方法論記事

68Ga標識ナノ分子の放射合成、品質管理、および小動物陽電子放出断層撮影イメージング

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DOI：

10.3791/67048

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2024年10月4日

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1Department of Nuclear Medicine, University Hospital RWTH Aachen, 2Department of Radiology and Nuclear Medicine, Maastricht University Medical Center, 3School of Nutrition and Translational Research in Metabolism (NUTRIM), Maastricht University, 4School for Cardiovascular Diseases (CARIM), Maastricht University

この記事について

サマリー

この論文では、新しい放射性標識プローブ( すなわち、68Ga標識ナノボディNM-02)の放射合成、製剤化、品質管理、および異種移植モデルでの小動物PET/CTイメージングへの使用について説明します。

要約

小動物の陽電子放出断層撮影法(PET)および単一光子放出型コンピュータ断層撮影法(SPECT)イメージング技術は、前臨床がん研究において重要であり、放射性トレーサー合成、品質保証、 およびin vivo 注射プロトコルに細心の注意を払う必要があります。この研究では、小動物PET実験の堅牢性と再現性を高めるための包括的なワークフローを提示します。 68Gaを使用した放射化学実験室での合成プロセスは詳細であり、各放射性トレーサー製造の厳格な品質管理と保証プロトコルが強調されています。濃度、モル活性、pH、純度などのパラメータは、ヒトでの研究に適用される基準に沿って厳密に監視されています。この方法論では、合理化されたシリンジ調製と、マウスへの正確な静脈内注射のためのカスタム設計の30Gカニューレを導入しています。スキャン中の動物の健康状態(体温や心拍数など)のモニタリングにより、処置全体を通して動物の健康状態が確保されます。PETおよびSPECTスキャンの投与量は、データ取得と動物や研究者への放射線被ばくを最小限に抑えるために事前に決定されています。同様に、CTスキャンは、放射線被ばくを制限するために事前にプログラムされた設定を採用しており、特に治療効果を評価する長期研究に関連しています。これらのステップを最適化することにより、ワークフローは、手順を標準化し、ばらつきを減らし、小動物のPET/SPECT/CTイメージングの品質を向上させることを目的としています。このリソースは、分子イメージングにおける前臨床研究の精度と信頼性を向上させ、最終的にこの分野を進歩させようとしている研究者に貴重な洞察を提供します。

概要

最も関連性のあるトピックの1つは、乳がん分野の研究です。乳がんは依然として頻繁に発生するがんで、女性の全がんの約1/3を占めています。治療は、腫瘍の生物学的および組織学的特性、および疾患の病期に合わせて調整されます。腫瘍がすでに転移していない限り、生存の可能性は一般的に良好であり、その場合、5年生存率は約30%にすぎません1。他の婦人科がんも同様の運命をたどっており、例えば、卵巣がんではステージ1の腫瘍では5年生存率が95%>が、転移したステージ4の腫瘍ではわずか15%である2,3。

非侵襲的イメージング、特に陽電子放出断層撮影法(PET)は、代謝、受容体発現、治療反応などの腫瘍分子的側面に関する比類のない洞察を提供し、がん研究を変革しています4,5,6。これにより、特定の代謝領域の視覚化と定量化の両方が可能になり、正確な診断だけでなく、非常に短い時間ポイントでの(新しい)治療法の効果を監視することもできます。実際、PETは、1〜3回の治療サイクル後の反応と無反応の評価を可能にし、古典的なコンピューター断層撮影(CT)イメージング7で見られる形態学的変化と比較して、これをより良く、より迅速に行うことができます。PETの非侵襲性は、縦断的な研究も可能にします。

どの動物モデルでも、新しい(放射性)医薬品の治療能力を徹底的に評価するために最大限の標準化が必要であるため、腫瘍モデルの生成と小動物PETイメージング/データ解析の両方で、これに重点を置く必要があります。動物における最良の腫瘍モデル(皮下接種または同所性移植、マウス、ヒト、または同系腫瘍、日常的な臨床ケアを伴うまたは伴わない腫瘍)について議論することはできますが、それはこの出版物の目標を超えています。がん研究にはいくつかのモデルを使用していますが、ここで説明するモデルは比較的単純な皮下モデルです。

放射化学における品質管理は、動物の安全性と治療効果にとって最も重要です。これは、放射性医薬品自体だけでなく、製品の処方にも影響を与えます。臨床応用のための放射性医薬品の製造に関する広範な法律8,9(現在の法律とガイドラインの広範な概要については10を参照)、および前臨床研究のための放射性医薬品の特性に関するいくつかのガイドライン(広範な概要については11を参照)があります。私たちは、臨床応用と前臨床応用の両方の放射性医薬品を製造しており、臨床応用のための合成に見られるようなハイエンドの品質管理から前臨床応用への変換を簡素化しています。

私たちの研究の焦点は、指向性セラノスティクス、特にヒト上皮成長因子受容体2(HER2)陽性がんにあります。そこで、がんの治療中にがんを診断・モニタリングするための新しい放射性医薬品を開発しています。診断に成功した放射性医薬品は、さまざまな放射性同位元素を使用した治療用化合物としても評価されます。これらの放射性医薬品の評価は、まず動物モデルで行われ、有望な前臨床結果を受けて臨床応用を目指しています。この記事では、1つの放射性医薬品に例示され、品質管理と保証を確保するために使用されたプロトコルと、分子イメージングにおける前臨床研究の精度と信頼性を向上させるために、マウス静脈注射とPET/CTスキャンの標準的な方法を紹介します。プロトコールは、放射化学(トレーサー合成と品質管理)、動物モデル作製(皮下腫瘍モデル)、イメージングの3つのセクションに分かれています。

