方法論記事

マウスの閉経後骨粗鬆症の治療におけるXiaoyao錠剤の抗炎症効果に関する研究

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DOI:

10.3791/67051

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2024年8月23日

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1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Geriatric Orthopedics, Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, 3Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

この記事について

サマリー

閉経後の骨粗鬆症は、世界的な公衆衛生問題となっています。この研究の目的は、この状態に対する伝統的な漢方薬 Xiaoyao 錠剤の治療効果と関連メカニズムを調査することです。

要約

骨粗鬆症は、高齢者や閉経後の女性によく見られる代謝性疾患で、初期段階では明らかな症状はありません。この状態の後期では、患者は骨折しやすく、これは彼らの健康と生活の質に深刻な影響を与える可能性があります。平均寿命の世界的な増加により、骨粗鬆症は世界的な懸念事項となっています。Xiaoyaoの丸薬は以前、
うつ病の治療に使用されます。さらに、この薬剤はエストロゲン様活性を有すると考えられ、初期の骨芽細胞特異的マーカーであるALPと骨細胞外マトリックスの主成分であるCOL-1の発現に影響を与えました。Xiaoyaoピルは、マウスの閉経後骨粗鬆症(PMOM)への影響について評価されました。.Xiaoyao錠剤の各ハーブ成分のターゲット情報は、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology(TCMSP)データベースを通じてアクセスされました。GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBankなどのウェブサイトからの情報を使用して、CytoscapeおよびStringネットワークを通じてハーブ複合体の制御ネットワークを構築し、タンパク質相互作用を評価しました。マウスを卵巣摘出し、高用量と低用量のXiaoyao錠剤で治療し、これらを対照と比較しました。彼らの症状は、骨組織の免疫細胞化学によって評価されました。その結果、Xiaoyaoピルは、IL-17シグナル伝達経路を通じて卵巣摘出マウスのPMOMの症状を緩和する能力があることが示唆されました。この薬剤は、骨粗鬆症の治療のための新しい治療薬になる可能性を秘めています。

概要

世界保健機関(WHO)は、骨粗鬆症(OP)を骨量の減少と骨組織の微細構造の悪化を特徴とする疾患と定義しており、骨の脆性が増大し、骨折リスクが増加します1。骨粗鬆症の臨床的意義は、骨折を引き起こす可能性があることであり、これは高い死亡率、罹患率、および経済的コストに関連しています2。閉経後骨粗鬆症(PMOP)は、閉経後の女性のエストロゲンレベルの低下によって引き起こされ、破骨細胞の活性が増加し、骨量の減少と骨の微細構造の破壊をもたらします。これはしばしば骨粗鬆症を引き起こし、健康に深刻な影響を及ぼします3。PMOP の現在の治療法には、エストロゲン補充療法、ビスフォスフォネート、副甲状腺ホルモンなどがありますが、さまざまな程度の副作用、不十分な長期コンプライアンス、および高コストが発生する可能性があります4。したがって、手頃な価格の漢方薬は、人口の大部分にとって実行可能な代替手段です。

Xiaoyaoの丸薬は中国の薬局方5に含まれており、これらはChai Hu、 Angelica sinensis、 White paeonia lactiflora、 Atractylodes macrocephala、 Poria cocos、 Menthae Herba、甘草、新鮮な生姜を含む8つのハーブ成分を含んでいます。これらのハーブはすべて、肝臓の解毒と脾臓の強化、血液の栄養補給、月経周期の調節に効果的であることが知られており、この混合物はうつ病の治療にも使用されています6。しかし、骨粗鬆症におけるXiaoyao錠剤の役割は不明です。

初期の研究では、炎症が骨量減少につながることがあり7、このプロセスに関連する骨密度の低下は閉経によって加速される可能性があることが示唆されています。さらに、骨粗鬆症の発症と炎症との間には強い関係があります。炎症因子であるインターロイキン-17(IL-17)は、CD4+ Tリンパ球のサブセットであるTh17細胞によって分泌される炎症誘発性因子です。これらの細胞はいくつかの慢性炎症性疾患と関連しており、関節リウマチ8の骨破壊の進行に重要な役割を果たしています。さらに、IL-17は、破骨細胞形成を調節する核因子-κBリガンド受容体活性化因子(RANKL)を刺激し、骨形成よりも骨吸収が大きくなります9。IL-17は、TNFα、IL-1、IL-6、IL-8などの他の破骨細胞誘発性サイトカインの発現を刺激します。それは他の炎症性因子と相乗作用する能力を持っているため、重要な炎症性エフェクター10になります。

また、小紗丸薬と炎症との関連性が研究で示されています。Shi et al.11 と Fang et al.12 は最近、Xiaoyao 錠剤がそれぞれ IL-6 と TNF-α のレベルを下げることができることを確認しました。代謝関連脂肪性肝炎の別の研究では、Xiaoyao錠剤がプロピオン酸の発現をアップレギュレートし、それがTNF-αの発現を阻害し、抗炎症効果を発揮することが報告されました13。しかし、現在のところ、XiaoyaoピルがIL-17を介した炎症反応を媒介することによりPMOMの発症を調節できるかどうかは不明です。

この研究では、ネットワーク薬理学とバイオインフォマティクス分析を通じて、Xiaoyao錠剤のターゲットと骨粗鬆症関連遺伝子の交差を予測し、タンパク質相互作用、GO、およびKEGGの交差遺伝子を分析しました。予測された結果に基づいて、IL-17シグナル伝達経路の主要なタンパク質であるAct1およびIL-6の発現を観察することができ14,15、ならびに骨代謝回転マーカーであるアルカリホスファターゼ(ALP)およびI型コラーゲン(COL-1)を観察することができ、PMOMマウスモデルにおけるXiaoyao錠剤の治療効果を観察することができる。

プロトコル

Youjiang Medical University for Nationalitiesの実験動物倫理委員会は、研究プロトコルを承認しました(承認番号:2022101502)。雌のC57BL/6マウス、10-12週齢、SPFクラスおよび体重(22 ± 2)gを、Youjiang Medical University for NationalitiesのSPFクラス動物実験センターに収容しました。実験動物は、温度24〜26°C、相対湿度55〜60%に維持されました。

1. 伝統的な漢方薬システム薬理学データベースと分析プラットフォーム

注:Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(TCMSP;https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)は、TCM成分、ADME関連の特性、標的、および疾患に関する情報を含む漢方薬理学プラットフォームです16,17。

  1. TCMSP Web インターフェイスにアクセスします。ハーブの名前を検索し、漢方薬の名前を入力して、[ 検索]をクリックします。検索結果の 「Latin Name 」をクリックします。パラメータOB≥30%およびDL≥0.18で成分の結果に対してスクリーニングを実行します。
  2. すべての結果をコピーして、漢方薬という名前のTXT形式で保存Name_ingredients.txt。
  3. 「Related Targets」タブの「Targets Information」で、「Mol ID」をフィルタリングします(つまり、ステップ1.2の結果)。
  4. フィルタリングされた結果をコピーし、Chinese Medicine Name_targets.txtという名前のTXT形式で保存します。
    注:上記の手順を通じて、すべての適格な有効成分と伝統的な漢方薬(TCM)の対応する標的情報が得られました。
  5. 上記のingredients.txtファイルとtargets.txtファイルをすべて同じフォルダに配置し、Perlスクリプト(Supplementary Coding File 1)をそのフォルダに配置します。
  6. CMDを開き、cdフォルダのパスを入力して入力し、Perlスクリプトを実行します。新しいテキスト ファイル (allTargets.txt) を取得します。この新しいテキスト ファイル (allTargets.txt) には、ハーブ名、成分名、成分 ID、およびターゲットが含まれています。

