むLuria-Bertani(LB)ブロス寒天プレートにプレート化します。プレートをインキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、翌日陽性コロニーをスクリーニングします。
    3. 1つのコロニーを選択し、カナマイシン50 μg/mLを含む5 mLのLBブロスで37°Cで一晩インキュベートします。
    4. カナマイシン50 μg/mLを含む500 mLのLBブロスでの二次培養には、1%容量の一次培養物(ステップ1.1.3から)を使用し、37°Cで3〜4時間インキュベートします。分光光度計を使用して光学濃度を確認します。理想的には、OD値が0.6〜1の場合に続行し、24°Cで0.5 mM IPTGで一晩中タンパク質発現を誘導します。
    5. 0.1-1 mMおよび16-30°Cの温度範囲の複数のIPTG濃度を使用して、 msRBP4の発現と安定性を最適化します。
    6. 培養物(ステップ1.1.5から)を16,000 × g で10分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを氷上に保ちます。
    7. 溶解バッファー(50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1% (v/v) Triton X-100、10% Glycerol、0.5 mM PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤[pH 8.0])でペレットをホモジナイズします。250ワットの出力と40-50%の20kHz出力周波数のホモジナイザーを使用して、15秒のONサイクルと30秒のOFFサイクルでライセートを超音波処理します。5回繰り返します。
    8. 細胞破片と未溶解細胞を、16,000 × g で20分間遠心分離して除去します。ライセートの上清を緩衝液平衡ニッケルNTAカラムに通します。
    9. カラムを 30 mM イミダゾールを含む溶解バッファー(ステップ 1.1.8 から)で洗浄します。
    10. フラクションでは、250 mMイミダゾールを含むバッファーを使用して、結合した msRBP4タンパク質を溶出します。溶出した画分を実行し、メタノール:水:酢酸(45:45:10)溶液中のCoomassie Brilliant Blue R-250で染色した12% SDSポリアクリルアミドゲルでタンパク質量を視覚的にモニターし、クーマシー染色のない溶液でメタノール:水:酢酸(45:45:10)で染色を解消します。
    11. 未使用のフラクションをプールし、プールしたフラクションを10 kDa MWCOの10K透析カセットで透析します。
    12. 12% SDS-PAGEゲルで透析した画分の品質を評価し、タンパク質濃度を定量します。
      注:SPR解析ではApo-RBP4タンパク質を使用しました。holo-RBP4(RBP4-レチノール)の生成については、他の場所で公開されている詳細なプロトコル36,37を参照してください。
  2. RBP4によるRBPR2およびSTRA6ペプチドの構造と相互作用の初期検証
    1. トリプトファン蛍光アッセイ
      1. オンラインタンパク質組成解析ツール(https://web.expasy.org/protparam/)を使用し、アミノ酸配列を1文字のコードに貼り付けて、組換えRBP4タンパク質とRBPR2およびSTRA6の個々のペプチドの構造組成を評価し、個々のペプチドおよびタンパク質のトリプトファンアミノ酸残基を決定します(材料の表)。
      2. compute parametersボタンをクリックして、トリプトファン(Trp)残基のアミノ酸組成を評価します。
        注:トリプトファン残基は、分析対象の個々のペプチドまたはタンパク質に存在している必要があります。
      3. 個々のRBPR2およびSTRA6ペプチドをさまざまなマイクロモル濃度で希釈し、96ウェルプレートで3 μg msRBP4と室温で5分間個別にインキュベートします。290 nmで混合物を励起し、300 nmから400 nmの波長までの発光をスキャンします。
      4. ブランク(バッファーのみ、ペプチド、タンパク質なし)およびペプチド制御条件(タンパク質なし)でデータを正規化し、プロットします。
        注:低濃度から高濃度のペプチドへの曝露によるトリプトファン蛍光の増加は、2つの個々のペプチドとRBP4タンパク質との間の正の相互作用を示唆しています。
    2. 円二色性(CD)分光法
      1. 個々のペプチドと組換えRBP4タンパク質を1x PBSバッファー、pH 7.0で希釈します。品質チェックには、以下に説明するように、さまざまな濃度のRBPR2およびSTRA6ペプチドと0.1〜10 μg/mLのRBP4タンパク質を使用してください。
      2. 0.1 cmの光路長キュベットに希釈したペプチドとタンパク質を個々に添加し、CD分光光度計(195-250 nm)を用いてCD吸光度/楕円率を測定します。次の式を使用して、平均残基楕円率 (θ) を計算します。
        [v] = (S × mRw)/(10cl)
        S は CD 信号を mθ で表します。mRw は平均残留質量を表します。cはタンパク質の濃度をmg / mLで表します。L はパスの長さを cm で表します。
      3. BeStSel Secondary Structure Analysis to Protein Fold Prediction by CD Spectroscopy (https://bestsel.elte.hu) を使用して、分子構造の変化率を計算します。
        注:二次構造は、相互作用研究と相互作用の結果にとって重要な適切な折り畳みと保存された確認を示しています。ドメインの予測構造を検査し、相互作用の研究をさらに進めます。

