電気凝固によって確立された閉塞性慢性膵炎モデル

サマリー

本プロトコルは、膵管の視覚化と膵管の電気凝固による膵管閉塞を引き起こす慢性閉塞性膵炎をモデル化するための新しいアプローチを説明しています。

要約

慢性膵炎 (CP) は、膵臓を破壊し、糖尿病を引き起こし、膵臓がんのリスクを高め、患者の生活の質に深刻な影響を与える重度の炎症状態です。CP への対処は、消化器病学における重要な研究の焦点です。既存の動物モデルの限界を克服するために、生後8週齢のC57BL/6雄マウスを用いて、新しい動物モデルを開発しました。

麻酔マウスの腹部手術で膵臓を露出させた後、肝臓付近の総胆管をクランプし、メチレンブルーが入らないようにしました。毛細血管を胆管に挿入して色素を注入し、膵管を染色した後に挿入しました。膵管を視覚化した後、総胆管と上膵十二指腸動脈の間の位置の中央および下部の 2/3 で電気凝固のために膵臓を選択しました。青色染色液を認識できなくなった場合、電気凝固を終了しました。その後、腹部を閉じ、マウスを正常に飼育しました。手術後 7、14、21、および 28 日に、HE 染色、マッソン染色、および免疫組織化学を使用して膵臓を検査し、血清の生化学的パラメーターを分析しました。14日後の病理は、血清生化学的パラメーターと同様に、慢性膵炎の特徴と密接に一致しました。

概要

慢性膵炎 (CP) は重度の進行性炎症性疾患であり、膵臓の破壊を引き起こし、腹痛や消化器疾患として現れます。時間が経つと、糖尿病を引き起こし、膵臓がんのリスクを高める可能性があります。したがって、CP の動物モデルを確立し、効果的な治療戦略を開発することが重要です。

膵臓の外分泌腺房細胞は、多数の消化酵素を産生および分泌します。細胞小器官とタンパク質の恒常性調節が妨げられると、細胞内トリプシノーゲンの不適切な活性化につながり、最終的には腺房細胞の損傷と膵炎の発症につながる可能性があります¹。

以前の研究では、マウスモデル、特にセルレイン注射の反復² と膵管の外科的結紮 ^3,4 によって誘発されたモデルが CP の研究に役立っていることが示されています。セルレインは慢性状態に移行する可能性のある急性膵炎を誘発する可能性がありますが、特定の膵管閉塞がないため、閉塞性膵炎のシミュレーションにおける臨床的意義は制限されます。外科的結紮はヒト CP の閉塞性をよりよく模倣していますが、侵襲性が高く、実行が困難であり、多くの場合、重篤な全身的影響につながり、限局性乳管の病状の研究を妨げます。

これらの制限に対処するために、電気凝固による新しい閉塞性 CP モデルが提案されています。膵管結紮術の原理と同様に、膵管を塞ぎますが、実行が容易で成功率が高くなります。研究者らは、ブタの主膵管における高周波アブレーションが膵臓萎縮を誘発するための安全で効果的な方法であると提案^{しており5、}これはまた、高周波電気凝固で主膵管を切断すると同様の効果が得られる可能性があることを示唆しています。この技術では、逆行性膵管穿刺とメチレンブルー溶液を注入して乳管染色を行い、その後電気凝固して局所的な乳管閉塞を誘発します (図1)。このアプローチは、広範な炎症反応と全身合併症を回避しながら、ヒトの閉塞性 CP を模倣した炎症と線維症を促進します。従来のモデルと比較して、電気凝固モデルには、特に膵管を標的とし、変動性を低減し、全身合併症を軽減するなど、いくつかの利点があります。これは、CP における乳管閉塞の根底にあるメカニズムと疾患の進行におけるその役割を理解するための、より疾患特異的で再現性があり、多用途なアプローチを提供します。

プロトコル

記載されているすべての動物実験は、海軍医科大学の動物の使用と世話に関する委員会によって承認されました。すべての手術材料が滅菌されていることを確認してください。

1.開腹術

1. ケタミン(80 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の混合物を腹腔内注射で投与し、麻酔導入を行います。ペダル反射と角膜反射の喪失を評価することにより、麻酔の深さを監視します。処置中に適切な麻酔を維持するために、必要に応じて追加の用量(初期用量の20%)を提供します。つま先をつまんで適切な麻酔深度を確認します。体温を維持するために動物を加熱パッドの上に置きます。
2. トリマーを使用して、胸と下腹部の間の髪(~2 cm²)を剃ります。クロルヘキシジン/ヨウ素とアルコールを交互に投与して手術部位を3回消毒します。
3. サージカルテープを使用してマウスを手術プレートに固定し、滅菌ドレープを貼り付けます。
4. はさみを使って中央腹部に長さ2cmの切開を行い、続いて上腹部と剣状突起の間に1cmの切開を行います。