2. UniProtデータベース

注:UniProtデータベース(https://www.uniprot.org/)には、機能情報で注釈が付けられたヒトタンパク質配列が含まれており、ターゲットの名前を正式名称に正規化するために使用されます18。

  1. UniProtのWebインターフェースに移動します。 「検索 」タブをクリックし、「 UniProtKB」を選択して「 検索」をクリックします。
  2. 左側のサイドバーでフィルターを選択し、[ステータス]に [レビュー済み(Swiss-Prot)] を選択し、[人気のある生物]に [人間 ]を選択します。 「ダウンロード」をクリックし、「 すべてダウンロード」を選択し、「フォーマット」で 「TSV 」を選択し、「 ダウンロード 」をクリックしてアノテーションファイルをダウンロードします。
  3. ダウンロードしたファイルを現在のフォルダに解凍し、解凍したファイルを開き、コピーしてann.txtという名前のテキストファイルに貼り付けます。

3. 薬剤ターゲットIDの変換

  1. セクション1で取得した薬剤ターゲットファイルallTargets.txt、セクション2で取得したUniProtアノテーションファイルann.txt全てフォルダに入れ、その中にPerlスクリプト(Supplementary Coding File 2)を入れてください。
  2. CMDを開き、cd + space +フォルダパスを入力して入力し、Perlスクリプトを実行して新しいテキストファイル(allTargets.symbol.txt)を取得します。この新しいテキストファイル(allTargets.symbol.txt)には、ハーブ名、成分ID、成分名、および遺伝子IDが含まれています。

4. データベース検索

  1. GeneCards: ヒト遺伝子データベース(GeneCards)データベース
    注:GeneCardsデータベース(https://www.genecards.org/)は、ヒト遺伝子の予測およびアノテーション情報を提供します。これは、疾患ターゲット19,20にアクセスするために使用されます。
    1. GeneCardsのウェブインターフェースに移動します。検索ボックスに「骨粗鬆症」と入力し、[ 検索] をクリックします。
    2. [エクスポート] をクリックし、[Excel にエクスポート] を選択します。
    3. ダウンロードしたファイルを開き、関連性スコアが ≥1 の遺伝子をコピーし、GeneCards.txt という名前のファイルに貼り付けて保存します。
  2. OMIM データベース
    注:OMIMデータベース(https://omim.org)には、ヒトの遺伝子、遺伝病、および形質が含まれています21。
    1. OMIM Web インターフェイスに移動します。 GENE Mapをクリックし、検索ボックスに「骨粗鬆症」と入力して、[ 検索]をクリックします。
    2. 「 名前を付けてダウンロード 」をクリックし、「 Excel ファイル」を選択します。
    3. ダウンロードしたファイルを開き、Approved Symbol列の遺伝子名をコピーして貼り付け、OMIM.txtという名前のファイルに保存します。
  3. PharmGkbデータベース
    注:薬理ゲノミクスの知識ベースであるPharmGkb(https://www.pharmgkb.org)には、薬物ラベルの注釈、薬物中心の経路、薬理遺伝学的要約、および遺伝子、薬物、および疾患間の関係が含まれています22。
    1. PharmGkb Webサイトのインターフェースに移動します。検索ボックスに「骨粗鬆症」と入力し、「 検索」をクリックして、左側のサイドバーで 「Gene 」にチェックを入れます。
    2. すべての結果を手動で入力し、PharmGkb.txt というファイルに保存します。
  4. TTD:Therapeutic Target Database(TTD)データベース
    注:TTDデータベース(https://idrblab.org/ttd/)は、タンパク質および核酸標的、標的疾患、経路情報、および各標的23に対応する薬物に関する情報を提供する。
    1. TTDに移動します web インターフェース。検索ボックスに「骨粗鬆症」と入力し、[ 検索] をクリックします。
    2. 結果の「ターゲット ID」の下の 「ターゲット情報 」をクリックし、「ターゲット名」をコピーして貼り付け、TTD.txtという名前のファイルに保存します。合計33件の結果が得られました。各結果を同じ方法で保存します。
  5. DrugBank Online (DrugBank) データベース
    注:DrugBankデータベース(https://go.drugbank.com)には、薬物および薬物標的、薬物相互作用、薬物メカニズム、および薬物代謝に関する情報が含まれている24。
    1. DrugBank の Web サイトのインターフェースに移動します。検索タブで 適応症 を選択し、検索ボックスに骨粗鬆症と入力して、 検索をクリックします。
    2. 詳細については、結果の 「骨粗鬆症 」の項目をクリックし、「 DRUGS AND TARGETS」 タブをクリックし、表の「TARGET」列の 「適切なリンク 」をクリックしてください。
    3. 「Protein」の「Details」をクリックし、「Gene Name」をコピーして貼り付け、「DrugBank.txt」という名前のファイルに保存します。各結果を同じ方法で保存します。

5. ベン図

    6. TCMコンパウンドのレギュレーションネットワークの構築

    1. セクション3で取得したallTargets.symbol.txtファイルを、Disease.txtファイルおよび対応するPerlスクリプト(Supplementary Coding File 3)と同じフォルダに配置します。
    2. CMDを開き、cdファイルのパスを入力してEnterキーを押し、Perlスクリプトを実行します。4 つの新しい txt ファイル(net.geneLists.txt、net.molLists.txt、net.network.txt、net.type.txt)を取得します。network.txtファイルには、TCM成分ID、ターゲット遺伝子、ターゲット関係、および成分名が含まれています。net.type.txt ノード名、属性、および所属が含まれています。net.geneLists.txtは遺伝子のリスト、net.molLists.txtは成分のリストです。
    3. 新しく取得したテキストファイルを同じ新しいフォルダにコピーします。
    4. Cytoscape 3.9.1 ソフトウェアを開き、[ ファイル]、[ インポート]、[ ネットワーク フォーム ファイル] の順にクリックします。 「net.network.txt」を選択し、「Component ID」の最初の列を「Source Node」として、「Genes」の2番目の列を「Target Node」として、「Targeting Relationship」の3番目の列を「Interaction Type」として入力し、「 OK」をクリックします。
    5. 「ノード・テーブル」ウィンドウからnet.type.txtをインポートします。 「選択」タブをクリックし、「 ノード」を選択し、「 ID リスト・ファイルから」を選択し、「 net.geneLists.txt」を選択して 、「開く」をクリックします。
    6. [レイアウト] タブをクリックし、[次数で並べ替えられた円のレイアウト] を選択し、[選択したノードのみ] を選択します。ノードの高さと幅の両方を 70 に調整します。
    7. [高さ] の 2 番目のボックスをクリックし、[列] で degree.layout を選択し、[マッピングの種類] で [連続マッピング] を選択し、[現在のマッピング] の右側にある [高さ調整ウィンドウ] をダブルクリックして、高さの上限と下限を適切な範囲に調整します。
    8. [幅] オプションで操作を繰り返します。
    9. [レイアウト] タブをもう一度クリックし、[レイアウト ツール] をクリックして [レイアウト ツール] をクリックし>ノードが重ならないようにスケールを調整します。
    10. ソフトウェアの 右上のウィンドウ をクリックしてノードネットワークのチェックを外し、[ 選択 ]タブをクリックして[ ノード]を選択し、[ IDリストから]ファイルを選択し、[ net.molLists.txt]を選択して、[ 開く]をクリックします。
    11. 「レイアウト」タブをクリックし、「グループ属性レイアウト」を選択し、「選択したノードのみ」を選択して、「タイプ」をクリックします。
    12. 左の列で 「ラベルのフォントサイズ 」をクリックし、「デフォルト値」を12に設定します。左の列にある[画像/グラフ1の デフォルト値 ]をクリックします。
    13. ポップアップウィンドウで [チャート ]を選択し、[ 円グラフ]をクリックして、[使用可能な列]列で学位を除く アイテム を選択します。選択した列列にレイアウトし、[ 適用] をクリックします。
    14. 左側の列にある [Border Paint ]をクリックし、[Default Value]を #003EF8 に設定します。左側のサイドバーの下部にある [エッジ ]タブをクリックし、[幅]を0.8に設定します。
    15. 上部のツールバーの「ファイル」をクリックし、「 エクスポート」を選択してから、「 ネットワークからイメージへ」を選択します。
    16. ポップアップウィンドウで、[ フォーマット]に[PNG形式]を選択し、 保存ディレクトリを選択して画像ネットワークに名前を付け、[ズームイン画像サイズ]を最大500%に調整し、[ 透明な背景]を選択し、[ OK ]をクリックして画像の保存を終了します。