2. ビタミンA膜受容体(RBPR2およびSTRA6)とその生理的リガンドRBP4との結合親和性と速度論的パラメータを決定するためのSPR解析

  1. CM5チップ表面セットアップでのRBP4の固定化には、金表面に~100 nmのサイズに拡張されたカルボキシメチルデキストランリンカーを共有結合して取り付けたSPRセンサーチップを使用します。1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)の存在下では、 N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)は、チップ表面のカルボキシル基を N-ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換し、アミノ酸やタンパク質のアミン基と自発的に反応して、リガンドをチップの表面に共有結合させます(材料表)。
    1. 精製したmsRBP4タンパク質をセンサーチップに固定化します(図1および図2)。ソフトウェアの[実行]メニューで、[ウィザード]を選択し、固定化オプションを続行します。リガンド(ステップ1.1で得られたmsRBP4タンパク質)を固定化バッファー(10 mM酢酸ナトリウムバッファー、pH 5.0)で10 μg/mL(リガンド4 μL+バッファー396 μL)に希釈し、カップリング試薬をバイアルに分注します。ソフトウェアコントロールから固定化セットアップウィザードウィンドウを開き、CM5チップを選択し、フローセル2を固定化し、キネティックスタディで30RUのRmaxを達成するための1,200応答ユニット(RU)のターゲットレベルを選択します。名前に「RBP4」と入力し、[次へ] をクリックします。
      注:オプション:ランニングバッファーPBST(0.05% Tween 20界面活性剤溶液を含むリン酸緩衝生理食塩水)によるプライミングが以前に行われた場合、Prime before runオプションの[System Preparations]ダイアログボックスは必要ありません。
    2. 「ラック位置」ダイアログボックスで、「イジェクトラック」をクリックします。ラックに取り、各試薬に割り当てられた容量のバイアルを置きます:156μLのms RBP4、177 μLのエタノールアミン、89 μLのEDC、89 μLのNHS、および空のバイアル。サンプルバイアルが入ったラックを挿入し、[OK]と[次へ]をクリックします。
    3. 「 Prepare Run Protocol 」ダイアログで、「 Start」および「Save」をクリックします。
  2. RBPR2 および STRA6 ペプチド速度論的アッセイのセットアップ
    1. マウスRBPR2、変異型RBPR2、およびSTRA6ペプチド(以前に化学合成され、材料表に記載されている31)を0.8〜26.6μMの範囲のランニングバッファーで段階希釈します。
    2. 制御ソフトウェアを開き、Kinetics/Affinityウィザードを選択します。[ファイル] |テンプレートを開き、Kinetics/Affinityを選択します。注入シーケンスダイアログの流路2-1(フローセル2をアクティブ、フローセル1を基準)を入力し、チップタイプCM5にチェックを入れて、次へをクリックします。セットアップ ダイアログで、[スタートアップ サイクルの実行] をオンにし、「Solution: buffer and cycles:」と入力して、[次へ] をクリックします。
    3. 注入パラメータダイアログで、サンプルパラメータの値を入力します:接触時間:120秒、流量30μL/分、解離時間300秒。再生パラメータの場合:再生溶液名:Glycine-HCl(pH 2.5)、接触時間:30秒、流量:30μL/minを入力し、次へをクリックします。
    4. サンプルダイアログで、ペプチドの名前、分子量、濃度を入力し、[次へ]をクリックします。[Rack position]ダイアログで、希釈したペプチドを、さまざまな濃度の 1 から 100 μM の ~120 μL サンプルと ~230 μL のバッファー、~120 μL のバッファー、~1,000 μL のグリシン (pH 2.5) としてラック上の位置に割り当てます。イジェクトラックをクリックし、すべてのバイアルを挿入します。[Next] をクリックし、[Prepare Run Protocol] ダイアログで [Start] をクリックし、ファイル名を入力して [Save] をクリックします (図 2)。
    5. ソフトウェアで、[ スタート]メニュー をクリックし、[ 評価]を選択します。ソフトウェアで ファイルを開き 、ドロップダウン選択メニューからFc2-1を選択して、 msRBP4および変異型 msRBPR2および msSTRA6ペプチドの会合および解離フェーズの参照細胞ブランク減算アクティブセンサーグラムを分析します。
    6. ドロップダウンの [Kinetics/Affinity ] ボタンをクリックし、[ Surface bound] を選択します。 をクリックしてSelect Curves ダイアログを開き、 include column in table にチェックを入れ、 Nextをクリックします。 データダイアログ を選択して、空白から減算されたセンサーグラムを表示します。 KineticsとAffinityをクリックし、デフォルトのパラメータをそのままにして、カーブフィットの フィット オプションをクリックします。 「レポート 」タブで、平衡解離定数Kd およびKa or Kon association rateおよびKd or Koff dissociation rateを確認します。Kineticsデータセンサーグラムをタブ区切り形式で保存.txt、その値を使用してグラフをプロットします(図3)。
    7. 親和性速度論定数Kd (平衡状態で受容体の半分に結合するリガンド濃度)を決定するには、ソフトウェアで使用される評価からXYプロットに生成された.txt形式のファイルにデータ列をコピーして貼り付けます。 「分析 」と 「非線形回帰 (カーブ・フィット)」をクリックし、 データ列を確認して 「OK」をクリックします。 パラメータ ダイアログで、 Binding saturation と One site Specific binding fitting model を次の式でクリックします:
      Y = (Bmax*X)/(Kd + X)
      ここで、Bmaxは結合部位の最大数(Response Unit)、Xはペプチドの濃度、Yは結合(Response Unit)です(図3)。

