タバコ煙抽出物で刺激したマウス気道上皮細胞上のマルチオミクスの分化と変化を研究するためのin vitroモデル

Summary

ここでは、マウス気道上皮細胞を単離および分化するための in vitro モデルについて、慢性タバコ煙抽出物(CSE)への順応に焦点を当てて説明します。このモデルは、CSEのマルチオミクスの影響を包括的に特徴付けるために利用できる可能性があり、慢性的な煙曝露下での細胞応答に関する洞察が得られる可能性があります。

Abstract

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、主にタバコの煙への曝露に起因しています。気道上皮細胞がタバコの煙にどのように機能的に適応するかを調べることは、COPDの病因を理解するために重要です。本研究は、タバコの煙の実際の影響を模倣するために、初代マウス気道上皮細胞を使用して in vitro モデルを設定することでした。確立された細胞株とは異なり、初代細胞は、成長パターン、老化、分化など、 in vivo様の特性をより多く保持します。これらの細胞は、敏感な炎症反応と効率的な分化を示し、生理学的条件を密接に表しています。このモデルでは、初代マウス気道上皮細胞を、最適な濃度のタバコ煙抽出物(CSE)を含む気液界面下で28日間培養したところ、未分化細胞の単層が偽層状の円柱状上皮に変換され、CSEの順化が示されました。次に、包括的なマルチオミクス解析を適用して、CSEが基底気道細胞の分化に影響を与えるメカニズムを解明しました。これらの知見は、タバコの煙への曝露に反応してCOPDの進行を支える細胞プロセスのより深い理解を提供します。

Introduction

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、複雑な特徴を持つ不均一な肺疾患ですが、COPDの患者は徐々に若くなる傾向があります¹。COPD² の主要な危険因子である喫煙は、タバコの煙に対する最初のバリアとして機能する気道上皮細胞に大きな影響を与えます。この既知の関連性にもかかわらず、タバコの煙が気道上皮細胞の変化を誘発する詳細なメカニズムは、まだ十分に調査されていません。これらの分子変化を完全に理解することは、COPDの早期診断マーカーと治療標的を特定するために不可欠です。

このギャップに対処するために、マウス気道上皮細胞を用いた新しいin vitroモデルを開発しました。これらの細胞にタバコ煙抽出物(CSE)を長期間刺激することで、細胞のダイナミックな変化をモニターし、長期タバコ刺激下での気道上皮細胞の変化とそのメカニズムを探ることができました。このモデルでは、トランズウェルを使用して気道上皮細胞の気液界面を提供し、上皮細胞分化の初期段階でタバコの煙抽出物を刺激し、28日で分化が終了するまで刺激しました。これまでの研究では、気道上皮細胞の分化と短期的な刺激(細胞株優位)のみが調査されていました。それらは単一の調節経路3,4,5,6に限定されていました。しかし、ここで紹介するプロトコールは、初代マウス気道上皮細胞を使用し、細胞抽出プロセスを最適化して、以前の気道上皮細胞培養法よりも優れた細胞活性を実現します。このモデルは、包括的なトランスクリプトーム解析、プロテオミクス解析、メタボローム解析、およびエピゲノム解析とともに、細胞分化の変化に焦点を当てています。免疫蛍光法と先進的なマルチオミクス技術を用いて、慢性的なタバコ煙曝露に対する気道上皮細胞の細胞応答を解明し、COPDの病因の理解を深めることを目指しました。このモデルは、気道上皮細胞の分化パターンの変化とそのメカニズムを、さまざまな汚染物質の長期刺激によって引き起こされる探索に使用できます。

Protocol

全体のプロトコルには44日が必要で、これにはマウスの気管から単離された気道上皮細胞の調製に1日、細胞増殖に15日、気液界面でのCSE刺激に28日が含まれます。すべての実験動物は、首都医科大学動物実験センターのSPFバリア動物室に収容されており、首都医科大学の動物実験および実験動物倫理委員会(AEEI-2020-100)によってARRIVEガイドライン⁷の要件を満たすための審査および承認を受けています。