    7. タンパク質間相互作用ネットワーク(PPI)コンストラクト

    1. STRING Web サイト (https://string-db.org/) を開き、[Multiple Protein] をクリックし、[Upload a file] で [Browse ] をクリックし、手順 5.2.3 で取得した Drug_Disease.txt ファイル を選択し、[ Homo sapiens in Organisms] を選択します。 「検索 」をクリックし、「 続行」をクリックします。
    2. [設定] をクリックし、必要最小限のインタラクション スコアを最も高い信頼度 (0.900) に設定し、ネットワーク表示オプションで [ネットワーク内の切断されたノードを非表示にする] をオンにします。「更新」をクリックします。
    3. ネットワーク図内のノードを調整して、オーバーラップやオクルージョンが発生しないようにします。
    4. 「エクスポート」をクリックし、「高解像度ビットマップとしてダウンロード」をクリックして、PNG形式のタンパク質インターワーキングネットワークマップを取得します。また、TSVファイルを短い表形式のテキスト出力としてダウンロードします。両方のファイルを統合フォルダに保存します。TSVファイルには、遺伝子名、STRING内部ID、およびさまざまな属性のスコアが含まれています。

    8. PPIネットワークコアの構築

    1. セクション 7 で取得した TSV ファイルと必要な Perl スクリプトを新しいフォルダに配置します。
    2. Cytoscape 3.9.1ソフトウェアを開き、[ ファイル]をクリックし、[ インポート]を選択し、[ ファイルからネットワーク]をクリックし、[ 上記のTSVファイル]を選択し、最初の列node1をソースノードとして、2番目の列node2をターゲットノードとして配置し、[ OK]をクリックします。
    3. 左側のサイドバーで [スタイル ] をクリックし、[幅] の [デフォルト値 ] をクリックして 60 に設定します。ノードをドラッグアンドドロップして、ネットワークにオーバーラップやオクルージョンがないようにします。
    4. 上部のツールバーの [APPs ]をクリックし、[ CytoNCA]をクリックして、[ Open]をクリックします。
    5. 左側の列で、[媒介]、[近接]、[次数]、[固有ベクトル]、[局所平均接続性ベースの方法]、および[ネットワーク]で [重みなし ]を選択し、[ 分析]をクリックします。
    6. 分析が完了したら、右下のウィンドウで [Node Table ]をクリックし、[ Export]をクリックしてフォルダに保存し、スコア1という名前を付けます。
      注:CytoNCAプラグインは、Cytoscapeソフトウェアにインストールする必要があります。これを行うには、上部のツールバーの [アプリ ]をクリックし、[ APPマネージャー ]をクリックして、検索ボックスに「CytoNCA」と入力し、返された結果の中央列にある [CytoNCA ]をオンにして、[ インストール]をクリックします。
    7. score1 を開き、name 列を最初の列に調整し、テーブル内の情報をコピーして新しいテキスト ファイルに貼り付け、score1.txt という名前を付けて保存します。
    8. Rコードを開き、score1.txtファイルがあるパスをコピーして、Rコードでsetwdがある行に貼り付けます。
    9. Rソフトウェアを開き、変更したコードを実行して、score2.txtとscore2.gene.txtの2つの新しいファイルを取得します。score2.txtファイルには、すべてのプログラムスコアが中央値よりも大きかった遺伝子と、各プログラムの特定のスコアが含まれています。score2.gene.txtには、すべての項目で中央値よりも高いスコアを獲得した遺伝子が含まれています。
    10. Cytoscape で続行するには、右下のウィンドウで [AnalysisPanel 1 ] をクリックし、ウィンドウの左側にある [ ファイルからアップロード ] をクリックして score2.gene.txtを選択し、[ 開く] をクリックし、ポップアップウィンドウで [OK ] をタップします。
    11. 下部にある 「ノードの選択」 をクリックし、ポップアップ・ウィンドウで 「OK 」をクリックします。
    12. 上部のツールバーの [ファイル ]をクリックし、[ エクスポート]を選択し、[ ネットワークから画像]をクリックし、[画像サイズ]の[ズーム（%]を最大500%に調整したり、[ 透明な背景]をオンにしたり、ファイルを同じフォルダに保存して、network1という名前を付けます。
    13. 下部ウィンドウの右側のサイドバーにある [サブネットワークの作成 ]をクリックしてサブネットワークを作成し、サブネットワークを解析し、上部のツールバーの [APPs ]をクリックし、[ CytoNCA ]をクリックして [Open]をクリックします。
    14. 左側のサイドバーで、[媒介]、[近接]、[次数]、[固有ベクトル]、[ローカル平均接続性ベースの方法]、および[ネットワーク]で [重みなし ]を選択し、[ 分析]をクリックします。
    15. 解析が完了したら、右下のウィンドウで 「ノードテーブル 」をクリックし、「 エクスポート」をクリックして、score2 という名前の新しいフォルダに保存します。
    16. score2 を開き、name 列を最初の列に調整し、テーブル内の情報をコピーして新しいテキスト ファイルに貼り付け、score2.txt という名前を付けて保存します。
    17. Rコードを開き、score2.txtファイルがあるパスをコピーして、Rコードでsetwdがある行に貼り付けます。
    18. R ソフトウェアを開き、変更したコードを実行して、score3.txt と score3.gene.txt の 2 つの新しいファイルを取得します。score3.txtファイルには、すべての項目の中央値よりもスコアが高かった遺伝子と、各項目の特定のスコアが含まれています。score3.gene.txtには、すべての項目で中央値よりもスコアが高かった遺伝子が含まれています。
    19. Cytoscape で続行するには、右下のウィンドウで [AnalysisPanel 1 ] をクリックし、ウィンドウの左側にある [ Upload From File ] をクリックして score3.gene.txtを選択し、[ 開く] をクリックし、ポップアップウィンドウで [OK ] をタップします。
    20. 下部にある 「ノードの選択」 をクリックし、ポップアップ・ウィンドウで 「OK 」をクリックします。
    21. 上部のツールバーの [ファイル ]をクリックし、[ エクスポート]を選択し、[ ネットワークから画像]をクリックし、[画像サイズのズーム（%]を500%に調整したり、[ 透明な背景]をオンにしたり、この手順で使用したフォルダと同じフォルダにファイルを保存して、network2という名前を付けます。
    22. 下のウィンドウの右サイドバーにある「 サブネットワークを作成 」をクリックして、サブネットワークを作成します。
    23. 上部のツールバーの [ファイル ]をクリックし、[ エクスポート]を選択し、[ ネットワークから画像]をクリックし、[画像サイズのズーム(%)]を最大500%に調整し、[ 透明な背景]をオンにして、この手順で使用したのと同じフォルダにファイルを保存し、ネットワーク3という名前を付けます。