3. レチナールライセート中のGPCR-11- cis 網膜タンパク質複合体(レチニリデンタンパク質ロドプシン)を定量するための分光光度法

  1. 成体WT-C57BL/6Jマウスからなる所定のマウス群を暗室に搬送します。
  2. マウスを一晩で12〜16時間暗順応させ、赤色光の下でマウスを安楽死チャンバーに置き、レギュレーターのCO2 ガスバルブを5 L / minに~5分間開きます。首と尻尾を後ろに引っ張って圧力をかけ、死を確実にします(頸部脱臼)。
  3. 眼球をエヌクリーし、20 mMビストリスプロパン(1,3-ビス(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ)プロパンを含む氷冷緩衝液で眼球を均質化します。BTP) pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、およびプロテアーゼ阻害剤(材料表)を配合しています。
  4. ホモジネートを16000 x g 、4°Cで15分間遠心分離し、水溶性細胞質タンパク質を含む上清を廃棄します。20 mM n-ドデシル-β-d-マルトシド(DDM)、20 mM ビストリスプロパン(BTP)、pH 7.4、100 mM NaCl、1 mM EDTAを含むバッファーにペレット化したメンブレンとメンブレンタンパク質を再懸濁し、可溶化し、プロテアーゼ阻害剤を添加したバッファーを回転プラットホーム上で4°Cで1時間。
  5. 再溶解したメンブレン画分を1時間、16000 x g、4°Cで遠心分離します。 上清を30 μLのRho 1D4抗体ビーズと混合し、回転プラットホーム上で4°Cで1時間インキュベートします。
  6. 磁気スタンドを使用して、ビーズでプルダウンを分離し、上清を捨て、バッファー 20 mM ビストリスプロパン (BTP) pH 7.4、500 mM NaCl、および 2 mM DDM でビーズを洗浄します。
  7. ロドプシンタンパク質を溶出するには、バッファー 20 mM ビストリスプロパン (BTP) pH 7.4、100 mM NaCl、0.2 mg/mL 1D4 ペプチド (-TETSQVAPA) を含む 2 mM DDM を使用して室温で 5 〜 10 分間インキュベートします (図 4 および 図 5)。
  8. 矩形、サブマイクロ、石英、2 mmアパーチャ、10 mm光路長、50 μLキュベットを使用して、アスペクトロフォトメーターによる高速スキャン設定で、200 nmから800 nmまでの吸光度を分析します。
    注意: 高品質のクォーツキュベットのみを使用してください(図4)。
  9. 品質を検証して判断するには、溶出を確認して明るい光に1分間さらした後、手順3.8を繰り返します。
