この記事では、95%エタノールをマウスの子宮に1〜3分以内に注入することにより、死亡率が非常に低く、子宮内癒着が最小限に抑えられた、信頼性と再現性のある薄い子宮内膜を作製するための詳細なプロトコルについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
薄い子宮内膜(TE)は、不妊症の重大な原因として広く認識されています。しかし、TEの病因は依然として不明であり、満足のいく治療選択肢が依然として緊急に必要とされています。TEの動物モデルはいくつか開発されていますが、腹部手術と95%エタノールの注射を含むマウスモデルは、死亡率が高く、正しく行われない場合の子宮内癒着のリスクがあるため、手ごわい課題を提示します。ここでは、95% エタノールをさまざまな注入時間でマウスの子宮に注入することにより、死亡率が非常に低く、子宮内癒着が最小限に抑えられる信頼性と再現性のある TE を生成する詳細なプロトコルについて説明します。その結果、すべてのマウスが、1〜3分の注入時間でTEを成功裏に開発し、典型的な子宮内膜の厚さと腺数の減少、および過度の子宮内膜線維症を特徴とすることが示されました。これらの知見は、このマウスモデルが薄い子宮内膜の研究に適しており、将来のTE治療を開発するためのプラットフォームとして役立つことを示唆しています。
概要
薄い子宮内膜(TE)は、産婦人科で重篤な状態であり、出産可能年齢の女性によく発症します。TEは、超音波スキャンで子宮内膜の厚さが7mm未満で、正常な子宮腔を伴い、妊娠失敗と密接に関連している場合に診断されます1,2。体外受精(IVF)治療を受けている女性の約1.5%〜9.1%がTEを経験すると推定されており、生殖医療ではますます課題となっています3,4,5。TEの最も一般的な原因は、子宮内癒着(IUA)および掻爬術の外科的分離後の不適切な子宮内膜修復を含み、これはしばしば血管分布の破壊およびまばらな腺6,7,8を伴います。これまで、TEの根底にある細胞および分子メカニズムは不明のままです。TE患者の子宮内膜の回復には時間がかかりますが、エストロゲン治療と低用量アスピリン療法が潜在的な介入として検討されています9。したがって、TE の病因の詳細な研究は、この疾患の課題に対処するための最も直接的なアプローチです。しかし、TE の病因に関する研究は動物モデルに依存しているため、適切なモデルの選択が重要になります。
薄い子宮内膜(TE)のほとんどの病理組織学的研究は、上皮細胞とマクロファージの増殖障害、卵巣ステロイドホルモン受容体の発現減少、細胞外マトリックスの過剰な沈着、および細胞老化がTEの最も重要な病理学的特徴であることを示しています6,9,10。現在、TEを模倣するために、引っ掻き傷11,12,13、虚血14、熱傷害15、および化学的損傷16,17,18,19によって誘発されるモデルを含む、さまざまなラットモデルが開発されています。ラットモデルは、針またはカテーテルで子宮内膜を引っ掻くことによって誘発され、多くの場合、TE 11,12,20,21,22ではなく子宮内癒着(IUA)を引き起こします。ラットの虚血誘発性TEモデルも報告されており、子宮内膜虚血は両側子宮動脈結紮を行うことで達成され、子宮内膜の厚さが減少します。しかし、この方法は3ヶ月を要する時間がかかり、研究にはあまり使われていない14。熱傷誘発モデルでは、人工授精管を使用して、85°Cの予熱水を子宮角の片側の合流点を通じて子宮角の片側に注入するため、他の方法よりも複雑になります15。化学的に誘発されるモデルでは、露出した子宮角に95%のエタノールを注入して、子宮内膜全体を損傷します。このモデルは、TEの病理学的メカニズムと治療を研究するための低コストと短い実験期間の利点を提供しますが、マウスではなく主にラットで使用されます16,17,23。さまざまな動物モデル、特にラットモデルが存在しますが、それぞれに制限があります。彼らはTEの特定の側面のみをシミュレートすることができ、TEの疾患特性を厳密に再現しながら、研究に便利で汎用性の高いマウスモデルはほとんどありません。