1. マウス気管からの初代マウス気道上皮細胞の単離

1. 準備
   1. 1 mLの50xサプリメントと0.05 mLのヒドロコルチゾンストックを48.95 mLの拡張基礎培地と組み合わせて、完全な拡張培地を調製します。4°Cで保存し、4週間以内にご使用ください。
   2. 7.5 mgのプロテイナーゼと5 mgのデオキシリボヌクレアーゼIを5 mLのハムF-12に溶解して、プロテイナーゼ溶液を調製します。ろ過して滅菌し、4°Cで保存し、4週間以内に使用してください。
   3. 0.05 mLの100xペニシリン/ストレプトマイシンと0.01 mLの500xゲンタマイシン/アムホテリシンを5 mLの完全増殖培地、PBS、およびプロテイナーゼ溶液(100 U/mLペニシリン、100 U/mLストレプトマイシン、10 μg/mLゲンタマイシン、0.25 μg/mLアムホテリシンB)に加えて、抗生物質溶液を調製します。4°Cで保存し、4週間以内にご使用ください。
   4. 手術器具を滅菌し、細胞分離のための生物学的安全キャビネットを準備します。同時に、標準的な細胞培養機器が使用できる状態になっていることを確認してください。
   5. ラットテールコラーゲン(0.02 N酢酸中100 μg/mL)を100 mm培養ディッシュと24 mmトランズウェル(0.05 mL/cm²)に加えて、ラットテールコラーゲンコーティングディッシュを調製します。滅菌のためにUVライトの下で一晩開いたままにします。
2. 初代マウス気道上皮細胞の単離
   1. C57BL/6マウス(6-8週齢、雄、SPF飼育)を気管上皮細胞の単離に用いる。1%ペントバルビタールナトリウム溶液の過剰摂取(約200 mg / kg)で安楽死させます。.十分な細胞収量を得るためには、5匹のマウスを使用してください。
   2. 気管にアルコールが流れ込むのを防ぐために、鼻と口をアルコールに浸さずに、75%エタノール溶液に浸してマウスを滅菌します。
   3. マウスを解剖します。
      1. 手術用ブレードと鉗子、マウスの下顎から腹腔までの表皮を切断して開くための1セットのデバイスを使用します。
      2. 別の手術器具のセットを使用して、両側の甲状腺を引き裂き、気管、周囲の筋肉組織、および食道の間の接続を取り除きます。
      3. その後、胸部を慎重に切り込み、鉗子を使用して胸腔の奥深くまで掘り下げ、肺全体を取り出し、気管の端を見つけます。
   4. 気管を処理します。
      1. 甲状軟骨から気管気管支枝までの気管を切り出し、4種類の抗生物質が入った予冷膨張培地に入れます。
      2. チューブを振って気管の表面からできるだけ多くの血液を洗い流し、氷の上に置いてから、次のマウスの手術を開始します。
   5. 採取したすべての気管を、消化前の前処理のために、4つの抗生物質(200 U / mLペニシリン、200 U / mLストレプトマイシン、20 μg / mLゲンタマイシン、および0.5 μg / mLアムホテリシンB)を含む予冷PBSバッファーに移します。.
   6. 手術器具のセットを使用して、気管の表面から血栓やその他の組織を取り除き、それらを^1cm2 サイズにカットします。
   7. 気管組織をプロテイナーゼ溶液中で37°Cで40分間インキュベートします。
   8. 40分後、チューブを数回揺さぶり、40μmのセルストレーナーを使用して残りの組織を取り出します。刻んだ気管を5 mLの増殖培地を含むストレーナーですすぎ、細胞懸濁液を400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
   9. 得られた細胞を8mLの増殖培地に再懸濁します。
   10. トリパンブルーと血球計算盤を使用して生存細胞を数えます。
   11. ラットテールコラーゲンでプレコートした100 mmディッシュ(1 x 10⁴ 生細胞/cm²)にP0細胞懸濁液をプレートし、37°C、5%CO₂のインキュベーターで細胞を培養します。

