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方法論記事

タバコ煙抽出物で刺激したマウス気道上皮細胞上のマルチオミクスの分化と変化を研究するためのin vitroモデル

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DOI:

10.3791/67057

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2024年7月12日

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1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

この記事について

サマリー

ここでは、マウス気道上皮細胞を単離および分化するための in vitro モデルについて、慢性タバコ煙抽出物(CSE)への順応に焦点を当てて説明します。このモデルは、CSEのマルチオミクスの影響を包括的に特徴付けるために利用できる可能性があり、慢性的な煙曝露下での細胞応答に関する洞察が得られる可能性があります。

要約

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、主にタバコの煙への曝露に起因しています。気道上皮細胞がタバコの煙にどのように機能的に適応するかを調べることは、COPDの病因を理解するために重要です。本研究は、タバコの煙の実際の影響を模倣するために、初代マウス気道上皮細胞を使用して in vitro モデルを設定することでした。確立された細胞株とは異なり、初代細胞は、成長パターン、老化、分化など、 in vivo様の特性をより多く保持します。これらの細胞は、敏感な炎症反応と効率的な分化を示し、生理学的条件を密接に表しています。このモデルでは、初代マウス気道上皮細胞を、最適な濃度のタバコ煙抽出物(CSE)を含む気液界面下で28日間培養したところ、未分化細胞の単層が偽層状の円柱状上皮に変換され、CSEの順化が示されました。次に、包括的なマルチオミクス解析を適用して、CSEが基底気道細胞の分化に影響を与えるメカニズムを解明しました。これらの知見は、タバコの煙への曝露に反応してCOPDの進行を支える細胞プロセスのより深い理解を提供します。

概要

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、複雑な特徴を持つ不均一な肺疾患ですが、COPDの患者は徐々に若くなる傾向があります1。COPD2 の主要な危険因子である喫煙は、タバコの煙に対する最初のバリアとして機能する気道上皮細胞に大きな影響を与えます。この既知の関連性にもかかわらず、タバコの煙が気道上皮細胞の変化を誘発する詳細なメカニズムは、まだ十分に調査されていません。これらの分子変化を完全に理解することは、COPDの早期診断マーカーと治療標的を特定するために不可欠です。

このギャップに対処するために、マウス気道上皮細胞を用いた新しいin vitroモデルを開発しました。これらの細胞にタバコ煙抽出物(CSE)を長期間刺激することで、細胞のダイナミックな変化をモニターし、長期タバコ刺激下での気道上皮細胞の変化とそのメカニズムを探ることができました。このモデルでは、トランズウェルを使用して気道上皮細胞の気液界面を提供し、上皮細胞分化の初期段階でタバコの煙抽出物を刺激し、28日で分化が終了するまで刺激しました。これまでの研究では、気道上皮細胞の分化と短期的な刺激(細胞株優位)のみが調査されていました。それらは単一の調節経路3,4,5,6に限定されていました。しかし、ここで紹介するプロトコールは、初代マウス気道上皮細胞を使用し、細胞抽出プロセスを最適化して、以前の気道上皮細胞培養法よりも優れた細胞活性を実現します。このモデルは、包括的なトランスクリプトーム解析、プロテオミクス解析、メタボローム解析、およびエピゲノム解析とともに、細胞分化の変化に焦点を当てています。免疫蛍光法と先進的なマルチオミクス技術を用いて、慢性的なタバコ煙曝露に対する気道上皮細胞の細胞応答を解明し、COPDの病因の理解を深めることを目指しました。このモデルは、気道上皮細胞の分化パターンの変化とそのメカニズムを、さまざまな汚染物質の長期刺激によって引き起こされる探索に使用できます。

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プロトコル

全体のプロトコルには44日が必要で、これにはマウスの気管から単離された気道上皮細胞の調製に1日、細胞増殖に15日、気液界面でのCSE刺激に28日が含まれます。すべての実験動物は、首都医科大学動物実験センターのSPFバリア動物室に収容されており、首都医科大学の動物実験および実験動物倫理委員会(AEEI-2020-100)によってARRIVEガイドライン7の要件を満たすための審査および承認を受けています。

