方法論記事

細胞増殖染色を用いたゼブラフィッシュT細胞急性リンパ芽球性白血病モデルにおける静止細胞の同定

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DOI：

10.3791/67059

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2024年7月19日

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1Pharmacology and Nutritional Sciences, The University of Kentucky, 2Markey Cancer Center, The University of Kentucky, 3Department of Molecular and Cellular Biochemistry, The University of Kentucky

この記事について

サマリー

細胞増殖染色を用いて、ゼブラフィッシュT急性リンパ芽球性白血病モデルにおける静止細胞を同定しました。染色は非分裂細胞に保持され、細胞増殖中に減少するため、さらなる調査のために休眠細胞を選択できます。このプロトコルは、細胞の静止の文脈で自己複製を研究するための機能的なツールを提供します。

要約

細胞の静止状態は、正常幹細胞およびがん幹細胞(CSC)で説明される成長停止または増殖の遅延状態です。静止は、CSCを抗増殖性化学療法薬から保護する可能性があります。T細胞性急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)患者由来異種移植片(PDX)マウスモデルでは、静止細胞は治療抵抗性および幹細胞性に関連しています。細胞増殖色素は、細胞分裂を追跡するための一般的なツールです。蛍光色素は、メンブレン上のアミン基と細胞内の高分子に共有結合的に固定されています。これにより、標識細胞を最大10分裂まで追跡でき、フローサイトメトリーで解決できます。

最終的に、増殖速度が最も高い細胞は、細胞分裂のたびに希釈されるため、色素の保持が低くなりますが、休眠中の分裂の遅い細胞は保持率が高くなります。休眠細胞を単離するための細胞増殖色素の使用は最適化されており、T-ALLマウスモデルで説明されています。既存のマウスモデルを補完する 、rag2:Myc由来のゼブラフィッシュT-ALLモデルは、白血病幹細胞(LSC)の頻度が高いことと、ゼブラフィッシュが大規模な移植実験に便利であることから、T-ALLの自己複製を調査する優れた場所を提供します。

ここでは、ゼブラフィッシュT-ALL細胞を細胞増殖色素で染色するワークフロー、ゼブラフィッシュ細胞の色素濃度の最適化、 in vivoでの染色に成功した細胞の継代、および移植動物からの生細胞選別によるさまざまなレベルの色素保持を持つ細胞の収集について説明します。T-ALLにはLSCの細胞表面メーカーが確立されていないため、このアプローチはin vivoで静止細胞を調べる機能的な手段を提供します。代表的な結果として、高色素保持細胞と低色素保持細胞の生着効率とLSC頻度について説明します。この方法は、薬物応答、転写プロファイル、形態など、静止細胞のさらなる特性を調べるのに役立ちます。

概要

成体幹細胞は、特定の臓器における分化した細胞型の再生に関与しており、主に休眠中の非分裂状態で存在します1,2。例えば、血液を維持する造血幹細胞(HSC)は、大部分が静止したままであり、ごく一部だけが細胞周期に入って自己更新または分化して成熟した血液成分を生成する3。同様に、がんでは、がん幹細胞(CSC)と呼ばれる細胞のまれな亜集団が自己複製能力を持ち、悪性腫瘍の長期維持に関与しています4。がん幹細胞は、in vivoで静止状態または増殖が遅い状態で存在し、それにより、抗増殖がん治療5を回避し、免疫系6によるクリアランスを回避し、酸化ストレスを軽減し、DNA修復経路7を強化することができる可能性があります。治療後に残されたCSCの数が少ない場合でも、腫瘍が再増殖し、患者の再発につながる可能性があります8。したがって、細胞の静止を理解することは、CSCの潜在的な脆弱性を特定し、それらを標的とする新しい方法の開発に大きな期待を寄せています。

カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)染色剤やその誘導体などの細胞増殖色素は、細胞分裂の頻度を追跡するために一般的に使用されています9。この色素は細胞膜を透過し、細胞内に入ると、細胞内エステラーゼによって活性化され、蛍光生成物になります。得られた蛍光化合物は、細胞内タンパク質のスクシンイミジル部分とアミン官能基との間に形成される共有アミド結合を通じて細胞内に保持される10。細胞分裂のたびに、蛍光化合物は得られた2つの細胞間で均等に分割され、シグナルが2倍に希釈されます。この色素は、フローサイトメトリー解析11により、最大10の細胞分裂を検出することができます。