これに関連して、我々は、改良された方法24 (図1)を用いた時間勾配アプローチを用いて子宮腔内に95%エタノールを注入することにより、新規の薄い子宮内膜(TE)マウスモデルを開発しました。その結果、注入時間が1〜3分の範囲のときに、すべてのマウスがTEの発症に成功し、子宮内膜の厚さの減少、腺の減少、子宮内膜線維症の増加などの典型的な特性が示されました。これらの知見は、私たちのマウスモデルがTEの研究に適したツールであり、将来のTE治療を開発するためのプラットフォームとして役立つことを示唆しています。
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プロトコル
本試験は、すべての動物実験が実施された深セン中山産婦人科病院(旧深セン中山泌尿器科病院)の動物実験委員会によって承認されました。この研究では、雌のC57BL/6マウス(生後6-8週齢、体重18-20g)を用いた。すべての動物を同じ部屋の特定の病原体を含まない(SPF)環境に収容し、実験前の1週間、特定の病原体のない部屋で(22 ± 1)°C、12時間の明暗サイクルで順応させました。彼らには、食料と水への自由なアクセスが提供されました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。
1.発情の識別
注:マウスの発情期は、ヒトの後期黄体期に匹敵し、この時点では子宮内膜が比較的厚くなっています。発情期のマウスをモデル誘導に選択することで、マウスが比較的一貫した生理学的状態にあることが保証されます。さらに、子宮内膜の薄化の結果は、子宮内膜の厚さが比較的厚い場合により顕著になります。この手順の詳細については、以前に公開されたレポート25、26 を参照してください。
- ピペットを使用して20μLの生理食塩水を調製します。マウスの耳の両側をつかみ、マウスの尻尾を固定することで、ピペットの先端を膣口に約2mmの深さまで優しく挿入します。20μLの生理食塩水を膣内に注入し、5サイクル穏やかに洗い流します。
- 生理食塩水を引き出し、きれいなスライドに均等に移します。室温で蒸発させ、自然乾燥させます。
- 各スライドに30 μLのエタノールを塗布して、細胞を固定します。スライドが乾くまで、エタノールを5分間蒸発させます。
- 各スライドに50 μLのクリスタルバイオレット染色溶液を塗布し、細胞を室温で10分間染色します。
- 各スライドを脱イオン水ですすいで、余分な色素を取り除き、非特異的な染色を減らします。
- 細胞の形態を観察し、顕微鏡下で細胞の種類の割合を決定します。
- マウスの発情周期を2回連続して観察し、安定性を確保します。実験のために3回目の発情期のマウスを選択します。
注:マウスの発情周期は通常4〜5日続き、発情前、発情期、および発情期の4つの段階に分けられます。発情前細胞は約24時間持続し、丸いから楕円形の有核上皮細胞を特徴としています(図2A)。発情は12時間から48時間続き、主に有核性角化上皮細胞を特徴としています(図2B)。Metestrusは最大24時間持続し、無核の角化上皮細胞と好中球の混合物を特徴としています(図3C)。Diestrusは48時間から72時間持続し、好中球、有核上皮細胞、および少数の無核角化細胞の組み合わせによって特徴付けられます(図2D)。
2. グループ設計
注:TEモデルの安定性に対する95%エタノール注入のさまざまな期間の影響を評価するために、6つの治療グループが確立されました。1つのグループは、手続き上の効果のコントロールとして機能するために、エタノール投与なしで偽の手術を受けました。エタノール誘導TEのマウスは、注入時間(n = 5/グループ)に基づいて、次のように5つの治療グループにランダムに分けられました。
- 1分グループ:エタノールを子宮腔に1分間注入します。
- 2分グループ:エタノールを子宮腔に2分間注入します。
- 3分グループ:エタノールを子宮腔に3分間注入します。
- 4分グループ:エタノールを子宮腔に4分間注入します。
- 5分グループ:エタノールを子宮腔に5分間注入します。
3. マウスにおけるTEモデルの誘導
- 5% イソフルランと 100% 酸素を含む麻酔器を使用してマウスに 3 分間麻酔をかけます (施設で承認されたプロトコルに従います)。ノーズコーンを使用して1%〜3%イソフルランで麻酔を維持します。.麻酔中の乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医用軟膏を塗布します。手順全体を通してつま先をつまんで呼吸数を監視します。