2. 初代マウス気道上皮細胞の増殖培養と継代

1. P0細胞培養用の培地を、細胞が70%〜80%の密度に達するまで、通常は6日以内に3日ごとに交換します。この時点で、マウスの気管上皮細胞は、丸石のような外観の無傷の単層を形成することができます(図1A-D)。
2. 十分な量のPBS、完全増殖培地、および動物成分フリー(ACF)細胞解離キットを37°Cに予温します。
3. 3mLのPBSで細胞をやさしくすすいでください。
4. 酵素解離を行います。
   1. 3 mLのACF酵素解離溶液をディッシュに加え、37°Cで5分間インキュベートします。ピペッティング後、細胞を穏やかに取り除き、細胞懸濁液を3 mLのACF酵素阻害溶液に移します。
   2. 3 mLのACF酵素解離溶液の添加を繰り返し、再度5分間インキュベートして、細胞の剥離を最大化します。
5. 細胞懸濁液を400 x g で5分間、4°Cで遠心します。 上清を捨てます。
6. 細胞を1 mLの増殖培地に再懸濁します。
7. トリパンブルーと血球計算盤を使用して生存細胞を数えます。
8. ラットテールコラーゲンでプレコートした数枚の100 mmディッシュ(5 x 10⁴ 生細胞/cm²)にP1細胞懸濁液をプレート化し、37°C、5%CO₂のインキュベーターで細胞を培養します。

3. マウス初代気道上皮細胞の気液界面における分化とCSE刺激

1. セルタイプを確認します。
   1. サイトケラチンに対する抗体を用いた免疫蛍光アッセイ(IFA)を用いて、単離された細胞の上皮起源を確認します。ラットテールコラーゲンでコーティングされたスライドガラス上に細胞を播種し、パラホルムアルデヒドを使用して、細胞が80%のコンフルエントに達した後、少なくとも12時間固定します。
   2. スライドをPBS溶液で3回5分間洗浄し、3% BSAおよび0.1% triton X-100とPBS溶液中で室温(RT)で1時間インキュベートします。
   3. スライドを市販の抗パンサイトケラチン抗体と4°Cで一晩インキュベートし、希釈率1:500で行ってください。
   4. 翌日、スライドをPBS溶液で3回5分間洗浄し、室温で1:1000の希釈で二次抗体バッファーと暗所で2時間インキュベートします。
   5. インキュベーション後、スライドをPBSで3回(1回の洗浄につき5分)洗浄し、1:1000の希釈でDAPIを添加します。室温で15分間インキュベートした後、スライドをPBSで1回5分間洗浄します。
   6. 蛍光顕微鏡でスライドを観察し、ポジティブコントロール(A549細胞株)およびネガティブコントロール(Raw264.7細胞株)の発現パターンを比較します(図2)。
2. 分化のために細胞を播種します。
   1. 前述のようにP2細胞を分離して遠心分離し、細胞ペレットを適切な容量の増殖培地に再懸濁して、1 x 10⁴ 生細胞/cm²のプレーティングを促進します。
   2. 1 mLの細胞懸濁液をトランズウェルポリカーボネートメンブレンインサートの頂端チャンバーにピペットで移します。トランズウェルの基底コンパートメントに、1.5 mLの増殖培地を加えます。
3. 細胞を37°Cでインキュベートし、3日ごとに膨張培地を使用して、基底チャンバーと頂端チャンバー内のすべての培地を完全に交換します。これには通常3〜6日かかります。
4. ALI 10x Supplement 5 mL、ALI Maintenance Supplement 500 μL、ヘパリン溶液100 μL、ヒドロコルチゾン原液250 μLをALI Basal Medium44.15 mLに加え、完全分化培地50 mLを調製します。
5. CSE を準備します。
   1. 1本のタバコを12.5mLの分化培地で泡立て、0.22μmのポアフィルターでろ過してCSEを調製します。実験と CSE のバッチ間の標準化を確保するには、分光光度計で 320 nm の吸光度を測定し、1 の光学密度 (OD) を 100%⁸ と定義します。
6. 適切な濃度のCSEを含む分化培地を使用して、初代マウス気道上皮細胞を刺激し、細胞の分化への影響を検出します。.
7. 細胞を28日間分化させ、その間に基底室培地を交換し、頂端側を週に2回洗浄して、頂端室培地を取り出し、基底室培地を適切な濃度のCSEを含む分化培地に置き換えます。
8. 曝露後の細胞を解析します。
   1. CSEを含む分化培地に曝露した後、形態学的変化の検出(すなわち、免疫蛍光アッセイ(IFA)またはヘマトキシリン-エオシン染色(HE))またはバイオインフォマティクス分析手順(すなわち、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクスなど)のために、任意の時点(すなわち、0〜28日)で細胞および培養上清を回収します。