プロトコル

この研究プロトコルは、最高水準の動物福祉を遵守し、アーヘン工科大学病院のアニマルケアガイドラインに厳密に準拠しています。私たちは、研究に関与するすべての動物の倫理的かつ人道的な扱いを確保することを約束しており、手順は地元の動物倫理委員会によって審査および承認されています。すべての動物実験は、実験目的およびその他の科学的目的で使用される動物の保護に関する規則と併せて、動物保護法の遵守について、ドイツの所轄官庁(Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, LANUV)によって承認されました。

注:この研究全体で使用される機器、材料、および試薬の完全なリストは、 材料の表に記載されています。 68Gaの取り扱いは、可能な限りピペットで行い、鉄がラベリングの歩留まりを大幅に低下させる可能性があるため、金属は絶対に避けるべきであることに注意することが重要です。これは、放射化学手順が完了するまで針を避ける必要があることを意味します。

1. 放射化学

  1. NM-02-DOTA-GAの 68Gaによる放射性標識
    注意:このプロトコルには、放射性物質の取り扱いと操作が含まれます。研究者は、放射性物質の取り扱いに関する現地の法律、ALARA(合理的に達成可能な範囲での)慣行、鉛遮蔽の使用、直接接触時間の最小化、放射線被曝の各ステップで最大距離の維持に関する法律に従う必要があります。実験手順は、放射能検出装置で監視する必要があります。
    1. 68Ge/68Ga-Generator を 10 mL の 0.6 M HCL (1.2 GBq/10 mL) で手動または自動溶出します。溶出液をカートリッジに通すことにより、68GaをPS-H+カートリッジ(サイズM-0.8 mL)にトラップします。PS-H+ SPEカートリッジを合計1 mLの4 M NaClで段階的かつゆっくりと微量遠心チューブに溶出します。
    2. 溶出液の最初の0.3 mLを廃棄し、残りの0.7 mLを別の微量遠心チューブに回収します。
    3. 新しい微量遠心チューブを用意し、製造元のプロトコルに記載されているように、NM-02-DOTA-GAの放射性標識を進めます。
      注:ナノボディ-キレート剤コンジュゲート(NM-02-DOTA-GA)は、以前に供給業者のプロトコルに従って調製されました。コンジュゲートは、-80°Cで数ヶ月間アリコートに保存することができます。
    4. 最大5 μLの3 M NH4OAcを使用して、製品のpHを約7に調整します。
  2. 品質管理
    1. 活動量計を使用して、マイクロ遠心チューブ内の濃縮サンプルの活性を正しい設定(同位体として68Ga、1 mLシリンジ、幾何学用0.1 mL)で測定します。放射性化学収率(崩壊補正済み)は少なくとも40%である必要があります。
    2. pHテストストリップ(0-14)でpHテストストリップ(10-15μL)に十分な量を見つけてpHを測定します。
    3. 薄層クロマトグラフィー(TLC)
      1. シリカ含浸TLCストリップ上の放射性標識反応混合物のスポット1 μL。アリコートを約1分間乾燥させます。クエン酸を移動相として使用し、約2〜3 mmのプレフィルドを密閉TLCチャンバー内でTLCを実行します。液体がストリップの上部に到達したら、TLCストリップをチャンバーから取り出します。
      2. TLCストリップを無線TLCスキャナーに置き、製造元のプロトコルに従って測定します。生成物は原点(Rf < 0.2)に現れるはずですが、遊離 68Gaカチオンは溶媒前面(R f 0.9)とともに溶出します(Rf > 0.9)。
      3. ラジオクロマトグラムを使用し、Rf 0.0-0.2 の積分曲線下面積 (AUC) を合計 AUC (Rf 0.0-1.0) で除算し、100 を掛けて、反応の放射性標識収率を計算します。
    4. 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
      1. HPLCが正しい溶媒を使用して少なくとも10分間稼働していることを確認し、すべてのラインが浸水するようにし、測定の設定を調整します。アセトニトリル(溶媒A)と0.9%NaCl溶液(980mL)の混合物とトリフルオロ酢酸(1mL)およびクエン酸溶液(20mL)を組み合わせた50:50の混合物のアイソクラティックフローを溶媒Bとして使用し、280nmでのUV吸光度を測定します。
      2. 5 μLの製品を15 μLの0.9% NaClで希釈します。混合物 15 μL を分析ラジオ HPLC (5 μm SEC-s2000 154 Å カラム、流速: 2 mL/分) に注入します。
      3. アセトニトリル(溶媒A)と0.9%NaCl溶液(980mL)の混合物とトリフルオロ酢酸(1mL)およびクエン酸溶液(20mL)を組み合わせた50:50の混合物のアイソクラティックフローを溶媒Bとして使用し、280nmでのUV吸光度を測定します。UVチャネルとガンマチャネルの間の保持時間にはわずかなシフトがあります。これは、HPLCの設計によるものです(ガンマ信号はUV検出器の後に直列に取り付けられます)。
      4. ガンマ線チャネルのピークを積分することにより、放射性化学的純度を決定します。製品は、以前に非放射性標識ナノボディを測定することによって決定された積分範囲内にある必要があります。さらに、ガンマチャネル内の他のすべてのピークを波形解析し、不純物として評価します。純度は>95%である必要があります。
    5. エンドトキシン
      1. (認定された)エンドトキシンフリー水を使用して、総容量150μLで製品を1:20に希釈します。
      2. エンドトキシン試験リーダーに、必要なすべての試薬が市販されている使い捨てエンドトキシンカートリッジを挿入し、各カートリッジチャンバーに希釈した製品25μLをロードします。
      3. 再生を押します。PTSには内部のポジティブコントロールとネガティブコントロールがあり、最終レポートに含まれます。テストの所要時間は約15分です。エンドトキシン含有量がVmax = 20 mLで8.7 EU/mL<場合、製品はエンドトキシンフリーと見なされます。
    6. レトロスペクティブ無菌性
      1. 注入して品質サンプルを採取した後、放射性医薬品を滅菌バイアルに入れ、4°Cの冷蔵庫で保存します。
      2. 12に準拠した無菌試験を実施するために、10、5 Bq、または10 Bq/gの免除限度を超えない場合は、無菌性を分析する認定機関(社内または外部企業)にサンプルを引き渡します。
  3. シリンジ製剤(1匹につき1本)
    1. 正しい設定(同位体として68Ga、1 mLシリンジ、幾何学用0.1 mL)で活動量計を使用して、製品の活性を測定します。
    2. 製品15MBq(約25μL)を微量遠心チューブに取り、0.9%NaClを75μLまで充填します。
    3. シリンジに50 μLを加え、正しい設定(同位体として68Ga、シリンジ1 mL、幾何学用0.1 mL)で活動量計を使用して測定します。シリンジには 10 MBq の製品が含まれている必要があります。
      注: 68Ga標識ナノボディNM-02が形成されるとすぐに、 68Gaの取り扱いにプラスチック製のピペットチップは不要になります。ここからは、プロトコルで液体の取り扱いについて言及されているときはいつでも、適切な注射器(1mL)と針(27-30G)を使用してください。