  10. ブランク吸光度を差し引き、分析した吸光度スペクトルと、11-cis網膜結合オプシンの場合は500 nm、光照射されたオールトランス網膜結合オプシンの場合は380 nm、リガンドフリーApo-Opsinタンパク質の場合は280 nmの吸光度との比率を計算します(図6)。リガンドレチナールを含まない遊離オプシンは、500nmでベースライン吸光度を示します。
  11. ロドプシン濃度を定量化するには、ランベルトベールの法則を使用します。
    A=ε·C・l または C=A/ε·l
    ここで、Aは吸光度、εモル吸光係数(ロドプシンε500 = 40,600 M-1 cm-1、遊離Apo Opsinε280 = 81,200 M-1 cm-1)、Cは濃度、lは光路長です。
  12. リガンド-オプシンをパーセンテージで定量するには、A280/A500の比率を使用します。
  13. ブランク減算吸光度スペクトルをプロットし、遊離オプシン値32を計算します。
  14. 吸光係数ε 500 = 40600 M-1 cm-1を使用してロドプシンの濃度を計算します。リガンドフリーオプシンの濃度は、ランベルトベールの法則で吸光係数ε 280 = 81,200 M-1 cm-1 を使用して計算されます。

結果

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ビタミンA膜受容体および光受容体オプシンとそれぞれの生理学的リガンドとのタンパク質-リガンド相互作用を研究するための定量的方法が説明されています。組換えマウスRBP4は、大腸菌で発現し、精製されたタンパク質はSPRチップ上の標識リガンドとして使用する必要があります。~40アミノ酸ペプチドの化学合成されたRBPR2、STRA6、および変異体S294A RBPR2「SYLモチーフRBP4相互作用細胞外部位」を分析種として、さまざまな濃度で分析物として使用され、相互作用の結合および平衡飽和度Kdを測定します(図1および図2)。

RBPR2およびSTRA6のリガンドとしての組換えRBP4タンパク質は、これらのペプチドの相互作用部位に対する結合親和性を示し、それぞれKd ~22.38 μMおよび~26.73 μMで測定されました。アミノ酸モチーフ「SYL」は、RBPR2とSTRA6の両方でこれらの相互作用を安定化する上で重要な役割を果たしており、予測されたように、変異ペプチドS294AはK日 を~114.9μM増加させており、結合飽和に達するための変異体RBPR2ペプチドのコピー数の増加を示唆しています(図3)。STRA6を介した眼へのレチノールの取り込みとさまざまなレチノイドへの変換から、ロドプシンのリジン296残基に結合する発色団としての11-シス レチナールの最終変換は、光子感知と視覚の機能的受容体を作ります。11-シス レチナール共有結合がプロテインオプシンに結合してロドプシンを形成することは、特定の特徴的な吸光度特性を示します。タンパク質の吸光度は 280 nm で発生し、遊離レチノールの吸光度は ~325 nm です。ただし、11-cis レチナールまたはロドプシン吸光度を持つホロオプシンは、500nmの波長で発生します。