Results

区別
マウス気道上皮細胞は、分化培地を用いて気液界面で28日間培養した後、首尾よく分化しました。繊毛細胞および杯細胞の存在は、繊毛マーカーアセチル化α-チューブリン(緑; 図3A)および杯細胞マーカーMucin5ACをそれぞれ6(赤; 図 3B)。

細胞分化のためのCSE濃度の測定
単離された上皮細胞を異なる濃度のCSEで24時間刺激します。その結果、CSEの濃度が6%を超えると、上皮細胞の細胞生存率が低下することが示されました(p <0.05、図4A)。長期刺激下で細胞活性を維持するために、2%、4%、および6%のCSEを含む培地を使用して、上皮細胞の分化を28日間刺激しました。さらに、CSE濃度の増加に伴い、上皮細胞では有意な細胞死は見られませんでしたが(図4B)、細胞間膜貫通抵抗(TEER)(図4C)と剥離細胞(図4D)の数には徐々に変化が見られました。さらに、マウスの気道上皮細胞培養物をCSEに慢性的に曝露すると、分化細胞および繊毛細胞の全体的な減少が認められました(図4E-H)。したがって、6% CSE を含む分化培地は、上皮バリア機能の調節不全を引き起こし、細胞生存率を低下させることなく繊毛細胞数を減らすために選択されました。ただし、上皮細胞を 28 日間分化させます。

マルチオミクス解析
0% または 6% の CSE を含む示差培地で 28 日間刺激した細胞の 2 つのグループを回収しました。トランスクリプトミクス解析のために全mRNAを抽出しました。ライブラリー調製、シーケンシング、品質管理、リファレンスゲノムへのリードマッピング、遺伝子発現の定量化を行った後、2つのグループ間の遺伝子の発現差を解析しました。clusterProfiler Rパッケージを使用して、発現差のある遺伝子のGene Ontology(GO)の濃縮解析を行い、遺伝子の長さの不一致を考慮して調整を行いました (図5A)。京都遺伝子・ゲノム大百科事典(KEGG)は、ゲノムシークエンスやハイスループットな実験手法などの広範なデータセットから得られる分子レベルのデータを統合することで、細胞、生物、生態学など様々なレベルでの複雑な生命システムの機能や役割の理解を促進する包括的なデータベースです(図5B)。).プロテオミクスでは、培養の 28 日後に 0% または 6% の CSE を含む示差培地を用いて、2 つの細胞群から総タンパク質を抽出しました。タンパク質品質試験、塩除去、タンパク質酵素加水分解、ペプチドのタンデム質量タグ(TMT)標識、フラクションの分離、LC-MS分析、タンパク質同定、およびタンパク質定量を行った後、2つのグループ間で差次的に発現するタンパク質を定義できます。GO解析は、非冗長タンパク質データベース(図6A)に対してinterproscanプログラムを用いて実施し、KEGGを用いて経路を解析した(図6B)。メタボロミクスでは、培養後28日目に、0%または6%のCSEを含む分化培地を用いて、2つのグループの気道上皮細胞から培養上清を採取しました。HPLC-MS/MS分析、代謝物の同定、定量後、2つのグループ間の差次代謝物を定義することができます。KEGGデータベース(図7A)、ヒトメタボロームデータベース(図7B)、およびLipidmapsデータベース(図7C)を使用して、すべての代謝物にアノテーションを付けました。KEGGデータベースを使用して、これらの分別代謝物と代謝経路の機能を分析しました(図7D)。エピゲノミクスについては、ATAC-seqを既報の通りに実施した⁹。0%または6%のCSEを含む示差培地を用いて、培養後28日目に2つの細胞群から核を抽出し、核ペレットをTn5トランスポゼース反応ミックスに再懸濁しました。転位反応を37°Cで30分間インキュベートしました。アダプターの追加後、ライブラリ調製、品質評価、クラスタリング、シーケンシングにより、2つのグループ間の差分エピゲノミクスを定義することができます。微分ピーク関連遺伝子のGO濃縮解析は、生物学的プロセス、細胞成分、および分子機能に富むGOアイテムの微分ピーク関連遺伝子の数分布を直接反映しています(図8A)。KEGGデータベースを使用して、これらの異なる遺伝子とパスウェイの機能を分析しました(図8B)。