2. 動物モデル生成

  1. 動物の飼育
    1. 皮下腫瘍の発生には、6〜8週齢のATHYM-Foxn1nu / nu マウス(商用サプライヤーから)の女性免疫不全Rjを使用します。到着したら、すべてのマウスを直接動物室に収容し、順応のために輸送後少なくとも1週間待ちます。
    2. 12時間の明るいサイクル/12時間の暗いサイクルで動物を収容し、食べ物と水への無料アクセスを提供します。室温と相対湿度をそれぞれ20〜25°Cと45%〜65%に保ちます。
  2. 移植用細胞の調製
    1. 1 x 106 SKOV-3細胞で細胞培養を開始し、10% FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを豊富に含ませた予熱済みDMEM/F12培地25 mLをT175細胞培養フラスコに加えます。
    2. インキュベーターで細胞を37°C、5%CO2 で培養し、少なくとも週に2回、完全な培地を交換します。
    3. 細胞移植の1週間前、または遅くとも1日前に、細胞培養フラスコから20μLの培地を取り出して、マイコプラズマ13をテストします。細胞注入にはマイコプラズマ陰性細胞のみを使用してください。
    4. 細胞注入の日に、完全な培地を吸引し、5 mLのPBSをボトルにピペットで入れます。ボトルを前後に数回回転させて、残りの培地を洗い流します。
    5. 3 mLのトリプシンをフラスコに加え、インキュベーター内で37°Cおよび5%CO2 の4分間インキュベートして細胞を解離します。顕微鏡で40倍の倍率で、細胞が細胞培養フラスコから分離したかどうかを確認します。
    6. 7 mLの培地を加えてトリプシン活性を中和し、細胞懸濁液を50 mLの遠心チューブに移します。
    7. 細胞を150 x g で5分間(室温)遠心分離して、細胞ペレットを得ます。上清を取り除き、1 mLの培地を加えて細胞を再懸濁します。
    8. 微量遠心チューブに12 μLの細胞懸濁液を取り込み、等量のトリパンブルーを加えます。血球計算盤チャンバーに、慎重に混合した細胞懸濁液10μLをロードします。
    9. 定義された領域内の未染色の生存細胞をカウントし、細胞数を計算します。細胞濃度を5 x 107 細胞/mL培地に調整し、細胞懸濁液を1 mLの基底膜マトリックスと慎重に混合します。
    10. 各マウスについて、1 mLインスリンシリンジに50%基底膜マトリックスを含む0.2 mLの細胞培地に5 x 106 細胞を取り込みます。シリンジを注入するまで氷上に置いて、基底膜マトリックスの固化を防ぎます。
      注:マウスの体重が20 g未満の場合は、150 μL(15〜20 gの場合)または100 μL(10〜15 gの場合)のみを注入します。皮下アプリケーションの場合、GV-SOLASが推奨する最大容量10 mL / kg体重14を超えないように注意が払われます。.
  3. 接種とフォローアップ
    1. 片手で首と尾を固定することにより、覚醒した動物の脇腹に細胞懸濁液を皮下注入します。通常、左脇腹に注射することを好みます。
    2. 基底膜マトリックスが固まるまで10〜15秒待ってから、針を取り外します。
    3. デジタルキャリパーを使用して、移植後毎日腫瘍の成長を監視し、2つの垂直な腫瘍軸を測定します。
    4. これらの測定値を使用して、次の式で計算された腫瘍体積を使用して腫瘍の成長を評価します。
      VT = L × B2 × π / 6
      ここで、V Tは腫瘍体積(mm3)、Lは腫瘍の長さ(mm)、(すなわち、2つの垂直軸のうち大きい方)、Bは腫瘍の幅(mm)(すなわち、2つの垂直軸のうち小さい方)である。この手法は、皮膚も含むため、腫瘍の体積を過大評価する傾向があります。
    5. 腫瘍の質量は、電子スケールで測定した場合、マウスの体重に影響を与えます。腫瘍の質量に対して補正された動物の体重を計算するには、次の式を使用します。
      mマウス-T = mマウス - 0.82 × VT
      ここで、mmouse-Tは腫瘍塊を除いたマウスの体重(g)、mmouseは電子スケールによるマウスの体重(g)、V Tは計算された腫瘍体積(mm3)である。0.82 g/mm3という数値は、以前の動物実験から単離された一連の腫瘍の平均値から得られ、与えられた式を用いて秤量し、その体積を決定した結果です。これは平均腫瘍密度を表します。
    6. さらに、マウスと比較した腫瘍の大きさを判定し、以下の式を用いて腫瘍量をモニターします:
      腫瘍量 [%] = (0.82 × VT) / mマウス × 100
      ここで、腫瘍負荷はパーセンテージで表され、0.82 × VT はg単位の腫瘍質量(すなわち、 VT、計算された腫瘍体積(mm3)に平均腫瘍密度を掛けたもの)に対応し、 mマウス はg単位のスケールに従ったマウスの体重です。
    7. 動物が腫瘍体積が200 mm3を超えた場合は、実験に応じて、非侵襲的PET/CTまたはSPECT/CTにスケジュールします。