2.膵臓の位置を特定して露出させる

1. 腹部エキスパンダーの助けを借りて、電気凝固が行われる膵臓の領域を見つけます。
2. 滅菌綿棒を使用して、左上腹部の後ろから十二指腸を特定し、十二指腸を回して肝臓をつなぐ透明な胆管を視覚化します。

3. 手術部位の追跡

1. 微小血管クリップを使用して、近位総胆管を一時的に閉塞し、肝臓への逆行性注入の漏れを防ぎます。
2. 内径0.25mm、外径0.35mmのポリエチレンチューブを外径0.25mmの針に接続します。この装置を使用して、膨大部の周りに挿入します。十二指腸の大乳頭を狙い、チューブを挿入します。カテーテルを胆管に半分まで挿入し、挿入を停止します。
3. 輸液ポンプを始動し、0.2%メチレンブルー溶液(0.9%生理食塩水で希釈)を50 μL/10 gの用量で50 μL/分の速度で2分間マイクロポンプします。膵管は徐々に青くなります。
4. セッションの最後に、ポリエチレンチューブを引き出し、微小血管クリップを取り外します。

4.電気凝固手順の導入

1. 滅菌綿棒の助けを借りて、膵臓を固定し、電気凝固ナイフを電気凝固のために青い部分に向けます。電気凝固部位は、総胆管と上膵十二指腸動脈の間の中央および下部の2/3にあります。
   1. この研究に従うには、電気凝固の次の動作パラメータを使用します。電圧:220 V;電極材料:純銅;治療時間:電気凝固後にメチレンブルーのマークされた位置の青が黄色または茶色に置き換わるまで、血管を避けて膵臓の位置で2〜3秒間治療します。手術領域のサイズ:マウスにもよりますが、電気凝固領域は膵臓の裏側にあります。総胆管と前上膵頭十二指腸動脈の間の位置を選択します。温度:300°C。
2. 青色の染色液が見えない場合は電気凝固を終了します。
3. 4-0吸収性縫合糸で腹部を閉じ、4-0非吸収性モノフィラメントポリプロピレン縫合糸で皮膚を閉じます。開腹術と縫合の間に20分以上かからないようにしてください。
4. 対照群を実験マウスと同じ方法で処理しますが、注入成分がメチレンブルーのみで構成されていることを確認します。対照群(偽)では、メチレンブルー注射を投与しますが、電気凝固手術は行いません。

5. 動物を生かし続ける

1. 腹部手術後のマウスの術後の創傷ケアでは、出血や発赤がないか切開部を毎日検査します:出血が発生した場合は、滅菌ガーゼで軽く圧迫して止まってから包帯を交換し、発赤がある場合は1日1回エリスロマイシン軟膏を塗布し、マウスが傷をかじらないように対策を講じます。鎮痛については、手術直後にカルプロフェン(5mg/kg)を腹腔内注射で投与し、その後24時間に1回、3日間連続して投与する。

6. 分析方法

1. 電気凝固の7日目、14日目、21日目、28日目に血清生化学的指標を測定し、膵臓組織の病理学的変化を観察します。
2. 腹腔内注射によりケタミン(80 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の混合物で動物を麻酔し、眼窩神経叢から約500 μLの血液を採取します。
3. 眼球がわずかに突出しやすくするために、背中の皮膚をそっと持ちます。
4. 毛細血管の端を目の隅に置き、約30°〜45°の角度で眼球の下にそっと挿入します。血液が流れ始めるまで毛細血管を回転させます。
5. コレクションの最後に、ガーゼで優しく押してまぶたを閉じたままにします。
6. 血清を遠心分離し(1,200 × g、15分)、アミラーゼ、ビリルビン、およびヒアルロン酸を測定するために上清を除去します(ステップ6.10)。
7. マウスにケタミンキシラジンを麻酔し、深い麻酔状態(ペダル反射または角膜反射なし)にあることを確認し、安楽死のために子宮頸部脱臼を行います。
8. 安楽死させたマウスを4°Cの手術台に置き、はさみと鉗子を使用して腹壁に「V」字の切開を行い、腹腔を露出させます。マウスの膵臓を取り除き、臓器を染色のために3つの部分に分けます。
9. 膵臓を4%ポリホルムアルデヒド溶液に固定して処理し、パラフィンに埋め込みます。膵臓のパラフィンブロックを厚さ0.5mmの切片に切断し、ヘマトキシリンとエオシン(HE)、およびマッソン染色で染色し、光学顕微鏡で視覚化します。パラフィン包埋膵臓組織を免疫組織化学的分析に使用します。
10. アミラーゼ (U/dL)、ビリルビン (mmol/L)、ヒアルロン酸 (μg/L) は、メーカーの推奨に従って市販のキットを使用して測定します。