タイトジャンクションタンパク質をコードする遺伝子
トランスクリプトームデータによると、CSEの長期刺激後、Cgn、Cldn2、Cldn3、Cldn8、Cldn10、Cldn20、Cldn23、Jam2、Oclnなど、タイトジャンクションタンパク質をコードする多数の遺伝子の発現が減少し(図9A)、Cldn3およびOclnの発現低下がウェスタンブロットおよび免疫組織化学(IHC)によってさらに確認されました(図9B-E)).これらのデータは、CSEへの曝露が気道上皮細胞のタイトジャンクションタンパク質の発現を著しく減少させることを示唆しています。

サイトカインおよびケモカインの発現
密接な結合の崩壊に加えて、トランスクリプトミクスは、CSEの長期刺激後、Cxcl5、Csf3、Il1a、Il34、Ccl20、Il33などの一部のサイトカインおよびケモカインの発現が増加する一方で、Ccl5の発現が減少することも示しました(図10A)。Luminex試験では、マウス気道上皮細胞の上清中のCXCL-5、CSF-3、およびIL-1α(図10B-D)の濃度が増加したが、CCL-5(図10E)は減少したことがさらに確認されました。これらの結果は、CSEへの曝露がサイトカインとケモカインの発現に選択的に作用することを示唆しています。

図1:初代マウス気道上皮細胞の増殖。 (A)新たに単離された細胞は丸く透明に見えます。(B)単離後2日目までに、増殖した細胞が小さな細胞島に形成された。(C)4日目までに、より大きな細胞島が形成されます。(D)6日目までに、丸石の形態と90%以上融合。(倍率4倍、スケールバー:250μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:上皮細胞マーカーの免疫蛍光アッセイ。 初代マウス気道上皮細胞、A549(ポジティブコントロール)、およびRaw264.7(ネガティブコントロール)におけるサイトケラチン発現。DAPIで染色した核(倍率63倍、スケールバー:40 μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:繊毛細胞および杯細胞のマーカーに対する免疫蛍光アッセイ。 使用したマーカーは、繊毛細胞と杯細胞を確認するために、(A)α-チューブリン、(B)ムチン5ACをそれぞれアセチル化しました(倍率100倍、スケールバー:パネルAで10μm、パネルBで50μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:上皮細胞に対するCSE濃度の影響(A)さまざまなCSE濃度での24時間での細胞生存率。(B)28日での細胞生存率。(C)TEER測定。(D)剥離細胞の数。(E-H)繊毛細胞(緑)および杯細胞(紫)の0%、2%、4%、および6%のCSE濃度での免疫蛍光染色(倍率20倍、スケールバー:50μm)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:遺伝子発現のためのGOおよびKEGG濃縮分析 (A)濃縮生物学的プロセス、細胞成分、および分子機能におけるGO用語の重要性。(B)KEGG経路における差次的に発現する遺伝子の割合。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:タンパク質発現解析 (A)タンパク質発現の差を示すGO濃縮棒グラフ。(B)差次的に発現したタンパク質に基づくKEGG経路解析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:代謝物KEGG経路解析 (A)KEGGデータベースを使用したすべての代謝物へのアノテーション。(B)ヒトメタボロームデータベースを使用してすべての代謝物に注釈を付ける。(C)Lipidmapsデータベースを使用してすべての代謝物に注釈を付ける。(D)さまざまなKEGG経路における差次的に発現する代謝物の分布。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:Differentially Peak関連遺伝子発現解析 (A)タンパク質発現差を示すGO濃縮棒グラフ。(B)差次的に発現したタンパク質に基づくKEGG経路解析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:CSE刺激の有無にかかわらず、マウス気道上皮細胞におけるタイトジャンクションタンパク質の発現。(B-E)マウス気道上皮細胞における(B,C)Cldn3および(D,E)Oclnの発現レベルを、Cldn3およびOclnのウェスタンブロットおよび免疫組織化学(80倍率、スケールバー:50μm)により検出した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図10:サイトカイン発現解析。 (A)サイトカイン発現のトランスクリプトームヒートマップ。(B-E)CSE刺激の有無にかかわらず、細胞内のCXCL-5、CSF-3、IL-1α、およびCCL-5レベルのLuminexアッセイ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