    9. 遺伝子ID変換

      10. GOエンリッチメント分析

      1. 前の手順でid.txtしたファイルを、GO エンリッチメント分析コードと同じフォルダーに配置します。
      2. Rコード(Supplementary Coding File 5)を開き、作業ディレクトリをid.txtに設定し、GOコードが格納されているパスを設定します。
      3. R ソフトウェアを開き、変更したコードを実行して、clusterProfiler、org.Hs.eg.db、プロット、ggplot2 プロット、GO エンリッチメント分析ヒストグラム、およびバブル プロットをエンリッチします。実行の完了後に、GO.txt、barplot.pdf、bubble.pdf の 3 つの新しいファイルを取得します。
        注:GO.txtは、濃縮分類(BP、CC、MF)、GO ID、GO名、遺伝子比率、バックグラウンド比率、濃縮意義p値、補正p値(p.adjust、value)、遺伝子ID(名前)、および各GOで濃縮された遺伝子の数を含む濃縮結果ファイルです。barplot.pdfはヒストグラム、バブルです。PDFはバブルプロットです。

      11. KEGG濃縮分析

      1. id.txtファイルをKEGGエンリッチメント解析コードと同じフォルダに配置します。
      2. Rコード(Supplementary Coding File 6)を開き、作業ディレクトリをid.txtとKEGGコードが格納されているパスに設定します。
      3. R ソフトウェアを開き、変更したコードを実行して、clusterProfiler org を使用します。Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2 GO エンリッチメント分析ヒストグラム、バブル プロット、およびパスウェイ プロットをプロットするパッケージ。実行は、KEGG.txt、barplot.pdf、bubble.pdf の 3 つの新しいファイルの生成で完了します。
        注:KEGG.txtファイルは、パスウェイID、パスウェイの説明、遺伝子比率、バックグラウンド比率、濃縮意義p値、補正p値(p.adjust、qvalue)、遺伝子ID(名前)、および各パスウェイで濃縮された遺伝子の数を含む濃縮結果ファイルです。barplot.pdfは棒グラフ、bubble.pdfはバブルチャートです。
      4. KEGG.txtファイルでIL-17を検索します。結果は、経路が1つしかないことを示しています。パスウェイIDをコピーします。
      5. R コードを開き、IL-17 パスウェイ ID を KEGGID に貼り付け、pathview パッケージを使用してパスウェイマップにラベルを付けます。変更した R コードを実行すると、hsa04657.pathview.png と hsa04657.png の 2 つの新しいファイルが表示されます。
        注:hsa04657.pngファイルはパスウェイマップ、hsa04657.pathview.pngはラベル付きパスウェイマップ、赤でラベル付けされたものはインタラクションネットワークに存在する遺伝子です。

      12. Xiaoyao丸薬の準備

      注:使用した調製方法については、中国薬局方5を参照してください。

      1. チャイフー100g、 アンジェリカシネンシス100g、シ ロシャクヤク100g、ア トラクティロデスマクロセファラ炒め100g、 ポリアココス100g、 プレパラディックスグリチルリザエプレパラ 80g、 メンタエハーブ20gを取ります。
      2. 石臼または粉末化機を使用して、ハーブを微粉末に粉砕します。いくつかのハーブを上記の割合で組み合わせ、微粉末に粉砕して自然に混ぜ合わせます。内径180μm±7.6μmの80メッシュの薬剤ふるいを使用し、粉砕した粉末をふるいにかけます。よく混ぜます。
      3. 生姜100gを取り、水を加え、毎回2回20分間沸騰させます。濾して脇に置きます。
      4. 薬用プラークを取り、小さなほうきを生姜水に浸し、プラークにブラシをかけ、上記の粉末を取り、生姜水に振りかけ、プラークを回してすべての粉末が濡れてボール状に成形できるようにします。
        注:薬用プラークの形成は、TCMピルの調製中に不可欠なステップです。孟宗竹のほとんどは短冊状に分割され、スケルトンに織り込まれます。竹の皮、またはテンピが表面に織り込まれ、丸みを帯びます。プラークの表面は桐油で薄くコーティングし、次にニスの層でブラッシングする必要があります。これを乾燥させて水密にします。このようにして作られた丸薬は丸くて滑らかになります。
      5. 生姜水を再度ブラッシングし、粉末を振りかけ、薬剤が徐々に丸みを帯びて拡大するようにプラークを回転させます。涼しい場所に置いて乾燥させます。

      13. 動物モデルの構築

      1. 7日間の順応後、実験マウスを無作為に4つのグループ、すなわち偽手術グループ(偽、卵巣の周りの脂肪のみが除去されたグループ)とモデルグループ(OVX)からなる卵巣摘出マウスの3つのグループ、および低濃度および高濃度のXiaoyao錠剤投与グループ。
      2. 腹腔内に注射された3%ペントバルビタールナトリウム(40 mg / kg)でマウスを麻酔します。.マウスが全身の筋弛緩、深くゆっくりとした呼吸、ゆっくりとした動きを観察して、マウスが麻酔状態に入ることを確認します。手術前にマウスの目に眼軟膏を塗布します。
      3. 動物を腹臥位に置き、動物のシェーバーで背中の腎臓領域を剃ります。75%エタノールで局所消毒を行います。
      4. 腎臓の背側領域に近い両側に約1cmの縦切開を行い、筋膜を切開して筋肉と腹膜を分離します。
      5. 結紮のために子宮角の上部と卵管を見つけます。探索のために切開部に鉗子を挿入し、脂肪組織によって真っ赤なカリフラワーパターンで包まれた卵巣を見つけ、卵巣の下にらせん状に配置された卵管で卵巣を子宮角に接続します25。手術用ハサミと縫合糸で卵巣を摘出します。
      6. 偽手術群のコントロールとして卵巣近くの少量の脂肪組織を切除します。動物が意識を取り戻すまで観察してください。術後動物を完全に回復するまで別々のケージに入れます。
      7. 感染を防ぐために、術後3日間マウスにゲンタマイシンを投与します。手術後は、マウスの実際の状態に応じて、通常の食事と良好な成長環境を確保してください。創傷感染や食欲不振などの異常がある場合は、すぐに実験動物センターの指導員に相談してください。

      14. 薬の投与

      注:薬理学実験方法論26によると、使用されたヒトと動物の投与量の変換は、70 kgの成人に対して9 gのXiaoyao錠剤であり、これは1回の投与量(1回の投与の投与量)に相当します。.

