多領域In Vivo記録のための柔軟で便利な電気生理学的オプトロードを作成するための統合的手法

Summary

私たちは、電極製造のためのシンプルで費用対効果の高いアプローチを開発し、自由に動くマウスで複数の領域にわたる信号の記録を行いました。光遺伝学と多領域電気生理学およびカルシウムシグナル記録を利用することで、発作キンドリングモデルにおける領域間のニューロン活動の解明が可能になりました。

Abstract

てんかんは、複数の脳領域が関与する同期した異常放電を特徴とする神経疾患です。限局性病変は、関連する神経回路を介したてんかん信号の伝播を促進します。したがって、重要な脳領域からの局所電界電位(LFP)の in vivo 記録は、発作の伝播に関与する回路を解読するために不可欠です。しかし、現在の電極の作製・注入方法は柔軟性に欠けています。ここでは、複数の領域にわたる電気生理学的記録(LFPおよび脳波計[EEG])用に設計された便利なデバイスを紹介します。さらに、光遺伝学的操作とカルシウムシグナル伝達記録をLFP記録とシームレスに統合しました。てんかん発作中にいくつかの別々の領域で強力な後退が観察され、カルシウムシグナル伝達の増加が伴いました。この研究で使用されたアプローチは、脳の多様な領域間で同期神経記録を行うための便利で柔軟な戦略を提供します。これは、神経障害に関与する複数の領域の神経プロファイルへの洞察を提供することにより、神経障害の研究を前進させる可能性を秘めています。

Introduction

てんかんは、痙攣、感覚障害、意識喪失などの症状を呈する再発性発作を特徴とする一般的な神経疾患^です1。てんかんの根底にある病態生理学的メカニズムは複雑で、相互接続された複数の脳領域が関与しています^2,3。近年のニューロイメージングの進歩により、てんかんに関与する大規模なネットワークが明らかになりました^4,5。しかし、てんかんの発生と伝播の根底にある複雑な回路とネットワークメカニズムの理解は、多領域神経記録技術の適用が不十分であることもあって、依然として限られています⁶。したがって、異なる脳領域にわたる神経活動を同時に監視できる柔軟で統合された方法を開発することが不可欠です。

電気生理学的記録は、発作を捕捉し、てんかんの存在を決定する^{ために行われる7}。電気生理学的活動の記録を除いて、てんか^ん研究8,9では、特定の神経集団の正確なカルシウム活性にますます重点が置かれています。カルシウムインジケーター合成の進歩とさまざまなプローブ設計により、研究者は脳内のニューロン活動と神経物質の変化を捉えるためにファイバー測光を採用するようになりました^10,11。ニューロンの活動を検出する2つの独立した方法、すなわち電気生理学とファイバー測光記録は互いに補完し合い、動的なニューロンプロセスのより包括的な理解を促進します。

さらに、神経活動の同期記録と調節は、ネットワークレベルと細胞レベルの両方で脳の機能に関する洞察を得るための極めて重要です。このアプローチにより、研究者は脳の複雑なプロセスをリアルタイムで観察し、操作することができます。オプトジェネティクスは、選択的刺激または阻害のためのその独特の能力により、神経シグナル伝達を調査するための不可欠なツールとして浮上しています¹²。神経科学¹³におけるマルチサイト電気生理学的記録の広範な応用にもかかわらず、ファイバー測光および光遺伝学的操作とマルチリージョン電気生理学的記録の統合は依然として限られています。さらに重要なことに、マルチリージョン電極を製造および注入するための現在の方法は柔軟性に欠けています¹⁴。これらの制限は、特定の回路機能と複数の領域にわたる相互作用を分析する能力を妨げます。ここでは、キンドリング誘発性発作やその他の神経精神障害における領域間のニューロンプロセスに光を当てる、費用対効果が高く便利なマルチリージョン in vivo 記録アプローチを紹介します。

Protocol

このプロトコルは、復旦大学の動物管理および使用委員会から承認を受け、国立衛生研究所の実験動物の管理および使用に関するガイドによって設計されたガイドラインと規制に従って実施されました。この研究で利用される動物の数を最小限に抑えるために、可能な限りの対策が講じられました。各ステップの実行に必要な時間は、それぞれのステップに含まれています。

1. 電極の準備(図1)

