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方法論記事

無傷の ショウジョウバエ 幼虫のレーザー細胞アブレーションにより、シナプスの競合が明らかになる

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DOI:

10.3791/67053

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2024年7月26日

 ,  , 
1Stiles-Nicholson Brain Institute, Florida Atlantic University, 2Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、無傷の ショウジョウバエ の幼虫の個々のニューロンのレーザー細胞アブレーションを示しています。この方法により、発達中の神経系におけるニューロン間の競争を減らす効果の研究が可能になります。

要約

このプロトコルは、無傷の ショウジョウバエ メラノガスター 幼虫の中枢神経系 (CNS) における 2 光子レーザー システムによる単一ニューロン アブレーションについて説明しています。この非侵襲的な方法を用いて、発生中の神経系を細胞特異的に操作することができる。ネットワーク内の個々のニューロンの発達を阻害することで、神経系がシナプス入力の喪失をどのように補うことができるかを研究することができます。 ショウジョウバエの巨大線維系では、シナプス前巨線維(GF)とシナプス後大転子運動ニューロン(TTMn)の2つのニューロンに焦点を当てて、個々のニューロンが特異的にアブレーションされました。GFは同側のTTMnとシナプスを形成し、これはエスケープ応答に重要です。GFが軸索成長を開始した直後に、第3インスター 脳のGFの1つを切除すると、CNSの発達中に細胞が永久に除去されます。残りのGFは不在の隣人に反応し、反対側のTTMnに対して異所性シナプス終末を形成します。この非定型の両側対称末端は、色素結合によって実証されるように両方のTTMnsを神経支配し、電気生理学的アッセイによって実証されるように両方の運動ニューロンを駆動します。要約すると、単一の介在ニューロンのアブレーションは、片側のニューロンの喪失を補い、エスケープ回路に対する正常な応答を回復できる両側のニューロンのペア間のシナプス競争を示しています。

概要

レーザーアブレーションは、さまざまな生物の神経回路を解剖するための好ましいツールです。ミミズやハエなどのモデル遺伝システムで開発され、神経系の構造、機能、および発達を研究するために動物界全体に適用されています1,2,3。ここでは、ショウジョウバエの回路組み立て中にニューロンがどのように相互作用するかを調べるために、単一ニューロンアブレーションが使用されました。ハエの脱出システムは、成虫のハエで最大のニューロンと最大のシナプスを含んでおり、その回路は過去数十年で十分に特徴付けられてきたため、分析のお気に入りの回路です4。ジャイアントファイバー回路の組み立てにおいてニューロン間相互作用が果たす役割は、この研究の焦点です。

1960年代のヒューベルとヴィーゼルの研究以来、神経科学で焦点となってきた相互作用の1つのタイプは、「シナプス競争」5,6です。このプロトコルでは、レーザーアブレーションを使用して、ショウジョウバエの巨大繊維系(GFS)における単一細胞アブレーションによる競争の役割を再検討し、現象の分子基盤が発見される可能性が示唆されました。

発育中のハエのニューロンのアブレーションは、標的ニューロンの可視化、アブレーション法の精度、標本の生存など、さまざまな理由で困難でした。GFSにおけるこれらの問題を克服するために、UAS/Gal4システム7 を用いて対象ニューロンを標識し、2光子顕微鏡を用いてシナプス前巨大線維またはシナプス後ジャンプ運動ニューロン(TTMn)を除去した。

本研究では、GFSにおけるシナプス結合性とシナプス強度の調整において、隣接する両側性ニューロンが果たす役割を明らかにするために、両側性ニューロンのペアの1つ(シナプス前GFまたはシナプス後運動ニューロン)を蛹の発生直前に欠失させた。この発生段階では、GF軸索形成は完了していません8。次に、成人のシナプス回路のGF構造と機能を調べ、残りのGFの出力に特に注意を払いました。