このアプローチは、色素11,12の保持が高い細胞のスローサイクリング集団を同定することにより、in vitroでCSC集団を濃縮するために以前に利用されてきました。T-ALLでは、マウスの患者由来異種移植片における腫瘍増殖のin vivo追跡にCFSEが使用されています。細胞標識と移植の3週間後、フローサイトメトリー分析では、CFSE蛍光をまだ保持している細胞のまれな集団が示されました。この集団は、患者における幹細胞性、治療抵抗性、および再発原因細胞との高い類似性に関連していました13。したがって、この色素は、T-ALLにおける白血病幹細胞(LSC)表現型の研究に有用なツールを提供します。

この研究の目的は、ゼブラフィッシュのT-ALLモデルを使用してin vivo での静止を研究するための細胞増殖色素の応用を拡大することです。特に、 rag2:Myc駆動のゼブラフィッシュT-ALLモデル14 は、マウスモデルやヒト疾患15と比較してLSCの頻度が高いため、自己複製の研究に最適な場所を提供します。さらに、ゼブラフィッシュの使用により、大規模な移植研究が可能になり、マウスと比較してはるかに低いケアとメンテナンスのコストで行うことができます16。ゼブラフィッシュは、蛍光標識された腫瘍細胞を単純な蛍光顕微鏡を使用して容易に観察し、腫瘍の発生速度を推定できるため、ライブイメージングアプリケーションにも優れています16。

このプロトコールでは、ゼブラフィッシュのT-ALL細胞を細胞増殖色素で染色し、続いて同系CG1ゼブラフィッシュで染色した細胞をin vivo で増殖させるワークフローについて説明します。白血病の発症に際し、色素を保持した細胞の選別と、LSCの自己複製速度を定量化するためのその後の限界希釈移植実験での使用について説明します。このプロトコールは、静止LSCを標的とするための潜在的な化合物の in vivo 薬物スクリーニングなど、追加のアプリケーションに拡張できます。さらに、収集された細胞は、トランスクリプトームプロファイリング、プロテオミクス、メタボロミクスなどのさまざまなダウンストリーム解析に使用でき、T-ALLにおける静止LSCの挙動に関する独自の洞察を提供します。

プロトコル

このプロトコルでは、CG1株で以前に生成されたGFP標識ゼブラフィッシュT-ALL細胞を使用しているため、レシピエントの同系CG1ゼブラフィッシュ15に直接注入することができます。簡単に説明すると、白血病は、単一細胞CG1ゼブラフィッシュ胚への rag2:Myc および rag2:GFP のDNAマイクロインジェクションによって生成されました。動物は、注射後3週間から蛍光顕微鏡を用いて白血病の発症をモニターした。GFP陽性白血病細胞をFACSで単離し、レシピエントCG1ゼブラフィッシュに連続移植して、LSCの頻度が高いクローンを作製しました。プロトコル全体の詳細は、Blackburnら15によって説明されています。

あるいは、ゼブラフィッシュ胚17のDNAマイクロインジェクションにより、一次rag2:Myc由来のT-ALLを作製することができる。rag2:MycにGFPなどのrag2駆動型蛍光レポーターをDNAマイクロインジェクションすると、B細胞、T細胞、および混合ALL18が発生する可能性があります。このプロトコルで使用された白血病クローンは、以前にT-ALL15であることが確認されていました。ゼブラフィッシュを含むすべての実験手順は、ケンタッキー大学の動物管理・使用委員会(プロトコル2019-3399)によって審査され、承認されました。

1. ゼブラフィッシュのT-ALL細胞の生体内増殖

  1. 凍結GFP標識ゼブラフィッシュT-ALL細胞1 mLが入ったバイアル1本を、37°Cの水浴で穏やかに振とうしながら解凍します。解凍したら、氷に移します。









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結果

上記のプロトコルに従って、細胞増殖色素CT-FRを保持している細胞を選別し、それらをLimiting dilution assay(LDA)に使用して、CT-FR HighおよびCT-FR Low集団のLSC頻度を推定しました。フローサイトメトリー実験のゲーティングを設定するために、単色コントロール(図2A)に加えて、フルオロフォアなし(カラーなし)コントロールを使用しました。これらの象限は、選別ゲートの設定のために、FITCおよびPE陽性および陰性の母集団を特定するために使用されました。CT-FR単色ポジティブコントロールは、選別と同日に未移植ゼブラフィッシュのWT細胞を染色して作製したため、試料中の増殖細胞からのシグナルよりもシグナル強度が格段に高くなることが予想されます。