      1. 低用量群と高用量群では、8匹の動物群に対してそれぞれ0.683 g/kgと2.73 g/kgを使用します。左手を使ってマウスを固定し、マウスの口が食道と一直線になるようにします。強制針を右手に持ち、マウスの口角から咽頭の後壁に沿って食道にそっと挿入します。
      2. この時点で、強制針の方向をわずかに変更して、誘発された嚥下作用を刺激してもよい。薬を注射します。これを12週間、毎日1回行います。
      3. 偽のグループとモデルグループでは、動物の体重によって決定される量で生理食塩水を1日1回、12週間投与します。
      4. マウスを頸部脱臼で安楽死させ、後肢をクリップします。手足の皮を剥いで、筋肉を大腿骨から分離します。マウスの大腿骨をEDTA脱灰液で1ヶ月間治療し、毎日新しい溶液と交換します。

      15. ヘマトキシリン-エオシン染色(HE)染色

      1. 大腿骨組織を8分間脱ワックスし、次に3分間グラジエントエタノールに入れます。流水で1分間すすいでください。
      2. ヘマトキシリン染色液を切片に滴下して組織を完全に覆い、5分間染色し、水道水で洗浄します
      3. スライド上の組織に塩酸分化溶液を加え、組織を完全に覆うようにします。組織の変色が観察されたら停止します。水道水ですすいでください。
      4. エオシン色素溶液を滴下し、組織を完全に覆い、30秒から2分間作用させます。余分な染料を流水ですすいでください。
      5. 75%無水エタノールで5分間グラジエントエタノール脱水を行い、続いて無水エタノールで5分間、脱ロウ溶液で3分間透明にします。
      6. 組織のサイズに応じて適量の中性ガムをスライドに落とし、気泡を避けてカバースリップを慎重に下げます。

      16. マイクロCTおよび免疫組織化学解析

      1. 異なるマウス群の大腿骨標本の周囲の余分な筋肉と靭帯を取り除き、サンプル組織を4%パラホルムアルデヒドに24時間固定します。
      2. 骨組織を空気乾燥させ、骨組織スキャンによるマイクロCTを行うことで、立体的なマイクロCTデータを取得します。
      3. 保存したマウスワックスブロックから、厚さ6μmの連続切片に切断し、スライスを70°C〜72°Cで30〜60分間焼きます。
      4. 8分間脱ろうし、続いて75%無水エタノール処理を5分間、無水エタノールを5分間、PBSリンスを5分間3回行います。
      5. EDTA高圧修復を15分間行い、続いてPBS洗浄を5分間3回行います。
      6. 3%の過酸化水素を組織に滴下し、室温で10分間インキュベートし、PBSで5分間3回洗浄します。
      7. 免疫組織化学ペンを使用して円を描きます。PBSウォッシュで3分間3回洗浄します。
      8. 一次抗体(抗ALPウサギpAb(1:200)、抗COL-1ウサギpAb(1:200)、抗IL-17ウサギpAb(1:275)、抗Act1(1:500)、抗IL-6ウサギpAb(1:500))を一晩染色した後、PBSバッファーを5分間3回すすぎます。
      9. 二次抗体(HRP標識Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L; 1:2000))を滴下し、室温で60分間インキュベートします。PBSバッファーで3分間3回洗浄します。
      10. すぐに使用できるDABで3〜5分間インキュベートし、PBSですすいでください。
      11. ヘマトキシリンを3分間再染色した後、PBSリンスを行います。
      12. 分化液を約10秒間使用し、続いてPBSリンスします。
      13. リターンブルー溶液を10秒間加え、続いてPBSリンスを加えます。
      14. 75%無水エタノール処理を5分間、無水エタノールを5分間、透明化して3分間行う。スライドのシールには中性樹脂を使用してください。

      結果

      Xiaoyaoの丸薬の有効成分と作用のターゲット
      TCMSPデータベースを検索し、経口バイオアベイラビリティ(OB)≥30%、薬物様特性(DL)≥0.18の基準に従ってスクリーニングを行ったところ、Xiaoyaoの錠剤に125の有効成分が存在することがわかりました。その中で、成分6、4、9、13、2、6、83、および2は、それぞれWhite Paeonia lactiflora、 Atractylodes macrocephala、 Menthae herba、Chaihu、 Angelica sinensis、 Poria cocos、甘草、生姜からのものでした。有効成分の一部を 表1に示します。また、TCMSPデータベースから有効有効成分のターゲットは合計879個取得され、ID変換や重複値の削除後も232個のターゲットが残っていました。

      TCMのネットワーク分析 - 有効成分 - 交差するターゲット - 病気
      骨粗鬆症というキーワードを用いて、この疾患に関連する遺伝子について、いくつかのデータベースを検索した。GeneCardsデータベースでは、Relevanceスコア≥1に従ってフィルタリングした後、1692個の遺伝子が取得されました。OMIMデータベースでは、合計35の遺伝子が取得されました。PharmGkb、TTD、DrugBankのデータベースには、それぞれ3、33、386の遺伝子がありました。その後、これら5つのデータベースの結果の共通部分をさらなる分析に使用しました(図1A)。4つのデータベースで表されていた遺伝子の1つが CALCRでした。疾患関連遺伝子を組み合わせ、薬剤標的との交差をとった後、合計102個の交差する遺伝子が得られました(図1B)。疾患標的と薬物の有効成分との間の相互作用に基づいて、Cytoscapeソフトウェアを使用してTCM有効成分交差標的疾患ネットワークを構築しました。その結果、薬物の成分と疾患関連遺伝子スキャンの多型調節との間の関係が得られました(図2A)。

      Stringデータベースでは、疾患遺伝子と薬物標的の交点でタンパク質相互作用を解析し、それらの相互作用ネットワーク図を取得し(図2B)、次にこれらを最も中心的なタンパク質についてスクリーニングしました(図2C-D)。その結果、疾患遺伝子と薬剤標的の中で、FOS、ESR1、MAPK3、TP53、MAPK1、 およびSTAT3間の相互作用が最も強いことが示されました(図2E)。

      GO関数とKEGG経路エンリッチメント解析
      GO濃縮分析では、1990年の生物学的プロセス(BP)エントリ、58の細胞成分(CC)エントリ、および129の分子機能(MF)エントリを含む合計2177のエントリが示されました。BPでは、遺伝子は主に栄養レベルに対する応答、酸化ストレスに対する応答、および酸化ストレスに対する細胞応答に焦点が当てられていました。MFは、DNA結合転写因子の結合、RNAポリメラーゼII特異的なDNA結合転写因子の結合、核内受容体活性、リガンド活性化転写因子活性、およびサイトカイン活性に焦点を当てました(図3A-B)。

      KEGG経路濃縮解析では、合計168の関連するシグナル伝達経路が得られ、より有意なものは、AGE-RAGEシグナル伝達経路、IL-17シグナル伝達経路、TNFシグナル伝達経路、HIF-1シグナル伝達経路、およびTh17細胞分化でした(図3C-D)。Xiaoyaoピルは、複数の方法でPMOMに治療効果を発揮する可能性があることが示唆されています。.炎症は骨粗鬆症と強く関連しており、更年期障害によって加速される可能性があり、IL-17は重要な炎症因子です7。したがって、次の計画は、XiaoyaoピルがIL-17に関して炎症性の観点から骨粗鬆症を治療できるかどうかを調査することです。

      卵巣組織摘出前後の骨組織の構造変化
      HE染色により、偽マウスの大腿骨では、小柱が密集して配置されており、良好な連続性、小柱間の小さな隙間、まれな骨折、および骨髄腔の正常なサイズが示されました。シャム群と比較して、OVX群の大腿骨はまばらに配置されており、小柱の重度の骨折、連続性の破壊、骨髄腔の著しい拡大があり、典型的な骨粗鬆症の変化が見られました(図4A)。

      グループ間のマイクロCT比較
      OVX群のマウスの大腿骨は、シャム群のマウスと比較して、不完全な海綿網、部分的に空の骨髄腔、および骨皮質の菲薄化を示しました。マウスのShamグループは、骨梁が豊富で、連続性が良好で、大腿骨の骨髄腔が狭くなっていることを示しました(図4B)。

      マウスに対するXiaoyao錠剤の行動影響
      研究期間中、OVXグループを除く他のグループのすべてのマウスは、より良い生活習慣、正常な髪の色、高い可動性、および健康を持っていました。各マウスの尿と便は、Xiaoyao錠剤による治療後1週間以内に正常に戻りました。.マウスの咬傷、創傷感染、胃腸閉塞、縫合糸の剥離、切開部の皮膚壊死、死亡はありませんでした。OVX群のマウスは、脱毛、毛色の黒ずみ、運動性の低下、反射の延長、排泄の増加、飲食の減少が起こりやすかった。