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プロトコル

議定書に使用されたすべての動物は、 ショウジョウバエ・メラノガスターの種でした。本種の使用にまつわる倫理的な問題はありません。この作業を実行するために倫理的なクリアランスは必要ありませんでした。本研究で使用した ショウジョウバエ の種、試薬、機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. ショウジョウバエ の繁殖と正しい幼虫期の選択

  1. アブレーションする細胞内の発現を駆動するGal4ドライバーラインを選択し、UAS-GFPレポーターラインと再結合または交差させます。25°Cの標準的なフライフードでフライを育てます。
    注:ジャイアントファイバー(GF)アブレーションの場合、R91H05-Gal4またはA307-Gal4をUAS-GFPと再結合しました。ShakB(致死)-GAL4をUAS-GFPと再結合させてTTMnアブレーションに使用しました( 材料の表を参照)。
  2. 食物から出始め、食物バイアルの側面を這い上がる幼虫を選択します。これらの幼虫は、GF細胞アブレーションを行うのに適した段階である放浪段階にあります。
    注:アブレーションは、どの幼虫の段階でも行うことができます。GF細胞体は脳内で容易に同定できるため、GFSの発達を操作するためには最後の幼虫期が重要であったが、この段階ではGF軸索は標的との結合を行っていない。

2. 3番目の 幼虫の準備

注:幼虫は、Burraらと同様の方法を使用して麻酔をかけました9。処置時間を短くするために、一度に1匹の幼虫のみを準備します。麻酔薬への短時間の曝露は、実験動物の生存率を高めます10。

  1. フタがしっかり入ったガラス皿を用意します。皿にコットンボールを置き、ドラフトの下に約3〜5 mlのエチルエーテル(危険で可燃性の液体、白衣、手袋、ゴーグル)を追加します。皿に蓋をします。
  2. ハエのバイアルから個々の3番目の 幼虫を収集します。第3幼虫期 では、幼虫は食品培地を離れ、食品バイアル11の側面に沿って這い上がる。
    1. 幼虫がまだ動いていて、蛹の形成を開始していないことを確認してください。静止していて体の短縮を示す幼虫は蛹化を開始しており、アブレーションには適していません。小さな絵筆で幼虫を拾います。
      注:第 3幼虫期は、発育の72時間(産卵後)の2回目の脱皮後に始まり、25°Cで飼育されたハエの場合は120時間の蛹形成まで続きます。
  3. 1匹の幼虫を小さな開いた容器に移します。容器をエチルエーテルを入れたガラス皿に入れ、皿をしっかりと閉じます。ガラス皿を開けるときは、煙が逃げるのを防ぐために、シュノーケルの下またはヒュームフードに入れてください。
    1. 30秒間隔で、幼虫の入った蓋を皿から取り外し、解剖顕微鏡で幼虫の可動性を確認します。幼虫は通常1分以内に固定されます。マウスフックのけいれんが止まると、幼虫はマウントする準備が整います。3分後に完全に固定されていない幼虫は捨てます。
      注:微量遠心チューブの逆さまの蓋の上部(チューブから蓋を取り外したもの)は、容器として使用できます。

3.アブレーションのために幼虫をスライドに取り付ける

  1. 麻酔をかけた幼虫をガラス製の顕微鏡スライドに置きます。幼虫を昆虫の生理食塩水の滴に浸します。これにより、幼虫に付着する可能性のある食物の残骸の一部が洗い流されます。
  2. 解剖顕微鏡下で、紙ティッシュペーパーでほとんどの生理食塩水を取り除きます。GFアブレーションの場合は幼虫の背側を上にして配置し、TTMnアブレーションの場合は腹側を上にして配置します。ガラスカバースリップを幼虫の上にゆっくりと下げます。カバースリップの側面に生理食塩水を追加して、スライドガラスとカバースリップの間のスペースを埋めます。
  3. GFアブレーションの場合は、解剖顕微鏡で高倍率下での脳の位置を確認します。脳が水平に横たわっていて、キューティクルを通して見えることを確認してください。多くの場合、脳は脂肪組織で覆われているため、視覚化や細胞のアブレーションが不可能になります。
    1. 脳を覆っている脂肪組織を変位させるには、鉗子でカバーガラスにわずかな圧力をかけ、カバーガラスを左右に動かします。この方法で脂肪組織を脳から遠ざけることができない場合は、代わりに別の幼虫を使用してください。