3. イメージング

  1. シリンジ調製(カスタムメイドシステム)
    注:マウスの尾は小さいです。したがって、27G以下のカニューレを使用する必要があります(数値が大きいほど針が小さくなります)。雌マウスの場合、ボーラス注射のための唯一のアクセス可能な静脈は3つの尾静脈です。解剖学的には、背側尾静脈は2つの側静脈と比較して脊柱に近いです。医原性骨の引っかき傷を避けるために、この静脈に注射しないでください。.経験に基づくと、30Gカニューレを使用すると、小さな静脈にもアクセスできるため、最良の結果が得られます。30Gカテーテルは購入できないため、研究者が注意して作る必要があります。
    1. 計画された投与経路に応じて、放射性トレーサーを使用してシリンジを準備します。静脈内注射の場合、25 gマウスに最大容量5 mL / kg体重が投与されていることを確認してください。これは、最大注入量が125μLであることを意味します。
    2. 30Gカテーテルを準備するには、まず、任意の30G針を使用し、金属製のはさみで、またはプラスチックから曲げて金属製の針軸を取り外します。
    3. 直径0.3mmのPE10チューブを、ハブから取り外したシャフトの部分に手動で挿入します。チューブに穴が開かないように注意する必要があります。
      注:他の種類のプラスチックも使用できます。ただし、PE10は壁の剛性と柔軟性の最適なバランスを提供します。
  2. 静脈注射
    注:静脈内注射は、覚醒している動物でも行うことができます。ただし、これが不要な場合は、研究動物の負担を軽減するために、動物にイソフルラン鎮静剤を注射する必要があります。
    1. 30Gカテーテルに0.9%NaClバッファーまたはその他の必要なバッファーを充填します。
    2. マウスを誘導チャンバーに入れ、動物が立ち直り反射を失うまで、酸素(または医療グレードの加圧空気)とガス状イソフルランの混合物を連続的に充填します。誘導には、3.5 L/分の酸素または空気の流れで 0.8% 〜 5% イソフルランを使用します。
    3. 鎮静剤を投与したマウスを加熱マット(37-38°C)上の最初の腹側位置に直ちに置き、ノーズコーンを通じてイソフルラン鎮静を維持します。マウスに過熱の兆候がないか頻繁にチェックしてください(例:.、過度のストレッチ、急速な呼吸、皮膚の発赤)。麻酔の維持には、1.8 L/分の酸素または空気の流れで1.8%〜2.5%のイソフルランを使用します。
    4. 鎮静中の乾燥を防ぐために、動物の目に眼科用軟膏を塗布します。両方の側尾静脈を検査し、注入に最適な静脈を選択します。静脈の視認性と直径を考慮する必要があります。最良の結果を得るには、選択した静脈が加熱マットに接触するようにテールをわずかに回転させ、静脈を1分間拡張させます。
    5. マウス全体を横方向に回して、選択した静脈が上向きになるようにします。テールの先端と付け根をテープで固定します。
    6. 利き手で30Gカテーテルを取り、利き手でない人の人差し指を選択した静脈にそっと置き、内部の血液のバックアップを作成します。バックアップの現場では、静脈が拡張し、小さなこぶが形成されます。
    7. 利き手で、30Gカテーテルを静脈のこぶに面した尾と平行に配置します。利き手を前に動かします。ほとんどの場合、この技術は直接的な静脈穿刺を確実にします。
    8. 静脈内に入ると、血液の逆流がプラスチックチューブに見えるようになります。プラスチックチューブを固定して、注射中に針が静脈内で動かないようにします。チューブの自由端に、30G針に接続されたトレーサーシリンジを挿入します。
      注:トレーサーの動的分布を評価する必要がある場合、動物をPETスキャナーベッドに置き、PETを開始した後に、以下の点を実行する必要があります。
    9. トレーサーシリンジの内容物を少なくとも10秒間ゆっくりと注入します。30G針を30Gカテーテルシステムに接続したまま、トレーサーシリンジのみを取り外し、0.9%NaClバッファー(またはその他の必要なバッファー)とシリンジを接続してカテーテルを洗い流します。注射処置中は呼吸を継続的に監視し、イソフルラン濃度を調整して、1秒あたり約1回の呼吸を維持します。.
    10. 尾静脈から30Gカテーテルを取り外し、滅菌綿湿布を使用して出血を止めます。
    11. 残った活動を測定するには、30Gカテーテル、バッファーシリンジ、空のトレーサーシリンジ、および綿の湿布を測定します。
  3. PET/CT取得
    注: 68Ga標識ナノボディNM-02の場合、すべての動物は小動物PET / CTシステムでイメージングされます。
    1. PETの取得
      1. 鎮静剤を投与したマウスを動物用ベッドの腹側位置に置き、PETスキャナーに取り付けます。イソフルランの流れをPETのノーズコーンに切り替え、スキャン中の動物の呼吸数が毎分75〜50回の呼吸になるように、医療用空気中の1.5%〜2.5%イソフルランを0.8L / minに保ちます。
      2. マウスを首の後ろに医療用テープで動物のベッドに固定します。必要に応じて、鎮静中の乾燥を防ぐために、マウスの目に眼科用軟膏を再度塗布します。.
      3. 動物用ベッドの加熱パッドを約80%の電力(約30°Cに相当)に回します。
      4. 取得時間を45分に設定し、スキャンする 関心領域 を選択します。研究同位体として 68Ga を選択し、スキャンを開始します。注入した活性量、注入時間、空のシリンジの測定時間を入力します。PETベッドの1つの位置は160mmで、マウスの全身スキャンに十分な長さです。
      5. トレーサーの動的分布を評価する必要がある場合は、まずPETスキャンを開始し、取得まで30秒待ってから、手順3.2.9-3.2.10に進みます。さらなる失血を避けるために、バッファーシリンジを取り付けた状態でカテーテルをマウスに残します。カテーテルは、アーティファクトを避けるために、CT取得の前にPETの端で切断することができます。
    2. CT取得
      1. 動物用ベッドをPETスキャナーから外し、すぐにCTスキャナーに接続します。必要に応じて、カニューレを尾静脈からも取り外します。静脈穿刺の少なくとも30分後、注射部位はすでに凝固しているため、これ以上の出血は発生しません。
      2. CTスキャナーでイソフルランの流れをノーズコーンに切り替えます。
      3. PETイメージングでスキャンするのと同じ関心領域を選択します。標準集録プロトコルを選択します:440 μA、50 kVp、32 ms露光時間、スパイラルモードで1080°回転、露光回数960回/360°。CTスキャンの所要時間は、マウスの全身スキャンで約7分です。
      4. 呼吸数を制御し、動物用ベッドの加熱パッドをオンにします。スキャン中は呼吸を継続的に監視し、イソフルラン濃度を調整して、毎分75〜50回の呼吸数を維持します。