      薬物介入後のマウスの病理切片のHE染色
      シャムグループでは、大腿骨組織は密集し、網状で、規則的に配置されていました。骨髄腔のサイズと連続性は正常であり、隣接する骨梁間の間隔は比較的小さかった。シャム群と比較して、OVX群の大腿皮質と海綿骨は、明らかな欠陥、小柱の減少、ギャップの増加、連続性の中断、構造の菲薄化、骨髄腔の拡大、および骨皮質の菲薄化を示しました。OVX群と比較して、薬物治療群(低用量および高用量)群のマウスの大腿骨梁は構造的に無傷で、間隔が狭くなり、接続性が増加し、骨髄腔が狭くなり、構造が密集しているように見えました(図5A)。

      薬物介入後のマウスにおけるイメージング指標の検出
      シャム群と比較すると、OVX群のマウスの大腿骨は骨柱がまばらで骨折し、骨皮質が薄くなっていました。OVX群と比較して、高用量のXiaoyao錠剤群のマウスは、骨梁の骨折が少なく、網状化が回復し、骨髄腔の部分的な縮小が有意に見られました。しかし、低用量のXiaoyao錠剤で治療されたマウスは、骨小柱の増加と骨髄腔の縮小があったにもかかわらず、骨小柱骨折が残っていました。偽手術群の骨小柱の小柱構造は、より連続性と完全性を示しました(図5B)。

      薬物介入後の群の組織の免疫組織化学的結果
      Act1とIL-6はIL-17シグナル伝達経路の重要なタンパク質であり、 ALP と COL-1 は骨形成遺伝子です。ALP、COL-1、IL-6、IL-17、およびAct1タンパク質の発現は、骨組織上に黄褐色または黄色の顆粒の形成につながります。免疫組織化学の結果は、Xiaoyao錠剤による治療後の薬剤群のALPおよびCOL-1の平均光学密度値がOVX群のそれらよりも高く、その差は統計的に有意であったことを示しました(p < 0.05)。薬剤群のIL-17、Act1、およびIL-6の平均光学濃度値はOVX群のそれらよりも低く、その差は統計的に有意でした(p < 0.05; 図6)。Xiaoyaoピルは、卵巣摘出術によるALPとCOL-1の減少を逆転させ、IL-17シグナル伝達経路におけるいくつかの重要なタンパク質IL-17、IL-6、Act1の発現を減少させ、この経路を通じて治療効果を発揮する可能性を示唆しています。

      figure-results-1
      図1:漢方薬の有効成分と疾患関連遺伝子の交差部分のネットワーク解析。(A) GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、およびDrugBankデータベースから取得した疾患関連遺伝子の交差。これらは、それぞれ1692、35、3、33、および386遺伝子を持つ青、赤、緑、黄、および茶色の色で表されます。交点は5つのデータベース内の疾患関連遺伝子であり、重なり合っている部分は各データベース内の交差する遺伝子の数を示しています。 (B) 創薬標的(青色は本データセット、すなわちID変換および重複除去後にTCMSPデータベースに収集された薬剤作用標的遺伝子のセット)と疾患関連遺伝子(赤色は本データセットを示し、上記5つのデータベースの全ての遺伝子を含む)の交差部分が示されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

      figure-results-2
      図2:TCMの有効成分と疾患関連遺伝子制御ネットワークおよびコアタンパク質との相互作用。(A)TCMの有効成分と疾患関連遺伝子の調節ネットワークは、Xiaoyao錠剤の各有効成分に対応する遺伝子調節関係を示しており、各成分はそれが調節する遺伝子にリンクされています。 (B)STRINGの交差遺伝子のタンパク質間相互作用解析結果(ネットワークノードはタンパク質、Edgesはタンパク質-タンパク質の会合、複数の連鎖は2つのタンパク質間の複数の相互作用を示す)。(C-E)Stringによって得られたタンパク質相互作用を数回スクリーニングしました。(C)タンパク質相互作用ネットワークは、最初のスクリーニング後に得られたものであり、強調表示された部分がそのコア部分です。(D)2回目のスクリーニングの結果と強調表示された部分がコア部分です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

      figure-results-3
      図3:GOとKEGGの濃縮分析。(A-B) 交差する遺伝子のGOエンリッチメント解析の結果は、Biological Process(BP)、Cellular Component(CC)、Molecular Function(MF)の3つのエントリーに分かれており、各エントリーには最も有意に濃縮された遺伝子の上位10個のみが表示されます。 (C-D) 交差する遺伝子のKEGG濃縮分析の結果(最も有意に濃縮された上位30個を表示)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

      figure-results-4
      図4:卵巣摘出マウスモデルの確立と評価。(A) 偽手術群と卵巣摘出群との間の骨幹端骨の形態の比較 (10x)。OVX群では、海綿骨折が重度で、連続性が乱れ、骨髄腔が著しく拡大したのに対し、偽群では、海綿骨折はまれで、骨髄腔の大きさは正常でした。 (B) 偽手術群および卵巣摘出群における大腿骨のマイクロ CT スキャン。OVX群では、海綿網の造形が不完全であり、骨髄腔は部分的に空でした。シャム群では、小柱が豊富で連続しており、骨髄腔が狭かった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

      figure-results-5
      図5:Xiaoyao錠剤による治療後のHEおよびマイクロCTアッセイ。(A) Xiaoyao錠剤の治療後の各グループのマウスの大腿骨切片のHE染色(10x)。OVX群では、骨梁が縮小し、連続性が遮断され、構造がまばらになり、骨髄腔が拡大しました。シャム群では、骨小柱の連続性が良好で、大腿骨組織は構造的に密集しており、骨髄腔は正常であった。OVX群と比較すると、薬物群の骨梁は構造的に無傷で、モデル群よりも結合性が高く、骨髄腔が減少し、構造が緻密であった。 (B) Xiaoyao錠剤治療後の各グループのマウスの大腿骨のマイクロCTの比較。卵巣摘出群のマウスの大腿骨の骨小柱はまばらで壊れていたが、シャム群はより連続的で無傷の小柱を持っていた。卵巣摘出群と比較して、高用量薬物治療群のマウスは骨柱骨骨折が少なく、網状構造が回復し、骨髄腔が部分的に縮小したのに対し、低用量薬物群の動物は骨柱梁が多く骨髄腔が減少したが、骨柱骨骨は残った。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

      figure-results-6
      図6:骨粗鬆症マウスのIL-17シグナル伝達経路および骨形成マーカー遺伝子タンパク質発現に対するXiaoyao錠剤の影響を検出するための免疫組織化学(40倍)。 ALP、COL-1、IL-6、IL-17、Act1タンパク質の存在に対する陽性反応は、骨組織上に黄褐色または黄色の顆粒が出現することで明らかになりました。薬剤群におけるALPおよびCOL-1の発現は、OVX群よりも高かった(p < 0.05)。IL-17、Act1、およびIL-6の薬物群での発現は、OVX群よりも低かった(p < 0.05)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