1. 適当な長さのタングステン ワイヤー(~20 mm)を切って、タングステン ワイヤー(1.6-2 mm)を露出させるために一端の絶縁層を燃やし尽くします。ワイヤーのもう一方の端を「L」字型に曲げます( 図1A、~1分を参照)。
2. タングステン ワイヤの「L」端を光ファイバーに慎重に配置します ( 図 1B、~1 分を参照)。
   注:タングステンワイヤーは、光ファイバーの先端より0.2〜0.4 mm長くする必要があります。
3. 接着剤を一滴浸し、光ファイバーとタングステンワイヤの界面に塗布します( 図1C、~1分を参照)。液体の表面張力により、タングステン線が光ファイバーに付着します。
4. 接着剤を一度塗布し、乾かします。次に、2回目のコートを塗ります。これにより、タングステン ワイヤと光ファイバーの間のボンディングがさらに強化されます ( 図 1C、~1 分を参照)。
   注:塗布プロセス中は、接着剤が光ファイバーの先端に流れないように注意する必要があります。これは、その透過率に影響を与える可能性があるためです。
5. 「L」字型の角で、接着剤を使用して光ファイバーのベースとタングステンワイヤーを密着させます(~1分)。
   注:接触面積の増加と接着剤液滴の球状固化により、光ファイバーとタングステンワイヤとの間の強固な結合が保証されます。
6. はんだ付けを使用して、タングステン ワイヤとメス コネクタのピンとの間に接続を確立します ( 図 1D を参照、それぞれ ~3 分)
   注:タングステンワイヤは熱に敏感ではないため、ピンスロットの位置を切断して2つのコンポーネントを物理的に結合する金属スリーブにより、はんだ付けの成功率をほぼ100%に高めることができます。その後、スリーブにはんだを充填することで、挿入されたタングステンワイヤとピンとの間の安定した接続が保証されます。
7. 実験計画に従って、必要な数のオプトロッドをはんだ付けします ( 図 1E、~10 分を参照)。
   注:この研究では、3つのオプトロードが使用されました。
8. エナメル線を適切な長さ(~30 mm)に切断し、両端の絶縁体を焼き払います。エナメル線の一端をネジの付け根に巻き付けてはんだ付けします。エナメル線のもう一方の端をはんだごてを介してメスコネクタのピンに接続し、頭蓋骨電極のEEG記録およびアース接続として機能します( 図1F、~5分を参照)
   注意: エナメル線の柔軟性により、頭蓋骨とメスコネクタのピンを接続すると便利です。エナメル線をネジに巻き付けた後のはんだ付けは、表面実装はんだ付けよりも信頼性が高くなります。
9. メスコネクタのピンアレイにホットメルト接着剤を塗布してメスコネクタをカプセル化し、はんだ接合部が完全に包まれていることを確認します。ホットメルト接着剤の固化中に、プラスチックボードを使用して接着剤を成形し、注入中のスペース占有を最小限に抑えます( 図1F、~3分を参照)
   注:ホットメルト接着剤の使用には火傷のリスクがあるため、AB接着剤はより安全な代替品と考えられています。
10. 次に、光量計とデジタルマルチメータを使用して、光度と導電率を測定します。これらのテストに合格すると、セットアップを使用できるようになります ( 図 1G、~2 分を参照)。
    注意: レーザーを使用するときは、レーザー光の特定の波長と出力に適した保護メガネを常に着用してください。高品質のファイバーは、パッチコードの端から埋め込み型ファイバーの先端までの光の少なくとも80%を透過する必要があります。さらに、タングステンワイヤの先端からピンヘッダースロットまでの抵抗を、1〜5 Ωの許容範囲で測定しました。
11. 使用前に、調製した電極を75%アルコールに15分間浸し、滅菌生理食塩水に移します(~16分)。
    注:カプセル化された電極デバイスの総重量(0.6701 ± 0.01123 g、n = 4)は、マウスの活動に影響を与えません。電極は、プラズマ滅菌を使用して事前に滅菌されます。

2. 電極埋め込みのプロトコール(図2)