4. ターゲットセルの位置特定

注:この研究に使用した多光子システムは、正立顕微鏡に取り付けられました。システム固有のソフトウェアを使用して、取得とレーザー刺激の設定を制御しました。このシステムには、サンプルの位置を特定するための落射蛍光光源が装備されていました。対物レンズは、倍率25倍、作動距離が2mmと長く、NAが1.10の水浸レンズでした。

  1. サンプルを多光子顕微鏡のステージに置き、GFPフィルターを使用してサンプルを落射蛍光モードで位置を特定します。GFアブレーションの場合、 図1A、C、Dに示すように、細胞体を脳内で識別できます。TTMn アブレーションの場合、 図 1A、B に示すように、腹側神経索 (VNC) の腹側から 4 つの細胞のクラスターを識別できます。ピントを合わせたら、セルを視野の中央に配置し、2光子モードに切り替えます。

5. アブレーションパラメータの設定

  1. レーザー設定と検出器のゲインを調整して、ガルバノスキャナーでGFP発現細胞を観察します。870nmの波長は、GFP信号を視覚化するのに最適です。セルを視野の中央に配置します。
  2. 円形の関心領域(ROI)を使用して、アブレーションの領域を定義します。ROIがセルの表面の大部分をカバーしていることを確認します(図1E、G)。
  3. ソフトウェアでアブレーションプロトコルを設定します。1つの取得フレームを設定し、次に刺激を設定し、その後に別の取得フレームを設定します。
  4. 刺激レーザー出力設定を低い値(10%-20%)で開始し、刺激プロトコルを実行します。アブレーションの成功は、ROIの位置にある細胞体の中心にある明確な円と、ROIを取り巻く蛍光の増加によって認識できます(図1F)。
    1. アブレーションが成功せず、単に細胞を漂白しただけの場合(図1H)、レーザー出力を5%ずつ増やすか、一度に1つのループ数を増やして、プロトコルを再度実行します。適用されたレーザー出力は、プロトコルで使用されたシステムで10%から40%の間でした。
      注:アブレーションのレーザー出力設定は、細胞が組織内にどれだけ深く位置しているか、およびキューティクルの折り畳みなどの他の要因に大きく依存します。細胞が明るくはっきりと見える場合、レーザー出力は範囲の下限になります。レーザー出力は、レーザーのモデルとレーザーの年齢によって、システムごとに異なります。

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図1:無傷の ショウジョウバエ L3幼虫におけるレーザーアブレーション用ニューロンの同定 (A)脳内の巨大線維(GF)体細胞の位置と、腹側神経索(VNC)のターゴトロシャンテラル運動ニューロン(TTMn)を含む運動ニューロンのクラスターの概略図。(B)幼虫VNCにおけるGFPの発現を駆動するshakB(lethal)-Gal4の最大強度投影。正中線は点線で示されます。円は、レーザーアブレーションの対象となるTTMnを含むニューロンのクラスターを示しています。スケールバー:50μm.(C)A307-Gal4の制御下でGFPを発現する幼虫の脳の部分投影図。円はレーザーアブレーションの対象となるGF体細胞を示しています。スケールバー:50μm.(D)R91H05-Gal4がUAS-GFPを駆動する脳の最大強度投影。両方のGF(円)は、位置、形状、およびサイズによって識別できます。スケールバー:50μm.(E)レーザーアブレーション前のGF体細胞拡大図。マゼンタの円は、レーザーアブレーションのターゲット領域を示しています。スケールバー:10μm.(F)局所的なレーザー出力と成功したアブレーションの配信後のGF体拡大図。スケールバー:10μm.(G)レーザーアブレーション前のGF体細胞の拡大図。マゼンタの円は、レーザーアブレーションのターゲット領域を示しています。スケールバー:10μm.(H)局所的なレーザー出力とアブレーションの失敗(漂白)の配信後のGF体拡大図。スケールバー:10μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6.幼虫の回復