      漢方薬の名称分子ID分子名
      シロシャクヤクMOL001918シャクシャクヤク
      シロシャクヤクMOL000211まいりん
      アトラクティロイド・マクロケファラMOL00002214-アセチル-12-セネシオイル-2E,8Z,10E-アトラクチレントリオール
      アトラクティロイド・マクロケファラMOL0000493β-アセトキシアトラクチロン
      メンテハーブMOL000471アロエエモジン
      メンテハーブMOL005190エリオディクチオール
      チャイ・フーMOL000354イソラムネチン
      チャイ・フーMOL013187キューブビン
      アンジェリカ・シネンシスMOL000449スティグマステロール
      アンジェリカ・シネンシスMOL000358β-シトステロール
      ポリアココスMOL000282エルゴスタ-7,22E-ジエン-3ベータ-オール
      ポリアココスMOL000283過酸化エルゴステロール
      甘草MOL002311グリシロール
      甘草MOL0049907,2',4'-トリヒドロキシ - 5-メトキシ-3 - アリールクマリン
      フレッシュジンジャーMOL0061296-メチルジンジアセテート2
      フレッシュジンジャーMOL001771ポリフェラスト-5-EN-3β-オール

      表1:厳選された漢方薬の有効成分。 最初の列には伝統的な漢方薬の名前がリストされており、2番目の列には漢方薬の有効成分のIDが、3番目の列には漢方薬の有効成分の名前がリストされています。

      Supplementary Coding File 1: ハーブ名、成分、ターゲットIDのコードを統合します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

      Supplementary Coding File 2: Drug target ID conversion.(Supplementary Coding File 2:薬剤ターゲットIDの変換)このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

      Supplementary Coding File 3: ネットワーク解析用のファイルです。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

      Supplementary Coding File 4: Symbol to gene ID変換。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

      補足コーディングファイル5:GOエンリッチメント分析。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

      Supplementary Coding File 6: KEGGエンリッチメント解析。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

      ディスカッション

      統計によると、骨粗鬆症は米国で毎年150万件の骨折を引き起こし、その大部分は閉経後の女性に発生します27。高齢化の進展に伴い、世界の将来の大腿骨股関節骨折の大半はアジアで発生し、2050年には全世界で820万人に達すると予測されています28。骨折を予防する費用は、骨折を治療する費用とほぼ同じであり、薬の使用には必然的に何らかの副作用が伴う29。したがって、責任ある社会において、この問題に対処するためのより費用対効果の高い方法が緊急に必要とされています。

      Xiaoyaoの丸薬は8つの成分で構成されています。その成分が骨粗鬆症に及ぼす影響に関する研究が進行中です。 Poria cocos は、卵巣摘出骨粗鬆症誘発マウスモデル30において、破骨細胞形成および骨溶解活性を阻害します。2つの成分、甘草およびShu-di-huangの組み合わせは、NF-κBシグナル伝達経路を阻害することにより抗酸化効果を発揮する可能性がある31。伝統的な中国のハーブトニックである Danggui buxue tangは、骨の代謝回転を阻害し、視床下部-下垂体-性腺(HPG)軸の調節を調節し、それによって卵巣摘出ラットの骨量減少を防ぐ能力により、骨粗鬆症の治療に役立つ可能性があります32。これらの結果はすべて、Xiaoyaoの錠剤が骨粗鬆症に治療効果がある可能性があることを示唆しています。この研究の結果は、Xiaoyao錠剤がIL-17シグナル伝達経路の活性を抗炎症的に調節することにより、抗骨粗鬆症効果を発揮する可能性があることも示唆しています。

      本研究で構築された薬物標的と骨粗鬆症関連遺伝子の制御ネットワークから、合計168の関連するシグナル伝達経路が得られたが、本研究ではIL-17シグナル伝達経路をさらに探索した。IL-17ファミリーは、IL-17A-Fを含む6つのメンバーで構成されており、そのうちIL-17Aは最初に発見された33人でした。初期の研究では、IL-17はヒトの炎症性疾患や自己免疫疾患と関連していると考えられていました。その後、研究により、バリアの完全性を維持する役割があることが示唆され、がんとの関連も発見されました15。しかし、骨のリモデリングには生理学的な役割を果たしませんが、骨の状態が異常なときには異なる振る舞いをします。さらに、IL-17は弱い活性化剤として作用することができ、他のサイトカインと相乗してエネルギー出力を上昇させます。これは、TNFα15,34との共活性化によって実証されています。

      In vitro実験では、IL-17が骨芽細胞性MSCの増殖と分化を誘導できること35、またBMP-2による初代ラット骨芽細胞の分化を阻害することもできることが実証されています36。IL-17は骨芽細胞を刺激してRANKLを発現させることができ、RANKLは破骨細胞形成を促進するが、この効果は骨芽細胞の存在に依存しているようである37,38。この研究では、Xiaoyao錠剤の異なる濃度が、特に高濃度で使用した場合に、PMOMモデルマウスに治療効果をもたらしました。IL-17シグナル伝達経路と相関するIL-17、Act1、およびIL-6は、対照と比較して、これらのマウスで有意に減少しました。濃縮分析の結果が評価されたところ、動物をXiaoyao錠剤で治療した場合のIL-17経路の関与が示唆されました。

      この研究では、いくつかの骨変換マーカーもテストしました。ALPは、骨芽細胞から分泌される四量体膜結合酵素であり、石灰化阻害剤であるピロリン酸39を分解することにより、骨様の形成と石灰化に重要な役割を果たします。骨組織の細胞外マトリックス中の有機画分の約90%はCOL-1で構成されており、骨の石灰化中、コラーゲンはこのプロセスで重要な役割を果たします40。本研究の結果、薬剤群のマウスの免疫組織化学で観察されたALPおよびCOL-1タンパク質の発現レベルは、モデル群よりも高かったことから、骨形成遺伝子の指標を増加させることで、小紗丸薬の骨粗鬆症改善効果が得られることが示唆されました。一部の学者は、肝細胞エストロゲン受容体(ERα)の発現と転写活性がXiaoyao sanによってアップレギュレーションできることを実証しています41。Xiaoyao sanの Angelica sinensis、White Paeonia lactiflora、 およびLicoriceの抽出物は、エストロゲン様活性を持つことが示されています。この研究で使用されたXiaoyaoの丸薬にも同じ成分が含まれており、これはXiaoyaoさんの処方箋から最新の調製方法で作られています。したがって、Xiaoyaoピルは、骨芽細胞にエストロゲン様効果を発揮して骨芽細胞の活性を高め、骨の質を改善することにより、 ALP や COL-1 などの骨形成遺伝子の発現も増加させる可能性があると仮定できます。

      この研究では、背側卵巣摘出術によって両方の卵巣を切除することにより、マウスのPMOMモデルを確立することに成功しました。動物モデルは、この研究のその後のすべての実験の基礎です。マウスの卵巣を外科的に切除する際には、OVX群と薬剤群ではマウスの卵巣を完全に切除することが重要であったのに対し、偽群では卵巣近くの脂肪のみを切除すること、また創傷感染を避けることも重要であった。

      マウスの骨梁の数と結合密度は、Xiaoyao錠剤による卵巣摘出の治療後に改善され、この薬剤が骨粗鬆症に治療効果があることが示唆されました。免疫組織化学と免疫細胞化学を使用して、この研究では治療の有効性を評価しました。さまざまな試薬の作用時間は絶対的なものではなく、特に発色の過程では、最良の結果を得るためにリアルタイムの観察とタイムリーな反応が必要です。抗体のインキュベーションでは、まず抗体濃度勾配を設定し、観察・比較を重ねた上で、その後の実験に最適な濃度を選択します。

      ただし、この研究にはいくつかの制限がありました。ウェブ薬理学のデータは単一のデータソースしかなく、薬物組成に関する分析は1つのデータベースからのみ行われました。さらに、この研究ではXiaoyaoピルの有効性は陽性薬と比較されておらず、Xiaoyaoピルと現在の治療法との具体的な違いを評価することはできませんでした。.