1. マウス気管からの初代マウス気道上皮細胞の単離

  1. 準備
    1. 1 mLの50xサプリメントと0.05 mLのヒドロコルチゾンストックを48.95 mLの拡張基礎培地と組み合わせて、完全な拡張培地を調製します。4°Cで保存し、4週間以内にご使用ください。
    2. 7.5 mgのプロテイナーゼと5 mgのデオキシリボヌクレアーゼIを5 mLのハムF-12に溶解して、プロテイナーゼ溶液を調製します。ろ過して滅菌し、4°Cで保存し、4週間以内に使用してください。
    3. 0.05 mLの100xペニシリン/ストレプトマイシンと0.01 mLの500xゲンタマイシン/アムホテリシンを5 mLの完全増殖培地、PBS、およびプロテイナーゼ溶液(100 U/mLペニシリン、100 U/mLストレプトマイシン、10 μg/mLゲンタマイシン、0.25 μg/mLアムホテリシンB)に加えて、抗生物質溶液を調製します。4°Cで保存し、4週間以内にご使用ください。
    4. 手術器具を滅菌し、細胞分離のための生物学的安全キャビネットを準備します。同時に、標準的な細胞培養機器が使用できる状態になっていることを確認してください。
    5. ラットテールコラーゲン(0.02 N酢酸中100 μg/mL)を100 mm培養ディッシュと24 mmトランズウェル(0.05 mL/cm2)に加えて、ラットテールコラーゲンコーティングディッシュを調製します。滅菌のためにUVライトの下で一晩開いたままにします。
  2. 初代マウス気道上皮細胞の単離
    1. C57BL/6マウス(6-8週齢、雄、SPF飼育)を気管上皮細胞の単離に用いる。1%ペントバルビタールナトリウム溶液の過剰摂取(約200 mg / kg)で安楽死させます。.十分な細胞収量を得るためには、5匹のマウスを使用してください。
    2. 気管にアルコールが流れ込むのを防ぐために、鼻と口をアルコールに浸さずに、75%エタノール溶液に浸してマウスを滅菌します。
    3. マウスを解剖します。
      1. 手術用ブレードと鉗子、マウスの下顎から腹腔までの表皮を切断して開くための1セットのデバイスを使用します。
      2. 別の手術器具のセットを使用して、両側の甲状腺を引き裂き、気管、周囲の筋肉組織、および食道の間の接続を取り除きます。
      3. その後、胸部を慎重に切り込み、鉗子を使用して胸腔の奥深くまで掘り下げ、肺全体を取り出し、気管の端を見つけます。
    4. 気管を処理します。
      1. 甲状軟骨から気管気管支枝までの気管を切り出し、4種類の抗生物質が入った予冷膨張培地に入れます。
      2. チューブを振って気管の表面からできるだけ多くの血液を洗い流し、氷の上に置いてから、次のマウスの手術を開始します。
    5. 採取したすべての気管を、消化前の前処理のために、4つの抗生物質(200 U / mLペニシリン、200 U / mLストレプトマイシン、20 μg / mLゲンタマイシン、および0.5 μg / mLアムホテリシンB)を含む予冷PBSバッファーに移します。.
    6. 手術器具のセットを使用して、気管の表面から血栓やその他の組織を取り除き、それらを1cm2 サイズにカットします。
    7. 気管組織をプロテイナーゼ溶液中で37°Cで40分間インキュベートします。
    8. 40分後、チューブを数回揺さぶり、40μmのセルストレーナーを使用して残りの組織を取り出します。刻んだ気管を5 mLの増殖培地を含むストレーナーですすぎ、細胞懸濁液を400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
    9. 得られた細胞を8mLの増殖培地に再懸濁します。
    10. トリパンブルーと血球計算盤を使用して生存細胞を数えます。
    11. ラットテールコラーゲンでプレコートした100 mmディッシュ(1 x 104 生細胞/cm2)にP0細胞懸濁液をプレートし、37°C、5%CO2のインキュベーターで細胞を培養します。