- 医療用テープを使用してマウスの手足を固定し、電子毛布で予熱した手術台の上でマウスを仰臥位に保ちます。マウスの舌を少し引っ張って、気道閉塞を防ぎます。
注:手術中にマウスを温めておくと、免疫機能と血液循環を維持し、凝固を防ぐことができます。さらに、マウスの舌を引き抜くことで、麻酔中の窒息を避けるために透明な気道を確保できます。 - 動物の脱毛クリームをマウスの下腹部に3分間塗布します。きれいなワイプで髪を取り除きます。75%エタノールとヨードフォアでその領域を消毒します。
- 尿道口から1cmの腹部に1cmの切開を行います。滅菌ハサミと鉗子を使用して、切開部を腹腔まで延長します。
- 滅菌鉗子で内臓をそっと脇に動かして子宮の位置を特定し、右の子宮角を露出させます。子宮頸部近くの近位端と卵巣近くの遠位端に止血クランプを適用します。
注:子宮角の両端をクランプすることで、エタノール注入時の漏れを防ぎ、子宮頸部、膣、卵巣の損傷を防ぎます。 - 針を子宮角の方向に平行にして、25Gシリンジを使用して約50μLの95%エタノール27 を子宮腔に注入します。.針を子宮腔に30度の角度で挿入します。必要に応じて、シリンジを1分、2分、3分、4分、または5分間保持します。エタノールを引き出し、子宮腔を滅菌生理食塩水で5回洗い流して、残っているエタノールを取り除きます。同様に、同じ手順に従って、対照として同量の滅菌生理食塩水を左子宮角に注入します。
注意: シリンジ針が子宮角の方向に平行であることを確認してください。針が子宮角全体を横切るのを防ぐために急すぎる角度で針を挿入することは避けてください。エタノールをできるだけ完全に回収して、持続的な損傷や実験の不安定性を避けてください。 - クランプを取り外し、子宮と内臓を元の位置に戻します。
- 5-0 吸収性ポリグリコリド外科用縫合糸で腹膜を縫合し、続いて表皮を 5-0 非吸収性ポリグリコリド外科用縫合糸で縫合します。
- 切開部を75%エタノールとヨードフォアで消毒し、動物をケージに戻します。手術後、マウスの心拍数が完全に回復して正常に動くようになるまで、マウスの心拍数が徐々に着実に増加するかどうかを注意深く観察します(図3A-H)。
注: 経口鎮痛薬 (飲料水中のアセトアミノフェン 3.2 mg/mL) は、手術の前日に提供され、残りの研究を通じて継続されました。 - 毎日9:00と15:00にマウスを観察し、切開部をヨードフォアで消毒して、マウスの状態が良好であることを確認します。
4.サンプル収集
- 95% エタノール治療の 7 日後に深い麻酔下で、頸椎脱臼によってマウスを安楽死させます (施設で承認されたプロトコルに従います)。
- 手術用ハサミを使用して子宮を露出させるために縫合糸をカットします。
- 外科用鉗子を使用して、子宮全体を慎重かつゆっくりと抽出します。子宮を周囲の内臓から切り離します。
- すぐに両方の子宮角を取り除き、各角を3〜4個の小さなセグメントに分割します。
- ピペットを使用して、1 mLの4%パラホルムアルデヒドを1.5 mLの微量遠心チューブに加えます。固定のために子宮組織を4%パラホルムアルデヒドで24時間保存します。
5. 組織の脱水症状
注:組織の脱水は、自動ティッシュプロセッサーを使用して行われます( 材料の表を参照)。
- ホルマリン固定サンプルを組織カセットに入れます。
- 組織カセットを一連の増加エタノール濃度を介して移動させ、次のように組織を脱水します:1時間で70%エタノール、1時間で85%エタノール、95%エタノールを2回(各1時間)、および100%エタノールを2回(各1時間)。
- エタノールを100%キシレン(最初の浸漬で135分、その後の2回の浸漬ごとに20分)に交換して、パラフィンが組織に浸透するようにします。
- ティッシュカセットを60〜65°Cのインキュベーターでパラフィンに浸し(3回、各140分)、カセットを包埋するまで保温します。
6.パラフィン埋め込み
注:これらの手順は、モジュール式の組織包埋センターを使用して実行します( 材料の表を参照)。
- ワックス型に溶融パラフィンワックスを充填し、55°Cに加熱します。