      PMOMの場合、利用可能な第一選択治療の選択肢はビスフォスフォネートです。しかし、これらの薬物の使用は、胃腸の禁忌、さらには深刻な非定型大腿骨骨折および顎の骨壊死につながる可能性がある42,43。二次治療の選択肢には、デノスマブの使用とホルモン療法が含まれます。デノスマブは、股関節、脊椎、および非脊椎骨折を軽減することが示されています。しかし、薬物が中止されるとリバウンドが発生する可能性があり、中止期間が長くなるほど、骨密度の損失が大きくなります42,44,45。更年期ホルモン療法は、脊椎の骨粗鬆症性骨折のリスクを減らすが、その効果は年齢に限られており、その長期的なリスクは利益を上回っているようだ46。シーケンシャルセラピーはPMOMの長期治療選択肢であり、骨形成薬とそれに続く抗吸収薬の使用により、骨量の最大の増加を達成できます。特定の薬物は通常、患者ごとに決定される42。

      この点で、伝統的な漢方薬は骨粗鬆症の治療に有利な可能性を秘めていると考えることができます。漢方薬の作用機序は、単一のメカニズムを介して作用するのではなく、マルチパスウェイおよびマルチターゲットである47。一部の学者は、いくつかの漢方薬の有効性と安全性を評価しており、漢方薬と西洋薬を組み合わせて使用した場合の骨折数は、漢方薬のみを投与した場合と比較して、西洋医学のみのグループ48よりも少ないことを示しました。化学薬品と比較して、中国の薬草療法は副作用が少なく、比較的安価で、長期使用に適しています。中国の薬草療法は、骨の微細構造を修復し、骨の体積を増やすだけでなく、腰椎の衰弱や腰痛の症状を軽減または排除することもできます49。今回の研究は、新薬や新治療法の発見につながる可能性のあるアプローチを提供するのに役立つかもしれない。

      PMOMを治療するためのXiaoyaoピルの適用は有望であるようです。本研究では、PMOMのマウスモデルにおいて、炎症を抑制することにより、ピルが骨量と骨質を改善することができる。一部の学者は、漢方薬と鍼治療の組み合わせがPMOM50の治療に効果的であるとさえ示唆しています。同時に、漢方薬と西洋医学の組み合わせが効果的であることが証明されています51。これらの可能な治療法は両方とも有効ですが、鍼灸や西洋医学と組み合わせてXiaoyaoピルを使用した推奨される治療法は、臨床試験によって検証されるべきです。.骨粗鬆症の臨床的意義は骨折にあり、今後の研究では骨折の予防にも焦点を当てるべきです。

      要約すると、この研究は、ネットワーク薬理学と動物実験を通じて、PMOMマウスがXiaoyaoピルによる治療後に骨代謝の有意な改善と骨量の増加を示したことを示しました。この現象の作用機序は、IL-17シグナル伝達経路の阻害と、骨形成因子、ALP、およびCOL-1活性の増強に関連している可能性があります。この研究は、骨粗鬆症関連疾患の治療におけるXiaoyao錠剤の臨床応用のための理論的基礎と実験的基礎を築きます。

      開示事項

      著者は、利益相反がないことを宣言します。

      謝辞

      百瀬市科学研究技術開発プログラム(20224128)は、この作業を支援しました。著者は、原稿の編集に当たっていただいたインペリアル・カレッジ・ロンドンとYMUNのDev Sooranna博士に感謝します。YYXとZYWは、この研究に等しく貢献しました。

      材料

      この記事で使用された材料の一覧
      名前会社カタログ番号コメント
      1mlサンプラー広西チワン族自治区Beilunhe医療工業グループ有限公司JYQ001マウスの麻酔用
      4%ポリホルムアルデヒド北京ソーラーバイオサイエンス &テクノロジー株式会社P1110組織固定用
      6-0吸収性縫合糸(斜め針)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.HZX-06術後縫合用
      吸収性コットンボールWinnerMIANQIU-500g滅菌・止血用
      粘着スライド江蘇省泰実験装置(株)188105組織切片化用
      AmobarbitalSigma Aldrich (Shanghai) Trading Co.A-020-1MLマウス麻酔用
      ブルーイングソリューション北京ソーラーバイオサイエンス&テクノロジー株式会社G1866ヘマトキシリン分化溶液
      C57BL/6マウスBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.(SCXK 2033-0063)動物実験用
      炭素鋼製外科用ブレードPremier Medical Equipment Co.SP239マウス手術用
      CIKS/TRAF3IP2 Rabbit pAbBIOSS ANTIBODIESbs-6202RBinds to Act1 in tissue
      Cole's Hematoxylin Solution (For Conventional Stain)Beijing Solarbio Science &テクノロジー株式会社G1140パラフィン切片の染色用
      コラーゲン I 型ポリクローナル抗体プロテインテック14695-1-AP組織中の COL-1 に結合
      DAB 基板キット,20xBeijing Solarbio Science &テクノロジー株式会社DA1010組織色開発用
      使い捨て手術用シート50 * 60CM南昌徐匯医療機器株式会社SP4529777マウス手術用
      EDTA脱灰液(pH 7.2)Beijing Solarbio Science &テクノロジー株式会社E1171-500ml組織脱灰用
      強化内因性ペルオキシダーゼブロッホングバッファーBeyotime BiotechnologyP0100B組織または細胞内因性ペルオキシダーゼの隔離
      環境にやさしい脱ロウクリア液体ServicebioG1128-1Lパラフィン切片の脱ロウ用
      エチルアルコールCHRON CHEMICALS64-17-5 (CAS)の脱水用パラフィン切片
      汎用抗体希釈剤エピザイム バイオテックPS119L抗体希釈用
      ヘマトキシリン分化溶液ServicebioG1039-500MLヘマトキシリン染色後の分化と、組織からの過度に結合した非特異的吸着色素の除去用
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      IL-17A ポリクローナル抗体タンパク質技術13082-1-AP組織中のIL-17に結合
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      免疫組織化学ペン北京中山金橋バイオテクノロジー株式会社ZLI-9305 (YA0310)免疫組織化学の円を描くため
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      医療用縫合針 アングルニードル 4*10 3/8Chaohu Binxiong Medical Equipment Co.FHZ612-4後縫合用
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      PBS(1X)Shenzhen Mohong Technology Co.,LtdB0015スライド洗浄および部分溶液希釈用バッファー
      プロテインフリー迅速ブロッキングバッファー (1X)Epizyme BiotechPS108Pタンパク質の非特異的結合の回避
      ウサギ抗骨アルカリホスファターゼ抗体BIOSS ANTIBODIESbs-6292R組織内のアルカリホスファターゼに結合します
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      剃り/電動バリカンHANGZHOU HUAYUAN PET PRODUCTS CO., LTD.DTJ-002シェービングマウス用
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      Tris-EDTA 抗原修復液 (50倍)proteintechPR30002パラフィン切片の抗原修復用
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      Xiaoyao pillsJiuzhitang Co.,Ltd.YPG-041動物用薬物送達
      用その他R
      4.3.1データ処理
      Cytoscape3.9.1ネットワーク生物学漢方薬のための規制ネットワークの構築
      ImageJ 1.54f国立衛生の画像処理免疫組織化学の結果
      Adobe Photoshop 24.0.0Adobe画像の組み合わせ用
      GraphpadPrism 9.5GraphPad ソフトウェアデータ
      セルのOLYMPUSと撮影用
      OLYMPUS BX53OLYMPUSHE染色と免疫組織化学切片撮影用
      の作用後の細胞核の青色化 術 術スライスマウスのための国家資源 伝統的な研究所統計分析 Dimension スライス

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