COPDは、一般的な慢性気道炎症性疾患です。タバコの煙への曝露は、慢性的な気道の炎症、気道のリモデリング、および肺の構造破壊を引き起こしますが、これはさまざまな構造細胞と免疫細胞の相互作用の結果です¹⁰。肺の自然免疫系の最前線として、気道上皮細胞は病気の発症において非常に重要な役割を果たします¹¹。この観点から、有害物質の刺激を受けて上皮細胞が下流の細胞をどのように変化させ、制御するかを明らかにすることは、緊急に解決すべき科学的な問題です。

最近、いくつかの制限を克服したCOPDのいくつかの動物モデルが報告されています¹²。これらのモデルでは、中等度の好中球性気道炎症、Th1/Th17 炎症性シグネチャー、顕著な粘液過剰産生、気道リモデリングの増加、肺機能の低下、および空域の拡大が観察されます。これらのモデルでは、COPDのような変化を立証するのに1カ月しかかからないが、1カ月以内にタバコの煙に曝露されたマウスで何が起こったのかは、まだわかっていない。長期のCSE刺激を使用すると、より簡単にキャリブレーションできるという利点があり、喫煙者の気道上皮細胞と同様に、気道上皮細胞を死なずにできるだけ厳しいタバコ刺激にさらすことができます。この場合、気道の炎症と肺気腫の形成につながる動的な病理学的変化を監視することは、喫煙に関連するCOPDの病因をさらに理解するために重要です。そこで、煙の状態を模倣する in vitro モデルを確立し、CSEの気道上皮細胞への曝露中の動的変化をモニターしようと試みました。さらに、比較的精製された気道上皮細胞は、全組織よりもマルチオミクス研究を容易にし、CSEへの気道上皮細胞の曝露における分子的および細胞的応答を見つけ、COPDの主要な経路と治療標的をハイスループットで特定するのに役立ちます。

ここでは、マウス気管上皮細胞の単離を記述するプロトコルは、Hilaireら¹³、およびYouら¹⁴ のプロトコルからいくつかの修正を加えて適応されます。この研究で使用されたプロトコルでは、マウスの気道上皮細胞を増殖させ、気液界面とCSEを含む培地を使用して繊毛細胞と杯細胞を含む偽層状構造に分化させ、慢性CSE順化モデルを確立しました。現在のモデルのポイントは、以下の通りです。

頸部脱臼が機械的に頸部に負担をかけ、上皮細胞を物理的に損傷する可能性があり、クロラール水和物麻酔も気道に影響を与える可能性があることを考慮して、ペントバルビタールナトリウムは安楽死に使用されました¹⁵。マウスの外科的処置中に、アルコールが鼻に入るのを防ぐために首と下部だけを浸すことで、気道上皮細胞の生存率が向上する可能性がある¹⁶。本研究の予備データは、気管挿管またはアルコール浸漬を受けた気道上皮細胞の生存率が低く、拡張しなかったことを示しました。さらに、赤血球のない気道上皮細胞を得るためには、主要な気道を分離する際に血液汚染を避けるために外科的処置に注意する必要があります。

特異的病原体を持たないマウスでも、気道は重要な微生物にコロニーを形成していました。P0初代マウス気道上皮細胞の増殖培地に適切な抗生物質を添加することは、細菌または真菌性病原体による汚染を避けるために不可欠です。ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンB、およびゲンタマイシン¹⁷ のカクテル溶液は、無菌 のin vitro 環境でのP0マウス気道上皮細胞の増殖を効果的に保証します。予備実験では、細菌汚染の効果的な阻害がない場合、P0マウス気道上皮細胞は最初の継代前に死滅することが実証されました。

消化法では、4°Cと37°Cの両方を試験しました。予備実験の結果、37°Cでの消化物は、時間効率、細胞生存率、および細胞収量の点で4°Cを上回ったことが示されました。

上皮細胞の播種に先立ち、ラットテールコラーゲンを酢酸に溶解し、上皮細胞の接着性を改善するための培養皿コーティングに使用した¹⁸。ただし、コラーゲンコーティングの密度は高すぎたり低すぎたりしてはいけません。密度が不十分な場合、適切な接着条件を提供できず、密度が高すぎると、培養表面に結晶性残留物が生じます。