- 加熱された鉗子を使用して、浸潤したセグメントを埋め込みカセットからワックス型にすばやく移し、各セグメントの断面が金型のベースと平行になるようにします。
- セグメントが適切に配置されたら、包埋カセットの底部を組織型の上に置きます。
- 4°Cに設定した冷却プレートに金型を直接置き、少なくとも20分間放置して、パラフィンを固化させます。
- ワックスが固まったら、サンプルを型から取り出し、パラフィントリマーを使用して周囲の余分なワックスをトリミングします。
7. パラフィン切片
- 42°Cのウォーターバスを準備します。 パラフィンブロックをカットする前にコールドプレートに置き、冷ましてトリミングしやすくします。
- パラフィン包埋標本を組織表面を上にして回転式ミクロトームにクランプします。
- 一度に20μmずつ切片にして、所望の組織面に達するまで組織を覆っている余分なパラフィンを除去する。
- 一度に4μmの切片をカットします。
- パラフィン切片のリボンを42°Cの温水浴に2分間移します。
- 水面から切片を拾い上げ、展開後に顕微鏡スライドに置きます。
- スライドを60°Cのインキュベーターで30分間乾燥させます。
8. ヘマトキシリンおよびエオシンの染色
注:ヘマトキシリンおよびエオシンの染色は、自動スライドステイナーマシンを使用して行います( 材料の表を参照)。
- 染色手順を開始する前に、すべての試薬を事前に準備してください。
- スライドを100%キシレンにそれぞれ10分、5分、3分浸します。
- 次のように、脱イオン水で減少するエタノールシリーズのスライドを再水和します:100%エタノール、95%エタノール(2回)、および80%エタノール、それぞれ2分間。
- スライドを脱イオン水ですすいでください。
- スライドをヘマトキシリン溶液で10分間染色します。スライドを脱イオン水で1分間、または水が紫色でなくなるまですすぎます。
- スライドを0.5%酸性エタノール分化溶液に毎回3〜5秒間2回浸します。スライドを脱イオン水で1分間すすぎます。
- スライドをブルーイングバッファー(1%アンモニア溶液)に1分間置きます。スライドを脱イオン水で1分間すすぎます。
- スライドを80%エタノールで脱水し、次にエオシン-Y作業溶液に10秒間浸します。
- スライドを95%エタノールに移し、それぞれ10秒間2回すすぎます。次に、スライドを無水エタノールに移し、それぞれ10秒間2回脱水します。
- スライドを100%キシレンに浸して、組織を2回、それぞれ2分間透明にします。
- ティッシュペーパーの上にカバースリップを置き、天然樹脂で密封します。
9. マッソン染色
- スライドを100%キシレンにそれぞれ10分間、5分間、3分間浸して組織を脱パラフィンします。
- 脱パラフィン後、スライドを脱イオン水(100%エタノール、95%エタノール(2回)、および80%エタノール)にそれぞれ2分間、減少するエタノールシリーズに浸します。
- スライドを脱イオン水ですすいでください。
- スライドをヴァイゲルトの鉄ヘマトキシリン溶液で5分間染色し、次にスライドを脱イオン水で30秒間洗浄します。
- スライドを1%塩酸アルコールで15秒間インキュベートすることにより、染色された組織構造の色を区別します。
- スライドを脱イオン水で30秒間すすぎます。
- 組織をBluing溶液で3〜5分間インキュベートします。
- スライドを脱イオン水で30秒間すすぎます。
- スライドをポンソー酸フクシン溶液に5〜10分間入れます。
注:脱イオン水と弱酸溶液を2:1の比率で混合して、弱酸作動溶液を調製します。 - スライドを弱酸作業溶液で30秒間すすぎます。
- ホスホモリブデン酸溶液中で組織を1〜2分間分化し、次いで切片を弱酸作動溶液で30秒間すすぎます。
- 組織切片をアニリンブルー溶液で1〜2分間染色します。
- 組織切片を95%エタノールで2〜3秒間すばやく脱水し、続いて100%エタノールをそれぞれ5〜10秒間2回脱水します。スライドをキシレンで2回、それぞれ1〜2分間クリアします。
- ティッシュペーパーの上にカバースリップを置き、天然樹脂で密封します。
- 余分な樹脂を排出し、スライドを乾かします。
10. イメージングと解析