4.イメージング後の動物の世話

  1. スキャンの終わりに、動物は目を覚ますのに少なくとも15分かかります。同腹仔の攻撃性を避けるために、動物を約15分間、または自力で歩けるようになるまでケージに入れ、元のケージに戻します。この間、低体温を避けるために赤外線を使用してください。
  2. 最初に、血行動態ショックを避けるために、動物をその左側(安全な位置)に置きます。眼科用軟膏は、目覚めると動物自身によって除去されるため、そのままにしておきます。

5. PET/CT再建

  1. 192 × 192 × 384 マトリックスで、ピーク 511 keV から 0.4 mm までのエネルギー ウィンドウを ±15% のエネルギー ウィンドウで 3 次元順序サブセット期待値最大化 (つまり、30 回の反復を伴う OSEM-3D) を使用して PET 再構成実行します。CTベースの補正(減衰補正、散乱補正、デッドタイム、ランダムイベントなど)をPET再構成に適用します。
  2. トレーサーの動的分布を評価する必要がある場合は、マルチフレーム再構成を適用します。例として、45 分のスキャンには、4 x 30 秒、3 x 1 分、5 x 2 分、2 x 5 分、2 x 10 分のフレームを使用できます。
  3. 反復再構成アルゴリズム(ISRA)再構成プロセスを使用して、200 × 200 × 425マトリックスで0.2 mmの等尺性ボクセルサイズにCT標準取得プロトコルを再構築します。ベンダーソフトウェアを使用して、次の式を使用してCT値をハウンズフィールド単位(HU)に変換します。
    figure-protocol-1
    ここで、μW は水の線形減衰係数、μa は空気の線形減衰係数、μt は組織の線形減衰係数です。
  4. PET画像とCT画像は、キャピラリーファントムスキャンから生成されたマトリックスを使用して、再構成後に自動的に位置合わせされました。再構築されたすべてのデータをアーカイブし、必要に応じて画像解析ソフトウェアを使用してデータベースサーバーに転送します。