この複合体形成における欠損は、低全身性レチノールまたはRBPR2またはSTRA6の変異によるレチノール取り込みの欠損により、発色団11-シスレチナールを欠く遊離オプシンまたはアポタンパク質オプシンの蓄積につながり、特性吸光度が500nmで低吸光度にシフトします。吸光度を定量化し、280 nmと500 nmの波長の吸光度の比を使用することで、配位子を持つオプシンまたはロドプシンを推定することができます。短時間の光を露光することで、500 nmの11-cis網膜結合オプシン吸光度と380 nmの全トランス網膜結合オプシン(Meta IIロドプシン)吸光度の光異性化をクロスチェックすることができます(図4、図5、および図6)。実験的な設定では、アーティファクトや汚染物質が発生する可能性が高くなります。発見されたアーティファクトの2つの主要な原因は、機器からの意図しない光への曝露と、RPEまたはレンズから汚染物質分子を除去できない低濃度の塩洗浄です(図7)。

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図1:表面プラズモン共鳴ワークスペース。 必要な資料とSPR機器の概要(A)SPRチップローディングドック。(A')-NH2、-SH、-CHO、-OH、または-COOH基を介して固定化するための金表面をカルボキシメチル化デキストランが共有結合したCM5チップ。(B)サンプルローディングロボットインジェクターラック。(B') タイプ3ゴムキャップ (B'') サンプル分注用の7 mmプラスチックバイアル。(C,D)平衡化/ランニングバッファーリザーバーと廃棄物収集タンク。(E)Biacoreソフトウェアコントロールパネル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:表面プラズモン共鳴の概略図とセンサーグラム取得のステップ。ステップ1: CM5チップ表面をRBP4タンパク質で固定化し、1,200応答単位を目標としています。 ステップ2: さまざまな濃度のRBPR2ペプチドを分析種として実行し、この生体分子の相互作用により金チップ表面の電子電荷密度が変化し、特定の角度または共鳴角度での光の反射が変化/減少します。 ステップ3:洗浄により表面プラズモン現象が逆転し、反射強度が逆転し、センサーグラムがベースラインに低下します。これらの相互作用の速度論は、関連解離定数と相互作用の強度を決定するためにさらに使用されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:個々のビタミンA受容体結合ドメインペプチドとその生理的リガンドRBP4の表面プラズモン共鳴結合研究(A)CM5チップ表面へのRBP4の固定化の達成結果を示すソフトウェアプロンプト。(B、C、D)さまざまな濃度でのペプチド-リガンドRBPR2-RBP4、STRA6-RBP4、および変異型S294A RBPR2-RBP4相互作用のセンソグラム。(B',C',D')結合速度論と平衡KDの決定は、結合パターンの違いと近さを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:Opsin-11-cis網膜吸光度ワークスペースと装置の概要(A)冷蔵ベンチトップ遠心分離機、すべてのLEDインジケータは赤いテープで覆われています。(B)紫外可視分光光度計、赤いテープで覆われた1つのLEDインジケータ。(B')長方形のウルトラマイクロセル、クォーツキュベット、マグネティックスタンド。(C)アプリケーションソフトウェアをスキャンします。(D)分光光度計のコンパートメントカバーがスライドし、分析用のキュベットホルダー、およびコンパートメントカバーが閉じています。(E)単一の赤色光源の下でのサンプル調製のためのモニターOFFを備えたライトオフセットアップ。(F)サンプル調製および可溶化用の冷蔵回転子。(G)サンプル吸光度測定用のモニターONを備えたライトOFFセットアップ。(H)XYプロットでの吸光度の分析。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:Opsin-11-cis網膜吸光度法のワークフロー概要。ステップ1:単一の赤色光源の下で暗順応マウスからの網膜を単離、均質化、および可溶化して、網膜画分を取得します。ステップ 2 から 4:一連の遠心分離では、ペレットは界面活性剤の非存在下およびDDM界面活性剤緩衝液の存在下で可溶化されます。ステップ 5 から 6:網膜光受容体やその他の膜タンパク質を含む可溶化ペレットで、抗体のプルダウンと精製の準備ができています。