2. 初代マウス気道上皮細胞の増殖培養と継代

  1. P0細胞培養用の培地を、細胞が70%〜80%の密度に達するまで、通常は6日以内に3日ごとに交換します。この時点で、マウスの気管上皮細胞は、丸石のような外観の無傷の単層を形成することができます(図1A-D)。
  2. 十分な量のPBS、完全増殖培地、および動物成分フリー(ACF)細胞解離キットを37°Cに予温します。
  3. 3mLのPBSで細胞をやさしくすすいでください。
  4. 酵素解離を行います。
    1. 3 mLのACF酵素解離溶液をディッシュに加え、37°Cで5分間インキュベートします。ピペッティング後、細胞を穏やかに取り除き、細胞懸濁液を3 mLのACF酵素阻害溶液に移します。
    2. 3 mLのACF酵素解離溶液の添加を繰り返し、再度5分間インキュベートして、細胞の剥離を最大化します。
  5. 細胞懸濁液を400 x g で5分間、4°Cで遠心します。 上清を捨てます。
  6. 細胞を1 mLの増殖培地に再懸濁します。
  7. トリパンブルーと血球計算盤を使用して生存細胞を数えます。
  8. ラットテールコラーゲンでプレコートした数枚の100 mmディッシュ(5 x 104 生細胞/cm2)にP1細胞懸濁液をプレート化し、37°C、5%CO2のインキュベーターで細胞を培養します。

3. マウス初代気道上皮細胞の気液界面における分化とCSE刺激

  1. セルタイプを確認します。
    1. サイトケラチンに対する抗体を用いた免疫蛍光アッセイ(IFA)を用いて、単離された細胞の上皮起源を確認します。ラットテールコラーゲンでコーティングされたスライドガラス上に細胞を播種し、パラホルムアルデヒドを使用して、細胞が80%のコンフルエントに達した後、少なくとも12時間固定します。
    2. スライドをPBS溶液で3回5分間洗浄し、3% BSAおよび0.1% triton X-100とPBS溶液中で室温(RT)で1時間インキュベートします。
    3. スライドを市販の抗パンサイトケラチン抗体と4°Cで一晩インキュベートし、希釈率1:500で行ってください。
    4. 翌日、スライドをPBS溶液で3回5分間洗浄し、室温で1:1000の希釈で二次抗体バッファーと暗所で2時間インキュベートします。
    5. インキュベーション後、スライドをPBSで3回(1回の洗浄につき5分)洗浄し、1:1000の希釈でDAPIを添加します。室温で15分間インキュベートした後、スライドをPBSで1回5分間洗浄します。
    6. 蛍光顕微鏡でスライドを観察し、ポジティブコントロール(A549細胞株)およびネガティブコントロール(Raw264.7細胞株)の発現パターンを比較します(図2)。
  2. 分化のために細胞を播種します。
    1. 前述のようにP2細胞を分離して遠心分離し、細胞ペレットを適切な容量の増殖培地に再懸濁して、1 x 104 生細胞/cm2のプレーティングを促進します。
    2. 1 mLの細胞懸濁液をトランズウェルポリカーボネートメンブレンインサートの頂端チャンバーにピペットで移します。トランズウェルの基底コンパートメントに、1.5 mLの増殖培地を加えます。
  3. 細胞を37°Cでインキュベートし、3日ごとに膨張培地を使用して、基底チャンバーと頂端チャンバー内のすべての培地を完全に交換します。これには通常3〜6日かかります。
  4. ALI 10x Supplement 5 mL、ALI Maintenance Supplement 500 μL、ヘパリン溶液100 μL、ヒドロコルチゾン原液250 μLをALI Basal Medium44.15 mLに加え、完全分化培地50 mLを調製します。
  5. CSE を準備します。
    1. 1本のタバコを12.5mLの分化培地で泡立て、0.22μmのポアフィルターでろ過してCSEを調製します。実験と CSE のバッチ間の標準化を確保するには、分光光度計で 320 nm の吸光度を測定し、1 の光学密度 (OD) を 100%8 と定義します。
  6. 適切な濃度のCSEを含む分化培地を使用して、初代マウス気道上皮細胞を刺激し、細胞の分化への影響を検出します。.
  7. 細胞を28日間分化させ、その間に基底室培地を交換し、頂端側を週に2回洗浄して、頂端室培地を取り出し、基底室培地を適切な濃度のCSEを含む分化培地に置き換えます。
  8. 曝露後の細胞を解析します。
    1. CSEを含む分化培地に曝露した後、形態学的変化の検出(すなわち、免疫蛍光アッセイ(IFA)またはヘマトキシリン-エオシン染色(HE))またはバイオインフォマティクス分析手順(すなわち、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクスなど)のために、任意の時点(すなわち、0〜28日)で細胞および培養上清を回収します。