6. 画像処理・解析

注:共登録されたPET/CT画像は、画像解析ソフトウェアのデータベースサーバー内でさらに定量化に使用され、各ハイブリッドスキャンは被写体として保存されます。

  1. CTに基づいて腫瘍を同定し、これを関心領域として選択します。CTで腫瘍ベースを手動でマスクします。
  2. ユーザーに依存しないセグメンテーションを実現するには、新しく形成された腫瘍マスクをPETまたはSPECTで閾値します。PETの場合は、1.0の標準化された取り込み値(SUV)の最小しきい値を使用します。SPECTの場合、心臓または終末腹部大動脈で測定された平均血液プール取り込みよりも高い最小しきい値を使用します。
  3. 平均、最大値、最もホットな 10 個のボクセルの平均 (つまり、ホット平均 10)、および新しく生成された対象ボリュームの合計取り込みを記録します。
  4. これらの値を使用して、SUV と TBR (Target-to-Background) 値を生成し、さらに統計解析に使用されます。

結果

放射性医薬品の品質管理の最も重要な側面の1つは、HPLCによるもので、これは化学的および放射性化学的純度(この場合は98.2%)だけでなく、溶出時間とピーク形状を非放射性参照化合物と比較することにより、放射性医薬品の同一性を証明することもできます。この参照化合物は、この場合、非標識ナノボディであり、質量分析や核磁気共鳴などの古典的な手法によって正しい化合物であることが証明されています。これらの手法は、放射性化合物に直接適用することはできませんが(シグナルを生成するのに十分な質量がありません)、放射性化合物とその参照を比較することにより、正しい化合物が実際に標識され、合成中に変化しなかったという十分な証拠が収集されます。放射性製品と 図1の基準との間の保持時間のわずかな違いに注意してください(これは、HPLCフローの連続測定に対応します(UVが最初に測定され、その後、フローが放射能検出器に到達するまでに約0.2分かかります)。

figure-results-1
図1: 68Ga標識ナノボディNM-02(GLNM-02)の品質管理のための一般的な分析用HPLCクロマトグラム。 コールドコンパウンドのUV吸光度(上部パネル)は280nmで測定され、4.18分にピークを示し、0.22分シフトします。 68Gaで標識された製品のピークは、ガンマ検出器(つまり、下部パネル)で見ることができます。放射性化学収率は98.2%です。mAU = ミリ吸光度単位、NM-02 = 当社製品、UV = 紫外線チャネル、nm = ナノメートル、min = 分、CPS = カウント/秒、GLMN-02 = 68Ga標識ナノボディ NM-02、 68Ga-DOTA-GA = [68Ga]Ga-DOTA-GA、γ ChA = ガンマチャネル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

HPLCがない場合、またはHPLCに加えて、TLCを使用して最終製品のラベリング収率と純度を決定できます(ただし、同一性は測定できず、HPLCほど詳細ではありません)。TLCは複雑性が低いため、放射性合成経路がまだ最適化されている場合に最適です。 図2 に、 68Ga標識ナノボディNM-02(見かけ上の放射化学的純度99.9%)のTLCクロマトグラムを示します。

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図2:68Ga標識ナノボディNM-02(GLNM-02)の品質管理のための典型的な分析TLCクロマトグラム。 面積カウントは、TLCプレート上の溶媒(クエン酸塩)が移動した距離に対してプロットされます。Rfは0.2で、放射化学的純度は99.9%です。C = カウント、mm = ミリメートル、GLNM-02 = 68Ga標識ナノボディNM-02、TLC = 薄層クロマトグラフィー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

公開用の画像データを準備するプロセスでは、少なくとも 1 つのスタンドアロンの CT 画像と PET 画像を表示するのが標準的な方法です。このアプローチにより、トレーサーの生体内分布を包括的に評価することができます。標準的なCTスケーリングは-1000HUから1000HUの間であり、1つのウィンドウ内ですべての軟組織を視覚化することができます。 図3Aに示すように、この方法ではマウスの腎臓を明確に区別すると同時に、骨の評価が可能になります。

PETスケールの場合、最小上限しきい値を1.0(図3B)に維持しながら、SUVの下限しきい値を0.0に設定し、できればSUVの計算中に体重の正規化を使用します(つまり、SUVのbw)。さらに、定量化には、SUVmaxよりもSUVmeanが好まれます。SUVmaxを使用する場合は、SUVBW の計算で最もホットなシングルボクセルの値ではなく、最もホットな10個のボクセルの平均を使用します。CTスライスとPETスライスをマージして、PET/CT画像の特徴融合を準備します(図3C)。

読者が全身トレーサーの生体内分布を独立して評価できるように、同じPETスキャンの最大強度投影をPETスライスと同じスケールを使用して表示することができます(図3D)。

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図3:皮下SKOV-3担がんマウスの in vivo PET/CT画像。 画像は、5 MBq 68Ga標識ナノボディNM-02(GLNM-02)の静脈内注射の3時間後に取得されました。(A)CT画像は-1000HUから1000HUの間でスケーリングされ、(B)PET画像は0.0から5.0のSUVの間にあります。(C)PET/CT融合は同じスケールを使用します。(D)最大強度投影(MIP)PET画像も、0.0と5.0のSUVを使用してスケーリングされます。すべてのPET画像は、GLNM-02の良好な腫瘍取り込みを示しており、腎クリアランスがはっきりと見えます。CT = コンピューター断層撮影、PET = 陽電子放出断層撮影、MIP = 最大強度投影、HU = ハウンズフィールド単位、SUV = 標準化された取り込み値。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