ステップ7:VAPA 1D4-ペプチドを使用して溶出したオプシンは、吸光度分析の準備ができています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:ロドプシン吸光度スペクトル(A)500 nmのピーク吸光度を示す1D4精製ロドプシンを使用した暗順応マウス網膜抽出物、および(B)380 nmのピーク吸光度を示す1D4精製ロドプシンを使用した光照射網膜抽出物。(C)ロドプシン精製の品質とサイズ分布を示す1D4ロドプシン抗体を用いたウェスタンブロット。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:ロドプシン吸光度スペクトルアーチファクト。 (A)暗順応眼抽出物の吸光度スペクトルのアーチファクトは、380nmの吸光度ピークで示されています。機器のLEDインジケーターからの意図しない光の露出や暗い部屋のドアのライトブロッカーの故障は、ロドプシンタンパク質の漂白を引き起こします。(B)高塩緩衝液での洗浄が不十分な場合、RPE、レンズ、または眼の抽出物からの他のソースからの汚染物質が蓄積し、吸光度の高いスペクトルの広がりとアーティファクトにつながります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図8:ビタミンA膜受容体(RBPR2およびSTRA6)とオプシンタンパク質とそれぞれのリガンド(RBP4および11-cisレチナール)との間の相互作用の概略図は、視覚機能の光受容体でレチニリデンタンパク質を生成するために重要です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図S1:固有のトリプトファン蛍光強度。 さまざまな濃度のRBPR2およびSTRA6ペプチドと相互作用すると、RBP4の内因性トリプトファン残基の配向の相互作用と変化の予備的な証拠。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:RBPR2およびRBP4タンパク質間ドッキングと相互作用。 界面残基はPyMOLで可視化され、膜内のRBPR2の配向はサーバーツール https://opm.phar.umich.edu/ を用いて可視化されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S3:タンパク質間ドッキング相互作用と可能な接触部位のインシリコ分析のためのパイプライン。 解析パイプラインは、ステップ 1 から 6 までの Python スクリプトの実行と PyMOL コマンドラインの使用方法のシーケンスを示し、インタラクションのサイトを取得する際の信頼性を確保します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S4:RBP4、RBPR2、およびSTRA6ペプチドの組成を示すCD分光法二次構造解析。 円グラフは、分子内に存在する二次構造の割合を示しています。BeStSel Secondary Structureツールを用いて、Circular Dichroism Spectroscopy(https://bestsel.elte.hu)によるProtein Fold Predictionを解析しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プロトコルの重要なステップ
SPRの方法論
インシリコモデリングとドッキング解析:RBPR2(https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1)とSTRA6の予測構造、およびmsRBP4 PDBデータベースの既知の構造(RSCB PDB ID:2wqa)は、ドッキングスタディ29,31に使用する必要があります。さらに、ビタミンA受容体(RBPR2およびSTRA6)上の推定結合部位とそのリガンド(RBP4)との相互作用を確認するために、in vitro法(細胞培養)を使用すべきである29,31(補足図S1、補足図S2、および補足図S3)。CD分光法を使用してペプチドの品質を測定します。以前は、遠紫外CDスペクトルについては、1mmの長方形のセル0.1μg/μL~200μL(3-4μgのRBP4タンパク質、32μMのRBPR2、および32μMのSTRA6ペプチド)が使用されていました31(補足図S4)。窒素ガスの流れは、放出キセノンランプの下での有害なオゾン形成を防ぎ、200〜300nmでのバックグラウンド吸光度を減らすために使用する必要があります。デフォルトのパラメータを使用して、スペクトルは185nmから300nmまで測定されました。ベースラインは、ブランクを使用して減算することによって修正する必要があります。アルファヘリックスとベータシートの含有量は、222 nmのアルファヘリックスの負のピークなど、吸光度の特性に基づいて計算されます。