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結果

区別
マウス気道上皮細胞は、分化培地を用いて気液界面で28日間培養した後、首尾よく分化しました。繊毛細胞および杯細胞の存在は、繊毛マーカーアセチル化α-チューブリン(緑; 図3A)および杯細胞マーカーMucin5ACをそれぞれ6(赤; 図 3B)。

細胞分化のためのCSE濃度の測定
単離された上皮細胞を異なる濃度のCSEで24時間刺激します。その結果、CSEの濃度が6%を超えると、上皮細胞の細胞生存率が低下することが示されました(p <0.05、図4A)。長期刺激下で細胞活性を維持するために、2%、4%、および6%のCSEを含む培地を使用して、上皮細胞の分化を28日間刺激しました。さらに、CSE濃度の増加に伴い、上皮細胞では有意な細胞死は見られませんでしたが(図4B

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ディスカッション

COPDは、一般的な慢性気道炎症性疾患です。タバコの煙への曝露は、慢性的な気道の炎症、気道のリモデリング、および肺の構造破壊を引き起こしますが、これはさまざまな構造細胞と免疫細胞の相互作用の結果です10。肺の自然免疫系の最前線として、気道上皮細胞は病気の発症において非常に重要な役割を果たします11。この観点から、有害物質の刺激を受けて上皮細胞が下流の細胞をどのように変化させ、制御するかを明らかにすることは、緊急に解決すべき科学的な問題です。

最近、いくつかの制限を克服したCOPDのいくつかの動物モデルが報告されています12。これらのモデルでは、中等度の好中球性気道炎症、Th1/Th17 炎症性シグネチャー、顕著な粘液過剰産生、気道リモデリングの増加、肺機能の低下、および空域の拡大が観察されます。これらのモデルでは、COPDのような変化を立証するのに1カ月しかかからないが、1カ月以内にタバコの煙に曝露されたマウスで何が起こったのかは、まだわか...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(82090013)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100x ペニシリン/ストレプトマイシン溶液Gibco15140122
24 mm トランズウェル 0.4 µm ポア ポリエステル メンブレン インサート、滅菌BIOFILTCS016012
40 µm Cell StrainerFalcon352340
500x Gentamicin/Amphotericin SolutionGibcoR01510
アセチル化 &α;-チューブリンCST#5335
アセチル-&α;-チューブリン (Lys40) (D20G3)XP ウサギ mAb cellsignal#5335
動物成分フリー細胞解離キットStemcell05426
抗パンサイトケラチン抗体abcamab7753
シガレットマールボロ
Claudin3免疫ウェイYT0949
デオキシリボヌクレーゼ I 牛膵臓Sigma-AldrichDN25
デオキシリボヌクレーゼ I 牛膵臓SigmaDN25
Ham'F-12Sigma-AldrichN6658
ヘパリン溶液 Stemcell07980
ヒドロコルチゾンストック溶液Stemcell07925
Mucin 5ACabcamab212636
Occludin Proteintech27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140122
PneumaCult-ALI
基礎中型		幹細胞05002 
PneumaCult-ALI 10x サプリメントStemcell05003 
PneumaCult-ALI Maintenance SupplementStemcell05006
PneumaCult-Ex Plus 50x SupplementStemcell05042
PneumaCult-Ex Plus Basal MediumStemcell05041
PronaseSigma-AldrichP5147
ラットテールコラーゲンCorning354236
Trypan Blueステムセル07050 

参考文献

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