1. マウスをイソフルラン (2%-4%) で麻酔し、定位固定装置に固定します ( 図 2A、~2 分を参照)。麻酔下での乾燥を防ぐために、マウスの目に目の軟膏を使用してください。頭蓋切開部の周囲の皮膚にリドカインを塗布し、5 mg / kgの用量でカルプロフェンを皮下注射します。.
   注:適切な麻酔は、立ち直反射の欠如とつま先の挟み込みに対する反応の喪失によって確認されます。長時間の外科的処置には、注射可能な麻酔薬を使用するのがより適切です。
2. 動物を定位固定装置に固定した後、頭蓋骨の端に沿って頭皮を切り取り、頭蓋骨の表面を75%アルコールで拭いて、ブレグマとラムダの位置を露出させます( 図2B、~3分を参照)。
   注:術前の手順には、髪の切り取り、手術部位の消毒、器具と手術器具の事前滅菌が含まれます。
3. マイクロドリルを使用して、脳を水平にし、関心領域(ROI)の上に穴(~0.8 mm)をドリルで開けます。シリンジポンプで関連するウイルスを注入します( 図2C-F 、~20分を参照)。
   注:この研究のウイルスとROIに関する詳細情報は、 材料の表 と 図3に示されています。
4. オプトロードをホルダーで持ち、先端をブレグマポイントに移動し、この位置を「ゼロ」に設定します。ブレグマ点を参照座標として使用して、オプトロードをターゲット領域に移動します ( 図 2G、~3 分を参照)。オプトロードをウイルス注入部位の0.3mm上に配置します。
   注:垂直注入戦略では、2つの電極間の最小距離は、光ファイバースリーブの厚さとフェルールの外径に応じて約2mmです。角度付き挿入方式は、近接した領域からの同時記録に使用できます。
5. 光ファイバーを対応する脳領域に挿入した後、露出した組織を覆うためにそれらの周りに少量の組織接着剤を塗布します。次に、追加の接着剤と少量の歯科用セメントを順番に塗布します。歯科用セメントが固まったら、ホルダーを慎重に離します ( 図 2H、~5 分を参照)。
6. 新しいオプトロード移植の前に、ステップ2.4を繰り返す再キャリブレーションを行います( 図2Iを参照)。
   注:移植ごとに、オプトロードをbregmaで「ゼロ」ポイントとして配置します。
7. すべてのオプトロードを埋め込んだ後、ラムダポイントの後ろに「Ground」、新皮質の上に「EEG」の穴をマイクロドリルでドリルで開けます(~1分)。
   注意: ドリル穴のサイズ (~1.1 mm) は、ネジの直径と一致する必要があります。
8. 皮質の上とラムダポイントの後ろの穴に頭蓋骨のネジを挿入します( 図2J、~5分を参照)。
   注意: 頭蓋骨ネジは、それぞれEEGの記録と接地に使用されます。
9. タングステンワイヤーとエナメルワイヤーを整理して、移植領域の上に配置され、頭蓋骨の外側に露出しないようにします。ホルダーを使用してメスコネクタの位置を固定します( 図2K、~2分を参照)。
10. 移植部位に歯科用セメントを充填して、電極デバイスと頭蓋骨との間の安定した接続を確保します。内部ワイヤをカプセル化し、メス コネクタの挿入穴を露出させてヘッドステージに接続します ( 図 2L、~6 分を参照)。
11. 歯科用セメントが硬化した後、露出した頭皮の周囲の皮膚にヨウ素を塗布し、動物を加温パッドの上に置きます(~1分)。
    注:動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物が放置されていないことを確認してください。サバイバル手術中は、無菌状態を維持する必要があります。
12. 抗生物質と鎮痛薬を投与して、術後の回復をサポートします。
    注:手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物の会社に再紹介されません。動物にセフトリアキソンナトリウム(180 mg/kg)の腹腔内注射、カルプロフェン(5 mg/kg)の皮下注射、およびリドカインゲルを手術創に3日間毎日適用した。動物は、行動試験を完了するために指定された期間生存する必要があります。その後、4%〜5%のイソフルランを使用して安楽死させ、続いて灌流と組織切片化を行い、ウイルス感染と電極移植部位を評価します。

3. 生体内 脳記録プロトコール

1. 信号記録および行動試験(オープンフィールドテスト)¹⁵を実施する前に、マウスが環境に順応するために3日間の穏やかな取り扱いを受けることを確認してください。
   注:本研究では、マウスを野外(42cm×42cm)に配置して自由に動き回らせ、マウスの発作行動を観察することができました。
2. マウスにイソフルラン(2%-4%)で麻酔をかけた後、記録部位の順に光ファイバーを順番に接続してからヘッドステージを挿入します。
3. 635 nmの光パルスを20 Hzで10 %のデューティサイクルで設定します。記録中は、光刺激を10秒(200パルス)に設定します。光ファイバー先端の強度を3mWに設定します。
4. ファイバー測光システムを使用して、30 Hz×470 nm LEDチャネルのサンプリングレートでGcamp6m信号の動作テスト期間を記録します。
5. 光遺伝学的刺激下でのカルシウムシグナル、LFP、およびEEGを、対応する行動パフォーマンスとともに同時に記録します( 図3を参照)。
6. トランジスタ・トランジスタ・ロジック(TTL)信号同期タギングを採用して、記録されたデータの時間的一貫性を確保します。