CT-FR染色GPF T-ALL (図2B)では、右上の象限に0.13%の低頻度で出現する細胞をCT-FR Highとみなし、「CT-FR High」とラベル付けしたソーティングゲートをこの象限に配置しました。右下の象限には、CT-FR Lowの白血病細胞を採取するためのゲートがもう一つ作られました。腫瘍サンプル中にはCT-FR High細胞が少量存在していたため、多数の細胞(~2.5 × 106)を選別し、限界希釈実験に必要な数の細胞を採取しました。

CG1ゼブラフィッシュにLDA用に選別した細胞を移植した後、ゼブラフィッシュを6週間モニターしました。CT-FR Highの細胞は、CT-FR Lowの細胞集団(p = 0.0134)と比較して、LSCの頻度が4倍高かった(図3A)。 移植後28日目の動物の代表的な画像を(図3B)に示します。CT-FR高用量10細胞投与群では、9匹中8匹(89%)が白血病を発症したのに対し、CT-FR低投与群では10匹中2匹(20%)が白血病を発症しました(図3A)。CT-FR Highグループの動物は、白血病の潜伏期間が有意に短かった(p = 0.0014)(図3C)。最後に、CT-FR Highの動物は、全生存期間が有意に低かった(p = 0.0408)(図3D)。6週目には、CT-FR低分子の70%が生存していたのに対し、CT-FR高分子の動物はわずか10%でした。これらの結果は、rag2:Myc駆動型ゼブラフィッシュT-ALLモデルにおける、ゆっくりと分裂する静止細胞集団内の自己複製LSCの濃縮と、この集団を単離するための細胞増殖染色の利用を示しています。

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図2:フローサイトメトリーを用いた細胞選別 (A)新たにCT-FR染色したWT細胞およびGFP標識T-ALL細胞からのFACSプロットを使用して、CT-FR染色をソーティングするためのゲートを作成した。GFP+ T-ALL細胞。(B)増殖させたCT-FR染色GFP+ T-ALL細胞の代表例。右上の象限の細胞はCT-FR高、右下の象限の細胞はCT-FR低と見なされました。略語:T-ALL = T細胞急性リンパ芽球性白血病;CT-FR = CellTrace ファーレッド。GFP = 緑色蛍光タンパク質;FITC = フルオレセインイソチオシアネート;PE =フィコエリトリン;FACS = 蛍光活性化細胞ソーティング;WT = 野生型。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:細胞増殖染色の保持が高い細胞では、LSC頻度が有意に高い(A)細胞の2つの増量(10細胞および25細胞)による移植後の白血病陽性動物の数を示す限界希釈アッセイからのデータ。計算されたLSC周波数と95%信頼区間が記載されています(p = 0.0134)。(B)移植の28日後の動物の代表的な画像。スケールバー = 10 mm. (C) 重篤な白血病への潜伏期間は、動物の>50%がGFP陽性になるのに必要な時間と考えられており、重大な白血病の負担を表しています。(D)10細胞を移植した動物の生存曲線。略語:LSCs =白血病幹細胞;CT-FR = CellTrace Far Red。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

LSCは、従来の抗増殖性化学療法治療に耐性があることが知られており、これらの細胞に対する標的療法を見つけることは、再発の発生を減らし、患者の予後を改善する上で大きな期待が寄せられています20。以前の研究では、T-ALL PDXモデル13において、薬剤耐性および幹細胞性に関連する静止細胞の小さな集団を同定するための蛍光細胞増殖染色の使用が説明されていました。この研究では、T-ALLのゼブラフィッシュモデルで分裂の遅い細胞または静止細胞を分離するために、同様の細胞増殖染色剤を使用する方法について説明します。このツールを使用して、細胞増殖染色剤の保持が最も高い細胞内のLSCの濃縮について説明しました。これらの調査をゼブラフィッシュにまで拡大することには、多くの利点があります。ゼブラフィッシュは非常に繁殖力が高いです。各交配ペアは、毎週数百の子孫を産むことができ、移植を促進し、多数の動物を必要とする希釈研究を制限します15,17,21。また、ゼブラフィッシュはin vivoイメージングに非常に便利であり、簡易な蛍光顕微鏡16による陽性動物の迅速なスクリーニングが可能となる。したがって、このプロトコールは、ゼブラフィッシュT-ALLモデルにおける静止細胞の追加調査の基礎として役立つことができます。