  1. 細胞のアブレーションに成功したら、カバースリップをはがし、絵筆でスライドから幼虫をそっと拾います。幼虫をフードバイアルに入れます。幼虫は30分以内に再び這い回り始めます。
    注:処置時間を短くすると、動物の生存率が向上します。経験を積めば、実験は10分未満で行うことができます。
  2. 幼虫が蛹のケーシングから閉じるまで、標準的な状態で幼虫を飼育し続けます。

7. 成虫のハエにおけるGFSの機能試験

注:次の手順は、Allan and Godenschwege12およびAugustin et al.13で詳細に説明されています。

  1. テスト成虫は、卵閉後2〜5日でハエを飛ばします。麻酔はCO2 で飛んでいき、脚をワックスに押し込むことによって歯科用ワックスに取り付けます。翼を90°の角度で広げ、ワックスで所定の位置に固定します。テングをワックスに押し込んで頭を固定します。
  2. 両目に刺激ワイヤーを、腹部にアースワイヤーを、両側のジャンプ筋(TTM)にガラス記録電極を配置します。
  3. 単一の刺激でGF回路を刺激して、両方の筋肉の応答遅延を測定します。それぞれ100Hzと200Hzの一連の刺激で回路を刺激し、両方の筋肉の次の周波数を測定します。

8. 共焦点イメージングのための巨大ファイバーシステムの解剖と標識

注:フライCNS解剖と色素注入については、BoernerおよびGodenschwege14に詳述されています。

  1. 鉗子でデンタルワックスからフライをそっと取り除き、解剖スコープの下でシリコンエラストマーで裏打ちされたペトリ皿に移します。
  2. ハサミで脚、翼、吻を取り除き、昆虫ピンを使用してハエの背側を上にしてエラストマーコーティングに固定します。
  3. 中腹部から胸部全体、首まで正中線に沿って横方向に切開し、胸部と頭部を接続します。昆虫ピンでフライを開きます。神経系に損傷を与えることなく、ハエから臓器や腺を取り除きます。
    注:この時点で、GF軸索に色素を注入して、GFおよび電気的に結合したニューロン13を標識することができる。
  4. ヘッドカプセルをヘッドから取り外して、脳を露出させます。

9. 神経系の免疫組織化学

  1. CNS解剖後、フライをPBS中の4%PFAに室温(RT)で45分間固定します。PBSでRTで20分間洗浄します(3回)。
  2. サンプルを室温で1時間、PBS中の3% BSA溶液中、0.5%界面活性剤溶液でブロッキングします。
  3. 0.3%界面活性剤溶液およびウサギ抗GFP(1:500)を用いて、PBS中の3% BSA中4°Cで2〜3晩インキュベートします。RTでPBSで20分間洗浄します(6回)。
  4. PBSで抗ウサギ剤Alexa 488を用いて4°Cで一晩インキュベートします。RTでPBSで20分間洗浄します(6回)。
  5. 上昇エタノールシリーズ(50%、70%、90%、100%エタノール)でサンプルを各ステップで10分間脱水します。ピンを取り外し、腹部と飛行筋を切り取ります。神経系を含む胸部の残りの部分をスライドに移し、サリチル酸メチルなどの封入剤で覆います。サンプルにカバースリップを置き、マニキュアで密封します。
  6. 共焦点顕微鏡で神経系を画像化し、GF終末の解剖学的構造を分析します。