68Ga標識ナノボディNM-02の特定のケースでは、マウスの左側に顕著な腫瘍の取り込みが観察できます。さらに、トレーサーの腎クリアランスも明らかです。PETの最大強度投影を提示することにより、膀胱活動も見えるようになり、トレーサーの腎クリアランスが強化されます。この特定のケースでは、腎臓、腫瘍、および膀胱を同じ2Dスライスで表示できないことに言及する価値があります。出版物に最大強度投影を含めることにより、トレーサーの生体内分布全体が同じ画像に表示されます。

ディスカッション

放射性合成
ここで説明する放射合成は、新しい 68Ga標識化合物の典型であり、合成時間が短く、適切なpHに重点を置き、可能な限り金属を避けることに重点を置いています。そのためには、コンポーネントが追加される順序に厳密に従うことが重要です。いずれにせよ、 68Ga溶液のpH値は、最初に3 M NH4OAcでpH 4に調整する必要があります。そうしないと、pHが酸性すぎるとナノボディが劣化する可能性があります。 68Ga合成の一般的な概念については、先に説明した16ので、ここでは詳しく説明しません。自動合成モジュールでは、放射線量の減少に関してさらなる最適化が必要です。これには、ここで説明するように、一般的な前臨床実験における探索的研究の範囲を超えた多大な努力が必要です。さらに、自動合成では、現在の方法で生成できる少量(< mL)が得られる可能性は低く、 68Gaの高濃度とより高い比活性が可能になります。

品質管理は、依然として非常に詳細に実施および登録する必要があります。臨床合成のpH測定は、pHメーターを使用して非常に正確に行われることが多いですが、ここでは、静脈内注射の要件がこれを可能にするため、単純なpHストリップでpHを測定するだけで十分です(6〜8のpHが許容されます14)。このシンプルな技術により、コストが削減され、機器が放射性物質で汚染される可能性が低くなります。

動物モデルの処方
トレーサーの最終的な処方は、トレーサーの重要な側面であり、前臨床研究ではしばしば不十分に説明される側面です。放射性医薬品を含むヒト試験用の医薬品を前臨床で製剤化するための明確な法律がある一方で、溶媒や製剤について特に議論していないガイドライン17,18しかありません。これらのガイドラインは、(動物)倫理委員会(ドイツではLANUV19)による承認のために法的に義務付けられたプロトコルを起草または評価する際によく使用されますが、これらの文書は定式化の重要性を十分に強調していません。不十分な処方は誤った(否定的な)結果につながる可能性がありますが、腫瘍学の分野にもまだ存在する持続的な出版バイアスを考慮すると、そのような主張を検証することは困難です20。

ARRIVEガイドラインに加えて、ヒトに適した製剤は一般的にげっ歯類にも適していると仮定して、可能な限りヒト用に設計された法律に従うことを選択しました。主な違いは、被験者のサイズであり、したがって、安全に注入できる量です。この目的のために、分子量カットオフ(MWCO)フィルターを使用して可能な限り化合物を精製することを選択しました。これは、大きな化合物の精製に効果的であることが証明されているためです21。これにより、典型的な68Ga標識トレーサーを最終的に、マウスに適した任意の溶液と少量(一般的な最大静脈内注射100〜150μL)に溶解することができます。

ドイツでは、GV-SOLAS(Gesellschaft für Versuchstierkunde、英語:Association for laboratory animals)が動物保護と研究の仲介役として、人間と動物の両方に利益をもたらしています。したがって、この協会は、動物研究の複数の側面、特に腫瘍学と麻酔の分野について、全国レベルでの動物ケアを標準化するための推奨事項を設定しました14。今後、ほとんどの管轄当局と国の倫理委員会は、これらの推奨事項に対する動物プロトコルの遵守を強制します。GV-SOLASは、ほとんどのアプリケーションルートの最大ボリュームに関する推奨事項を持っています。静脈内注射の場合、最大5 mL / kg体重が推奨されます。25 gのマウスの場合、これは150 μLに相当します。このため、すべての放射性トレーサーの生産は、動物あたり最大注入量150μLに設定されています。静脈内注射時にこのしきい値を超えると、血液量増加によって引き起こされる急性心不全のリスクが高まります。.このしきい値を超える静脈内注射を繰り返すと、流速に応じて各注射が軽度の肺水腫を引き起こすため、肺線維症のリスクが増加します。.この論文で提示されているマウスIVのヒト同等物は、75kgのヒトに対して合計375mLのボーラス(10秒以内)に静脈内注射することです。標準的な臨床治療では、500 mLの0.9%NaCl溶液を1時間にわたって投与します。これは、合併症を避けるために、375mLを45分以上投与することを意味します。

GV-SOLASは、腫瘍負荷が5%を超えないように推奨しています。動物が治療を受けている場合、負担は最大10%22まで延長される場合があります。治療群と未治療群との間のこの違いは、特に生存の場合、治療された腫瘍マウスが求心性対照群よりも高い腫瘍量を達成する可能性があるため、研究バイアスを生み出す可能性があります。このようなケースを避けるためには、治療動物の5%の腫瘍負荷も固定すべきである。しかし、これは、いわゆる人道的エンドポイントに到達する前に研究動物を殺すことに対する倫理的ジレンマにつながるか、または(できれば)求心性対照群の場合の10%への増加は、バイアスを避けるために倫理的に根拠があると主張する可能性があります。