4. データ処理

1. 測光データをMATLABソフトウェアに読み込みます。次に、カスタムコーディング(補足ファイル1)を使用して、カルシウムシグナルのトレンドを下げます。
2. 式 (1) で蛍光強度の変化を定義します。
   ΔF/F = (F_t - F₀)/ F₀ (1)
   ここで、F_t はリアルタイムのカルシウムシグナル蛍光値を表し、F₀ はイベント前の平均ベースライン蛍光強度を示します。
3. 1000 Hz のサンプリング レートの電気生理学的データを MATLAB にインポートします (補足ファイル 2)。
4. カルシウムシグナル伝達と電気生理学的データの表示を同期マーカーと整列させて調整します。

Results

光遺伝学を多領域電気生理学的記録およびカルシウムイメージングと組み合わせて、光遺伝学的発作中のさまざまな脳領域にわたるニューロン活動を観察しました。この目的のために、CaMKIIαプロモーター(AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)¹⁶ の制御下でChrimsonRを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)を、げっ歯類の古典的てんかん原性部位である梨状皮質(ROI1)¹⁷に注射した。さらに、AAV-hsyn-Gcamp6m¹⁸ を3つの領域( 図3Aに示すようにROI1-3)に注入しました。その後、カスタムメイドのオプトロードをこれらの領域に埋め込み、対側の頭蓋骨にEEG電極を埋め込みました(図3B)。

ChrimsonRとGcamp6mは、4週間後に標的脳領域で高発現しました(図3C)。マウスは、ChrimsonR陽性ニューロンを活性化するために20Hzで10秒間の短時間光刺激を行った後、全般性発作行動を示しました。自由に動くマウスのROIからカルシウム活性とLFPシグナルを、マルチファイバー測光と電気生理学の同時技術を用いて収集しました(図3D)。これらの領域では、Ca²⁺ 活性の顕著な増加とともに、強力な後放電が短時間の光遺伝学的刺激によって誘発されました(図3E)。30Hzのサンプリング周波数で青色光LEDを介して光遺伝学的タンパク質の活性化によって誘導される光刺激領域で30Hzの応答が観察されました。これらの結果は、光遺伝学的刺激下での複数の領域にわたる同期した電気生理学的およびカルシウムシグナル伝達応答の信頼性の高い記録を実証しました。

図1:フレキシブルオプトロードの概略設計 (A)「L」字型のタングステン線と光ファイバーの準備。(B)光ファイバーとタングステン線を粘着テープ上に配置した。(C)光ファイバーとタングステン線を接着剤でくっつけました。(D,E)タングステンワイヤはコネクタに溶接されました。(F)ネジをコネクタに溶接し、コネクタをホットメルト接着剤でカプセル化しました。(G)オプトロードアセンブリの品質検査が実施されました。Gは接地電極のピンホールを表します。Rは基準電極のピンホールを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:移植手術のワークフロー (A)マウスを定位固定装置に固定した。(B)頭皮が取り除かれ、頭蓋骨が十分に露出していた。(C)注入ガラスパイプをポンプに接続しました。(D)マウスの頭を水平位置に調整しました。(E,F)穴を開け、ウイルスを注入しました。(G)オプトロードがホルダーによってつかまれました。(H)オプトロードを関連領域に埋め込み、歯科用セメントで固定した。(I)各移植前にゼロ位置を再調整します。(J)オプトロード埋め込み後にEEG電極を埋め込みました。G / R:接地電極と参照電極がピン位置で短絡しました。(K)ワイヤーを順番に並べ、コネクタを固定しました。(L)電極装置を歯科用セメントで包み固定しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3: in vivo 同期電気生理学的およびカルシウム記録。 (A)ウイルス注射の実験デザイン。(B)オプトロード移植の実験的スキーム。(C)共焦点画像は、標的領域でのウイルス発現を示しています。スケールバー=200μm.(D)光遺伝学的刺激、同期電気生理学的、および自由に動く状態でのカルシウム記録の概略図。(E)カルシウム信号(上)、LFP(中)信号、EEG(下)、および対応するパワースペクトログラムの代表的なトレース。赤い線:10秒のライト。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:カルシウムシグナルのコーディングファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:LFP信号のコーディングファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