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結果

この方法は、 ショウジョウバエの神経系における特定のニューロンネットワークの発達を操作するために使用できます。ここでの主な研究課題は、シナプス結合の形成でした。シナプス前GFまたはシナプス後TTMnのいずれかを取り除くことで、この中央シナプスでの反応性シナプス形成と、シナプスの機能と発達に重要な分子メカニズムの研究が可能になりました。プロトコルに記載されているように、GFの1つまたはTTMnsの1つのレーザー細胞アブレーションを行い、成虫のハエにおける蛹発生後のシナプスへの影響を分析した。

この手順が動物の生存に悪影響を及ぼさないようにするために、模擬アブレーションが並行して行われました。模擬アブレーションでは、動物は実験動物と同じように扱われましたが、レーザーパルスは0%のレーザー出力で照射されました。82.4%のケースで、模擬アブレーションの動物が成虫のハエに成長しました。模擬アブレーションされたハエのGFは、1ミリ秒未満の潜伏時間で応答し、刺激の79.3%で100Hzの刺激に従うことができました。GFの解剖学的構造は、未処理のハエと見分けがつかなかった。

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ディスカッション

2光子顕微鏡による細胞アブレーションは、 ショウジョウバエの神経回路発達を操作するための非常に成功した方法であることが証明されました。この方法は非侵襲的であるため、動物へのダメージは最小限に抑えられます。このデータは、既知の回路のこの細胞特異的な操作の有用性を裏付けています。

アブレーションを成功させるために重要だったのは、最も適切なGal4ドライバーを選択することでした。GFSは十分に研究されているため、多くの特定のGal4ドライバーラインが説明されています7。ほとんどのGal4ドライバーは非常に制限されていますが、それでも他の多くのニューロンで発現しています。課題の1つは、無傷の動物の標的細胞を確実に同定することでした。GFP標識がはっきりと見える動物の場合、アブレーションは低レーザー出力で実施でき、多くの場合、1回の試行で済みました。脂肪組織が脳を覆っている動物やGFP発現が弱い動物では、標的細胞の欠失にはより高いレーザー出力と複数回のレーザー照射ループが必要でした。GF細胞体は、脳の背側から約100μmの深さ...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

2光子顕微鏡での実験は、FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Coreで行われました。ジュピターライフサイエンス・イニシアティブの皆様には、多大なるご支援をいただき、誠にありがとうございます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
抗緑色蛍光タンパク質、ウサギFisher ScientificA111221:500 濃度
Apo LWD 25x/1.10W ObjectiveNikonMRD77220水浸 長時間作動距離
ウシ血清アルブミン (BSA)ΣB4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II LaserCoherent
Cotton BallGenesee Scientific51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)Fisher ScientificD1817
Drosophila salinerecipe from Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl EtherFisher ScientificE134-1危険、可燃性液体
フライフードB(ブルーミントンレシピ)LabExpress7001-NV
サリチル酸メチルフィッシャーサイエンティフィックO3695-500
微量遠心チューブ1.5 mLッペンドルフ22363204
顕微鏡カバースリップ18x18#1.5ッシャーサイエンティフィ12-541A
ニューロビオチントレーサーベクター研究所SP-1120
ニコン A1R 多光子顕微鏡直立した FN1 マイクロソープスタンド上のニコン
NIS Elements Advanced Researchニコン取得およびデータ分析ソフトウェア
パラホルムアルデヒド (PFA)フィッシャーサイエンティフィックT353-500
PBS (リン酸緩衝塩分)フィッシャーバイオ試薬BP2944-100錠剤
R91H05-GA4ブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター40594
shakB(致死)-GAl4ブルーミントン ショウジョウバエ ストックセンター 51633
スーパーフロスト顕微鏡 ガラス スライドフィッシャー サイエンティフィック12-550-143
トリトン X-100フィッシャー サイエンティフィ422355000洗剤溶液
UAS-10xGFPブルーミントンショウジョウバエストックセンター32185
エフィックック

参考文献

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
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  14. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), e3080(2011).
  15. Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
  16. Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), 0346(2018).
  17. Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).

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