腫瘍量は非侵襲的に毎日計算する必要があるため、補正係数(0.82)を適用して、毎日計算される腫瘍体積を腫瘍重量に変換します。この係数は、プロトコルに従って動物が殺される前にデジタルキャリパーを使用して腫瘍の直径を測定し、その後、スケールを使用して実際の腫瘍重量を測定することによって計算しました。この補正係数は、測定された腫瘍体積には皮膚も含まれるため、腫瘍組織の密度とは異なります。したがって、測定された腫瘍体積は実際の腫瘍体積よりも大きいため、この係数はおそらく< 1.0です。私たちが体重を量った腫瘍は比較的大きかったため、評価は実験の最終日に行われたため、この要因は確かに小さな腫瘍の重量を過大評価しています。腫瘍負荷の評価にのみ使用すべきです。

GV-SOLASの推奨事項の別の側面は、マウスの場合、15mmの固定腫瘍直径が人道的なエンドポイントとして設定されていることである17。多くの場合、腫瘍細胞を含む溶液の後に空気や栓が注入されない場合、腫瘍は皮下注射によって作られた針管に沿って急速に成長する傾向があります。したがって、15mmは特定のアプリケーションルートにより速く到達します。経験的には、一部の腫瘍は楕円形に成長するため、上記の腫瘍体積式を適応させて使用し、異なる適用経路間で偏りのない比較を行いました。

私たちが使用する動物モデルは、ARRIVE17 およびPREPARE18 のガイドラインに従って設計されており、実験的な再現が容易です。腫瘍の増殖速度はマウスによって異なるため、モデルはある程度のばらつきがあり、標準化と解釈の取り扱いが難しくなります。しかし、これらの変動は、がん患者に存在する腫瘍内および腫瘍間の不均一性を反映しています23。

このプロトコルには制限がないわけではありません。動物は注射中、特にPET / CTスキャン中に鎮静剤を投与する必要があります。鎮静、特にイソフルランによる鎮静は血流に影響を及ぼし、動物は低体温になる可能性があるため、加熱マットの使用と鎮静の深さの監視が必要になります。この問題は、起きている動物をスキャンすることで回避できます。ただし、これには専用の社内ソフトウェアと専門知識が必要であり、多くの場合、それらは利用できません。

もう一つの制限は放射線量です。動物が受ける線量は1回のスキャンではごくわずかですが、複数回のスキャン(特に10回を超える場合)を実行すると、累積線量が大幅になり、腫瘍の成長に影響を与える可能性があります。腫瘍の成長が読み取られるパラメータである場合、比較可能なグループを確保するためには、すべての動物が同じ数のスキャンと線量を受けることが不可欠であり、プロジェクト全体の作業負荷が増加します。PET/CT装置の代わりにPET/MRI装置を使用すると、放射線被ばくを減らすことができる。ただし、このアプローチには、スキャン時間が長くなり、追加コストがかかり、解剖学的情報を取得する方法が異なります。

ドイツのGV-SOLASなどの福祉団体からの推奨に従い、ARRIVEやPREPAREなどの確立されたガイドラインに従うことで、動物モデルの標準化と実験プロトコルのばらつきの最小化に努めています。これらの取り組みは、前臨床試験の信頼性と再現性を確保するために重要であり、最終的には有望な放射性医薬品のベンチからベッドサイドへの翻訳を容易にします。

開示事項

FMMは、NanoMab Technology Ltd.およびAdvanced Accelerator Applications (AAA) GmbHのメディカルアドバイザーです。最近では、NanoMab Technology Ltd.、Siemens、GE Precision Healthcare LLCから機関助成金を受けています。さらに、彼はCURIUMと介入研究契約を結んでいます。

謝辞

著者は、Susanne Allekotte の技術サポートに感謝しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
活動量計 ISOMED 2010Nuviatech Healthcare -
遠心分離機 MIKRO 185Andreas Hettich GmbH & Co. KG1203
エンドトキシン試験 Endosafe nexgen-PTSチャールズリバー-
ヒーティングブロック NANOCOLOR VARIO C2Macherey-Nagel919350
HPLCシステム、ラジオ検出器を含むKnauer &Raytest-
画像解析ソフトウェア Pmod 4.4 PMOD Technologies LLC-
小動物PET / CTシステムβ-CUBEおよびX-CUBEMolecubesNV-TLC
MiniGITA *Elysia-Raytest-
Materials
0.3 mm diameter PE10 tubefisher scientific22-204008
30G needleB |Braun4656300
遠心フィルター; 10 kDa MWCO, 0.5 mLMilliporeUFC501008
Chromatography Paper strip iTLC-SGAgilent TechnologiesSGI0001
Endotoxin Cartridge, 0.05 EU/ml sensitivity チャールズリバーPTS-2005
HPLCカラムBiosep SEC-s2000ノメネックスマイクロ
遠心チューブ(1.5 mL)エッペンドルフ0030125150
pHストリップ0.0 - 6.0Merck KGaA109531
pHストリップ0-14Merck KGaA109535
PS-H+ SPEカートリッジMacherey Nagel GmbH &;Co. KG731861
滅菌バイアル 10 mLALK Life Science SolutionsSEV100
Reagents
68Ge/68Ga-GeneratorNRF-iThembaLABS-Ammoniumacetate
Merck KGaA101116
クエン酸Merck KGaA
塩酸メルク KGaA320331
NaClメルク KGaAS9888
ナノボディ NM-02放射線薬 セラノスティクス-
P-SCN-BZ-DOTA-GAケマテックC115
トリフルオロ酢酸メルク KGaAT6508
超純水メルク KGaA
フェ100241101262

参考文献

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