ここでは、複数の領域にわたる in vivo 神経信号の記録のために、自作のオプトロードデバイスを採用しました。このシステムの同時光遺伝学的刺激、カルシウムシグナル記録、および電気生理学的記録の実現可能性が検証されています。本明細書に記載の電極調製方法は、効率的かつ費用対効果が高い。実験計画によれば、関連する脳領域からの信号を記録することができました。オプトロードの戦略的な配置により、脳全体の複数の領域から豊富な情報を抽出できる可能性があります。マルチモーダル検出パラダイムの統合は、複雑な神経回路を解剖し、脳領域間の関係を解明する機会を提供します。

本研究の代表データでは、脳の局所領域全体の広域スペクトルニューロンからのカルシウム信号と電気生理学的信号が同時に記録されました。トランスジェニック動物作製技術の進歩^19,20に続いて、Cre-マウスとFlpO-マウスと発現-Gcampウイルスの組み合わせにより、特定のニューロンからの神経活動の記録が可能になる。したがって、この方法により、これらの統合されたアプローチを通じて、さまざまな脳領域にわたる特定のニューロンの応答を解読することができます。さらに、多様な分析方法は、複数の脳領域から収集された電気生理学的およびカルシウム信号を分析するのに役立ちます。例えば、コヒーレンス分析とグレンジャー因果分析は、異なる脳領域21,22,23間の新しい理論的コミュニケーション特性を得るために採用することができる。さらに、回路追跡技術の進歩は、脳領域間の構造的接続を解明するのを助けます²⁴。これらの統合技術は、さまざまな脳領域にわたる関連する応答の理解を強化し、回路とネットワークにおける接続と相互作用の理解に革命をもたらしました。

本研究では、てんかんの光遺伝学的キンドリングモデリングを採用しました。オプトジェネティクスは、てんかんのキンドリングモデルにおいて、電気刺激と比較して、より高い時間分解能だけでなく、細胞特異性も向上させます^25,26。また、光の送達とカルシウムの記録を同じ光ファイバーで行うことができます。多領域活動検出と光遺伝学的調節は、閉ループてんかん介入法を補完し、抑制性調節を介して複数の脳領域にわたる調節介入を可能にし、それによって抗てんかん効果を強化します^27,28。また、これらのデバイスを他の既存の神経調節技術と組み合わせて、慢性疼痛の検出と閉ループ介入を行うことも重要です^29,30。また、このアプローチは、睡眠障害³¹やアルツハイマー病などの他の神経疾患にも及ぶ可能性があり、40Hz振動や感覚入力後の情報処理などの現象は、多領域のin vivo記録³²による解明を必要とする。したがって、この多面的なアプローチを巧みに適用することで、複数の領域間の相互作用についての理解を深め、さまざまな疾患における精密治療に貴重な洞察を提供することができます。

このオプトロード検出法には限界があり、今後の研究で改善される可能性があります。LFPシグナルは容易に取得できましたが、現在の方法ではスパイク活性の検出は依然として困難でした³³。タングステン線をマルチチャンネルフレキシブル電極に置き換えることを目指しています。繊維の厚さと接着剤の安全性は慎重に検討する必要があります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-32	アダプターPlexon	カスタムオーダー	メスコネクタとヘッドステージ
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry	Taitool Bioscience	S0371-9	4 x 1012 VG / mL
AAV-hsyn-Gcamp6m	Taitool Bioscience	S0471-9	4 x 1012 VG/mL
DAPI	シグマ	236276	力価1:500
歯科用セメント	新世紀歯科	用430205
電気生理学的記録システム	プレクソン	オムニプレックス
線	N/A	カスタムオーダー	直径= 0.2 mm
メスコネクタ	N/A	カスタム	オーダー1.25mmピッチ
グルー	ロックタイト	45282
レーザー	長春新産業	BH81563	635nm
MATLAB	MathWorks	R2021b
Microdrill	RWD	78001
マルチチャンネルファイバー測光	ThinkerTech	FPS-SS-MC-LED
光ファイバー	Xi'an Bogao	L-200UM	対象となる脳領域の深さに基づいて、適切なファイバー長を選択します。
PFAコーティング	ワイヤーAMシステム	795500	ベア0.002インチ;コーティングされた0.0040 "
パワー	メーターThorlabs	PM100D
脳定位固定装置Fxrame	RWD	68807
ティッシュ接着剤	3M	1469SB