データベース(https://www.uniprot.org)でRBPR2およびSTRA6タンパク質とトポロジカルドメインのデータを分析し、細胞外領域からの既知の可能な相互作用部位を確認し、~40-50アミノ酸の配列を使用してペプチドを化学的に合成します。この研究では、精製された組換えマウスRBP4(msRBP4)タンパク質と、提案されたRBP4結合残基を含む化学合成されたRBPR2およびSTRA6ペプチドが、受容体-リガンド相互作用を研究するためのものを必要とする18,19,29,31。ペプチドを最終選考に残す前に、相互作用するビタミンA受容体タンパク質の細胞外ペプチド配列を、in silico(コンピュータベースのタンパク質-リガンドドッキング)分析31を用いて決定しなければならない。SPRアッセイは、受容体-リガンド相互作用の動態を理解するために行われます。in-silicoコンピュータベースのアッセイまたはin vitro分析から、予測される相互作用部位を知ることは非常に重要です。この研究では、設計されたペプチドは、RBP4と相互作用することが知られている膜タンパク質RBPR2およびSTRA6の細胞外領域を参照しています。正確な結果を確保し、潜在的なアーチファクトやネガティブなSPRセンサーグラムを防ぐためには、バッファー、ペプチド濃度、溶解性を標準化することが重要です。ロドプシン吸光度試験では、網膜溶解物の単離には、アーチファクトや不要な吸光度ピークを避けるための厳しい暗所条件と洗浄手順が必要です(図7)。

RBP4、RBPR2、STRA6、および変異型S294A-RBPR2ペプチド31 の結合におけるビタミンAトランスポーターに対するSYLモチーフの重要性を理解するために、2つのアミノ酸間のカルボキシル基とアミノ基の縮合反応を用いて化学合成した。このプロトコールは、逐次アミノ酸をアンカリング樹脂に正確に段階的に添加する手順に従いました。アミノ酸合成のプロセスは、N末端アミノ酸ユニットの保護と脱保護の化学修飾を受け、合成とペプチドポリマーの形成を可能にします。完了すると、ペプチドは樹脂から回収され、精製されます。RBP4タンパク質とビタミンA受容体ペプチドの相互作用の初期検証は、内部のトリプトファン蛍光アッセイを使用して確認し、CD分光計を使用して確認する必要があります(補足図S1)。組換えRBP4タンパク質とマウスSTRA6(msSTRA6)、マウスRBPR2(msRBPR2)、およびコントロールペプチドとの初期相互作用品質は、内因性トリプトファン蛍光アッセイ(補足図S1)を使用して確認する必要があります。内因性トリプトファン蛍光アッセイは、受容体とリガンドに結合した際の蛍光のために、タンパク質中のトリプトファンアミノ酸残基の消光または増強を評価するための重要な実験的手順です。測定された蛍光は、相互作用の結果としての局所環境の変化を直接示しています。

メソッドの変更とトラブルシューティング
ランニングバッファー(1x Phosphate-Buffered Saline(Tween 20)または1x HEPES(P20))を使用してSPRを最適化します。沈殿物を避けるために、希釈したペプチドは使用前に遠心分離してろ過する必要があります。ロドプシン吸光度をさまざまな高塩緩衝液(300-500 mM NaCl)で標準化します。500 nmの暗所でロドプシン吸光度のピークを確認するには、サンプルを30秒間光にさらし、測定を繰り返して、380 nmへの吸光度ピークシフトとプルダウンの有効性を通じて品質を確保します。

メソッドの制限
SPRは、2つのタンパク質の相互作用に関する特定の情報を提供できます。ただし、インタラクションに 3 つ目の未知のコンポーネントが必要な場合、データは理解するのが複雑になる可能性があります。分子のコンフォメーションの変化は、相互作用では特定されないままです。RBP4タンパク質はレチノール(apo-RBP4)の非存在下で調製されるため、測定されるのはapo-RBP4の受容体への結合です。したがって、レチノールをロードしたRBP4(holo-RBP4)は、apo-RBP4と比較してRBPR2およびSTRA6受容体に対する親和性が変化する可能性があります35,36。興味深いことに、STRA6に対するアポRBP4およびホロRBP4の親和性は、以前に両方のマイクロモル範囲で示されており、アポRBP4およびホロRBP4のSTRA6受容体35への結合との間に統計的な差は観察されなかった。ロドプシン吸光度法では、眼内の非リガンドオプシン(アポタンパク質オプシン)の存在を同定することはできますが、原因となるメカニズムを特定することはできません。