結果

動物を対照群(電気凝固のためのメチレンブルーのみの注射)と電気凝固群に分け、各群に合計20匹のマウスを分けた。死亡率は対照群で 0%、電気凝固群で 15% でした。モデル構築の成功率(生きたモデルマウスの数)は71%でした。各グループで、病理学的評価のために12匹の動物が選択されました。各グループの3匹のマウスを7日目、14日目、21^日目、28日目に無作為に選択し、HE、マッソン、および免疫組織化学的染色を行いました。モデリングのプロセスを 図 1 に示します。メチレンブルーでトレースした後、マウスの膵臓の総胆管と膵頭十二指腸前上動脈の間の位置を電気凝固しました。電気凝固領域を体位の中央部と下部に3分の1未満の面積で選択すると、効果が期待に応えられない可能性があります。しかし、2/3を超えると、電気凝固後72時間以内にマウスが死亡する可能性が高く、これは膵管が完全に閉塞した後に発生する重度の急性膵炎が原因である可能性があります。

このことから、電気凝固後14日目に、マウスの膵臓に慢性膵炎の組織学的画像が観察され( 図1を参照)、完全に閉塞しているのではなく、膵管が部分的に閉塞した後に形成されることが結論付けられます。7日目の組織はわずかな組織浮腫を示し、組織は慢性膵炎の証拠を示さなかった。14日目に、膵臓組織のHE染色により、膵臓腺房細胞が散在していることが示されました。21日目には、膵臓組織の腺房細胞の炎症の程度が徐々に回復しました。28日目に組織の病理学的変化の逆転の兆候が見られました (図2)。これは、電気凝固プロセス中の膵管電気凝固が不十分であること、および部分的な膵管閉塞後の残りの膵管の代償効果が原因である可能性があります。

マッソン染色は、手術群の線維症の程度が偽手術群よりも有意に重症であることを示しました。col-1および(α-平滑筋アクチン)SMAの染色の免疫組織化学的スコアは高かった(図3)。膵臓組織における慢性膵炎の存在は、14日目の病理学的分析によって観察され、その後の病理的分析のみでHE染色によって前後の変化を比較しました。血清生化学的指標の分析により、血清アミラーゼ、ビリルビン、ヒアルロン酸の濃度は対照群よりも電気凝固群の方が高いことが判明し、慢性膵炎の発症が示されました(図4)。

図1:マウスの電気凝固によって誘発される閉塞性慢性膵炎の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:膵臓組織のヘマトキシリン-エオシン染色の経時的な変化。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ヘマトキシリン-エオシンおよびマッソン染色および膵臓の免疫組織化学。 略語:Col-1 = α-1 1型コラーゲン;SMA = α-平滑筋アクチン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:さまざまな期間のマウスの血清生化学的指標の代表的な結果。(A) 血清ヒアルロン酸濃度(μg/L)。(B) 血清ビリルビン濃度 (mmol/L)。(C)血清アミラーゼ濃度(U / dL)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

膵炎のリスクと重症度は、遺伝的要因と環境的要因の両方によって決まります⁶。臨床的膵炎の完全治癒は消化器病学の目標であり、動物モデルの作成が最初のステップです。これらのモデルを確立するにはさまざまな方法が存在し、それぞれに長所^と短所があります7^{、8、9、10、11}。