重要なステップは、より多くの上皮細胞を生かし続け、線維芽細胞の汚染を回避することです。これらを達成するために、1)動物用成分を含まない細胞解離キットを使用することで、上皮細胞を穏やかに分離し、不要な細胞損傷を減らすことができること、2)ヒドロコルチゾンを含む分画培地を使用することで、線維芽細胞の増殖を抑制し、上皮細胞の増殖を促進することができることを推奨します。

従来の気道上皮細胞の水中単層培養は、呼吸器研究や毒物学的研究の定番となってきました。しかし、これらの方法では、 in vivoで見られる気道上皮組織の分化した特性を正確に再現するには不十分です。この制限に対処するために、代替の気道上皮モデルを選択しました。このモデルは、気液界面¹⁹におけるトランズウェルシステムによって提供されるような微多孔質膜足場上での初代気道細胞の培養に基づいている。このALI培養セットアップにおける頂端表面の周囲空気への曝露は、細胞分化を促進するのに役立ち、それにより、 in vivo 条件²⁰をより密接に模倣する。

差別化が効果的でない場合は、潜在的な理由を評価することが重要です。これには、気道上皮細胞が過剰な継代を経て、分化能力が損なわれる可能性も含まれます。さらに、残留物が分化プロセスを妨げる可能性があるため、隔週の培地交換プロセス中に、頂端チャンバー内の粘液と体液の蓄積が完全に排除されるようにすることが不可欠です。

このモデルには一定の制限がありますが、研究にとって貴重なツールであることに変わりはありません。1つの制限は、気道上皮細胞を刺激するためにCSE含有培地を使用しても、喫煙者の気道上皮細胞が経験する in vivo 条件を完全に再現できない可能性があることです。さらに、 in vitro での分化繊毛上皮細胞の生存率は、通常1か月に制限されています。これらの制約にもかかわらず、このモデルは、気液界面での気道上皮細胞分化の研究、CSEへの長期順応、および特定の時間枠でのマルチオミクス解析の適用を容易にするなど、いくつかの重要な側面を効果的に統合しています。この包括的なアプローチは、気道上皮細胞の生理学的および病理学的メカニズムに関する将来の研究のための洗練された全体的なフレームワークを提供します。さらに、気道疾患の潜在的なバイオマーカーと治療標的の特定にも役立ちます。私たちの経験が、このモデルを関連する研究に使用したいと考えている人々にとって有用な情報を提供することを願っています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x ペニシリン/ストレプトマイシン溶液	Gibco	15140122
24 mm トランズウェル 0.4 µm ポア ポリエステル メンブレン インサート、滅菌	BIOFIL	TCS016012
40 µm Cell Strainer	Falcon	352340
500x Gentamicin/Amphotericin Solution	Gibco	R01510
アセチル化 &α;-チューブリン	CST	#5335
アセチル-&α;-チューブリン (Lys40) (D20G3)XP ウサギ mAb	cellsignal	#5335
動物成分フリー細胞解離キット	Stemcell	05426
抗パンサイトケラチン抗体	abcam	ab7753
シガレット	マールボロ
Claudin3	免疫ウェイ	YT0949
デオキシリボヌクレーゼ I 牛膵臓	Sigma-Aldrich	DN25
デオキシリボヌクレーゼ I 牛膵臓	Sigma	DN25
Ham'F-12	Sigma-Aldrich	N6658
ヘパリン溶液	Stemcell	07980
ヒドロコルチゾンストック溶液	Stemcell	07925
Mucin 5AC	abcam	ab212636
Occludin Proteintech		27260-1-AP
PBS	Cytosci	CBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin Solution	Gibco	15140122
PneumaCult-ALI 基礎中型	幹細胞	05002
PneumaCult-ALI 10x サプリメント	Stemcell	05003
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement	Stemcell	05006
PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement	Stemcell	05042
PneumaCult-Ex Plus Basal Medium	Stemcell	05041
Pronase	Sigma-Aldrich	P5147
ラットテールコラーゲン	Corning	354236
Trypan Blue	ステムセル	07050