ロドプシン吸光度スペクトル
クリティカル・チェックポイント: 11-シス レチナールからオールトランス レチナールへの光異性化は、高感度で瞬間的です32。ロドプシン(ホロオプシン)の定量は、厳密な暗所条件下で、暗所(500 nm)で適切なオプシンおよび11-cis 網膜含量を測定するか、Meta IIロドプシン(380 nm)として光適応条件下で実施すべきである32。したがって、マウスは、未漂白ロドプシン32を測定するために、暗い部屋で12〜16時間暗順応する必要があります。この目的のために、暗い部屋は完全に暗く、玄関ドアは遮光布で覆われ、すべての機器の外部LED光源は赤いテープで覆われている必要があります。ラップトップの画面を赤いプラスチックシートで覆い、必要になるまで閉じたままにします。頭上の赤色光源も必要です。

重要なステップ: さまざまな高濃度の塩類での洗浄ステップを標準化し、波長300〜500 nmの波長吸光度を持ち、オプシン吸光度測定に干渉する可能性のあるレンズまたはRPEタンパク質または分子汚染物質を除去します。

既存/代替の方法に対する方法の重要性
全身のレチノイド利用、多組織寄与、およびレチノール分布メカニズムに対するレチノール結合タンパク質受容体の変異の影響を研究するための実行可能なアプローチはありません。このプロトコルは、Apo-Opsinによる光受容体のレチノール枯渇における欠落した接続を理解し、埋めるための2つの重要な技術を利用し、RBPR2-RBP4受容体リガンド相互作用を介した肝臓レチノイド貯蔵利用(図3、 図6、および 図8)。

特定の研究分野における本手法の重要性と応用可能性
SPRおよび吸光度ベースのロドプシン分光法アッセイは、レチニリデンタンパク質(ロドプシン)の生成のための全身および眼のビタミンA恒常性メカニズムを研究するための有意義な戦略を提供します。要約すると、これらの技術と実験的アプローチは、食事性レチノイドの肝臓から眼への膜受容体依存性輸送の動態を解明し、ロドプシンの生成を促進することができます(図8)。また、ビタミンA受容体とオプシンタンパク質の突然変異、特にそれぞれのリガンドへの結合のメカニズムと眼への影響を理解するのにも役立ちます。これらの相互作用は、視覚機能に重要なレチニリデンタンパク質の生成に影響を与える可能性があります。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、利益相反を宣言しません。資金提供者は、研究のデザインに何の役割も果たしていませんでした。データの収集、分析、または解釈。原稿の執筆、または結果の出版の決定において。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、ロドプシン吸光度プロトコルに関するアドバイスをいただいたBeata Jastrzebska博士(オハイオ州ケースウェスタンリザーブ大学薬理学部)に感謝します。この研究は、NIH-NEIの助成金(EY030889および3R01EY030889-03S1)と、一部はミネソタ大学のG.P.L.へのスタートアップファンドによって支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2次元定量キットCytiva80648356
アミンカップリングキットCytivaBR100050
Biacore評価ソフトウェアBiacore S200Version 1.1
Biacore センサーチップ CM5CytivaBR100530
Bis tris propaneSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 コンピテントセルThermo科学EC0114
CD分光光度計JascoJ-815 分光偏光計
グリシン HCLフィッシャー バイオ試薬BP381-1
GraphPad プリズム モデルフィッティング、データ解析
LBブロスFisher BioreagentsBP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)EMD Millipore324355-1GM2-20 mM
pET28a His-tag Kanamycin-resistant expression vector Addgene69864-3
プラスミド精製キットQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K 透析カセットThermo Scientific66810
Tween20Fisher BioreagentsBP337-5000.05%
UV vis 分光光度計Agilent Cary 60 UV-Vis
Peptide namePeptide sequenceHPLC-purityMass Spec
Mouse Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14%は
、マウス Stra6 に適合 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84%適合
マウスRbpr2変異体 S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92%適合

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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