外科医は、高周波電気凝固法を使用して主膵管で管腔内熱アブレーション (ETHA) を実施し、膵臓の外分泌分泌を減らし、それによって膵頭十二指腸切除術 (PD) 後の術後膵瘻 (POPF) の発生率を低下させました ¹²。これは、膵臓萎縮を引き起こす熱アブレーションの方法が臨床現場で実施されていることを示唆しています。メチレンブルーを用いて膵管を可視化し、精密に電気凝固させることにより、閉塞性膵炎の新モデルを開発しました。

この実験のために、C57BL/6 8週齢の雄マウスを選択しました。雌マウスには生殖周期があり、体内のホルモンレベルが実験データに影響を与える可能性があります。8週齢のマウスは、成熟した体器官と良好な生活健康指数を備えた壮年期にあり、同じ年齢の雄マウスはサイズが強かった。術後 1 か月の観察で、7、14、21、および 28 日にマウス膵臓をサンプリングしました。14日目に得られた結果は、膵炎の病理学的特徴に最も一致しています。

このアプローチにはいくつかの注意点があります。まず、総胆管は肝門にできるだけ近づけて、膵管への染料の注入を容易にする必要があります。第二に、メチレンブルー染料の膵管への注入の速度と時間に注意を払う必要があります。染料溶液が少なすぎると膵管が見えず、染料溶液が多すぎると、手術野における主膵管の位置の識別が妨げられます。第三に、青色染色液が見えなくなったときに電気凝固を終了しました。これらの実験では、電気凝固されたマウス膵臓の領域が異なるため、メチレンブルー染色で示される領域で手術が行われるため、メチレンブルー染色は膵管を追跡するためです。第四に、手術中の膵臓の出血は直ちに止める必要があります。同時に、電気凝固ナイフを使用して膵臓を切断する必要があります。何らかの理由で電気凝固ナイフが膵臓にくっついている場合は、電気凝固時間を延長する必要があります。これは、膵臓漏出によって引き起こされる重篤な術後合併症の発生を防ぐ最も一般的な方法です。

ただし、この方法には欠点があります。オペレーターの熟練度は実験の結果に直接影響し、異なるマウス間での手術の均一性はモデルの成功率に影響します。このモデルは、胆石または膵管閉塞の影響をシミュレートし、急性膵炎の繰り返しの発作を引き起こし、最終的に慢性膵炎を引き起こします。これは、ビリルビンレベルの上昇を説明できる可能性があります。したがって、このモデルは、電気凝固の程度に基づく急性膵炎モデルとしても開発できます。電気凝固の3日後のマウスの膵臓での初期の実験では、急性膵炎の特徴が示されましたが、術後の合併症により、急性膵炎のモデルの成功率が低下しました。ただし、電気凝固プロセス中に電気焼灼によって発生する熱が主胆管に広がった可能性を排除することはできません。電気凝固によって急性膵炎を安定的に誘発する方法という問題は、探求する価値があります。

数週間にわたって繰り返し注射する必要がある従来のセルレイン注射法と比較して、電気凝固法は時間を節約し、より便利です。セルレイン注射は優れた安定性と操作の容易さを示しますが、電気凝固には~20分かかり、その後の実験時間を節約できます。

新しいモデルの開発は、病気の自然史を研究し、標的療法を開発することを目的としています。私たちの新しい動物モデルは、内視鏡的逆行性胆管膵管造影膵炎(ERCP)¹³を含む、マウスの膵管閉塞によって引き起こされる慢性膵炎のシミュレーションに役立ちます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16mm微小血管クリップ	ストロングァー、寧波、中国
吸収性縫合線	揚州金環医療機器工場	4-0	-
カープロフェン	上海マックリン生化学株式会社	C830557-5g	-
毛細管	タイゴン、アメリカ	AAQ(AAD)04091	0.25 x 0.3 mm
電気凝固ナイフ	順葉医療機器有限公司、寧波、中国	舜葉 BDD-YE-DF-1
アイシザーズ
ケタミン塩酸塩注入(ケタセットCIII)	ゾーティス社	S5564	-
メチレンブルー染色溶液	ソラルビオ、上海、中国	G1303
非吸収性の4-0モノフィラメントポリプロピレン縫合	中国、上海、金環市
操作顕微鏡	ムルジダー、広東省、中国	MSD203
眼科鉗子
丸頭綿棒	オルガ・シェレル、華西医療、中国
注射針	中国、浙江省ミナンク		0.25mm
組織鉗子
ティッシュシザーズ	上海普新計器技術株式会社
キシラジン塩酸塩注入	バイヤー動物健康	XYL-50-20	-