ここでは、CG1ゼブラフィッシュ15で以前に生成されたLSCを高頻度で使用したT-ALLクローンの使用について述べます。したがって、凍結細胞を単純に解凍して増殖させて使用しました。あるいは、rag2:Myc駆動T-ALLは、ゼブラフィッシュ胚のDNAマイクロインジェクション、T-ALLを発症する動物のスクリーニング、および前述のように陽性ゼブラフィッシュからの白血病の採取によって生成することができる17。同系ゼブラフィッシュの使用は、このタイプの研究にも多くの利点をもたらします。これらの動物は遺伝的に同一であるため、移植された細胞は新しい微小環境に適応することなく宿主内に堅牢に生着することができ、LSC頻度15,17,22の正確な推定が可能になる。

同系動物を使用する代わりに、このプロトコルは、化学的または放射線を介した免疫アブレーションを受けた野生型ゼブラフィッシュ株を使用して従うことができます。免疫アブレーション動物を使用する場合、同種移植で成功した生着のためにより多くの細胞が必要になる可能性があるため、限界希釈アッセイを最適化するように注意する必要があります。さらに、21日後に免疫系が回復するため、観察期間が短くなる可能性が高い17。このプロトコルは、ヒト細胞の異種移植にも拡張できます。ゼブラフィッシュは、マウスに補完的ながん異種移植の効率的で費用対効果の高いモデルとして浮上しています16。成体の免疫不全prkdc-/-, il2rga-/-ゼブラフィッシュは、ヒト細胞を37°Cで最大60日間生着させることに成功している23。このモデルでは、ここで説明したように、染色した細胞を増殖させてin vivoで分裂させる代わりに、ヒト細胞を染色してin vitroで分裂させた後、選別してin vivo研究のためにprkdc-/-、il2rga-/-ゼブラフィッシュに移植することができます。ゼブラフィッシュを異種移植モデルとして使用する際には、いくつかの制限を考慮する必要があります。例えば、ゼブラフィッシュは37°Cで生き残るために適応する必要があります。 さらに、ゼブラフィッシュには肺や乳房などの特定の臓器がないため、特定の癌では同所性移植が不可能な場合があります16。

結論として、ゼブラフィッシュのT-ALLモデルにおける細胞増殖染色剤の使用は、静止性LSCと、疾患発生および治療抵抗性におけるそれらの役割の研究に有望な道筋を提供します。このプロトコールは、費用対効果や遺伝的均質性など、CG1ゼブラフィッシュの利点を活用して、T-ALLのLSC生物学を理解するための堅牢なプラットフォームを提供します。ゼブラフィッシュモデルを使用することで、マウスモデルやPDXモデルを補完し、最終的にT-ALL患者の予後を改善する最適化された標的療法の開発が可能になります。

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

本研究の資金は、国立がん研究所(JSBのR37CA227656)から提供されました。この研究は、ケンタッキー大学マーキーがんセンター(P30CA177558)のFlow Cytometry and Immune Monitoring Shared Resourcesの支援も受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
26 G/2インチマイクロシリンジHamilton87930NA
35 & マイクロ;mフィルターキャップFACSチューブFalcon352235NA
40 µm細胞ストレーナーCELLTREAT229482NA
96ウェルスカートPCRプレートサーモフィッシャーサイエンティフィックAB0800NA
セルソーターソニーバイオテクノロジーSY3200NA
セルトレース ファーレッドサーモフィッシャーサイエンティフィックC34564NA
コニカルチューブVWR10026-078NA
DAPIサーモフィッシャーサイエンティフィック62248NA
DMSOSigma-AldrichD4818NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)Caisson Labs22110001NA
落射蛍光実体顕微鏡NikonSMZ25NA
ウシ胎児血清 (FBS)Sigma-Aldrich12306CNA
魚類システム 水N/AN/A0.03-0.05%塩分、pH 6.5-8、重炭酸ナトリウムで緩衝
マイクロ遠心チューブサーモフィッシャーサイエンティフィックC2171NA
MS-222ペンテールTRS-1トリカインメシル酸塩、麻酔薬
ペトリ皿コーニング07-202-011NA
カミソリ刃アメリカンライン66-0089NA
トリパンブルーサーモフィッシャーサイエンティフィックT10282NA

参考文献

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