- スライドスキャナーシステムを使用してセクションの画像をキャプチャします。
注意: セクションの概要については、4倍または10倍の対物レンズを使用してください。より詳細な画像を得るには、20倍から100倍の対物レンズを使用してください。 - HALO画像解析プラットフォームを使用して、子宮内膜の厚さ、腺の数、および組織線維症の程度の定量分析を実行します。
注:平均厚さは、ランダムに選択された5つの視野で子宮腔から子宮筋層までの垂直距離を測定することによって得られます。
11. 統計分析
- SPSS バージョン 23.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) を使用して統計分析を行います。
- 最初に正規分布検定を実行して、対照群とモデル群の間の実験的差の統計的有意性を評価します。
- SEM±平均として正規分布するデータを表示します。
- 一元配置分散分析を使用して、さまざまな治療グループのデータを分析します。Bonferroni法を使用して、各遺伝子座でテストされた対立遺伝子の数を多重比較するように調整します。 P値<0.05を統計的に有意なものと考えます。
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結果
薄い子宮内膜(TE)の主な特徴は、子宮内膜の厚さと腺密度の減少、および子宮内膜線維症の増加です。この方法により、これらの特性をモデルマウスで再現することに成功しました。データ解析の結果、1分投与群(222.3μm±13.96μm対359.2μm±12.41μm、P <0.05)、2分投与群(168.7μm±17.57μm対359.2μm±12.41μm、P < 0.05)、3分投与群(131.8μm±359.2μm±12.41μm)で子宮内膜の厚さが有意に減少したことが明らかになりました。 P < 0.05) を対照群と比較した場合。しかし、2分群と3分群の間で子宮内膜の厚さに有意差は認められませんでした(168.7μm±17.57μm対131.8μm±3μm、P>0.05)(図3A、B)。
子宮内膜腺の数は、対照群と比較し...
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ディスカッション
TEは、細胞増殖が不十分で細胞が機能不全であることが特徴で、不妊症、反復流産、胎盤異常と密接に関連しています2,3。残念ながら、現在のところ TE に対する有効な治療法はありません。動物モデルは、この状態を研究する上で重要な役割を果たします。2014年から2024年の間に、ラットは208,000件の研究のうち16.4%(34,200件)、マウスは22.7%(47,300件の研究)でモデル生物として使用されました。実験におけるマウスの使用の増加は、他のモデルに対するマウスの利点、特に再生研究におけるマウスの可能性に起因する可能性がある28,29,30。モデルの一貫性の重要性を考えると、マウスをモデルとして使用して研究を行うための、より互換性のあるツールの必要性が高まってい...
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
匿名の審判の方々には、重要で有益なコメントをいただき、誠にありがとうございます。この研究は、深セン科学技術プロジェクト(No.JCYJ20220818103207016)および広東省基礎応用基礎研究財団(No.2024A1515010478)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 麻酔器 | RWDライフサイエンス | R530 | 小動物用移動式吸入麻酔器 |
| 0.9%生理食塩水 | 湖北ケルン製薬 | C230817A2 | 10 mL、医療用注射 |
| 75% エタノール | LIRCON | 6303060031 | 500 mL、消毒試薬 |
| 95% エタノール | 広州化学試薬工場 | 64-17-5 | 500 mL、化学試薬 |
| 吸収性縫合糸 | Jinhuan Medical | CR537 | 厚さ: 5-0;長さ:90 cm |
| 水性アンモニア | MilliporeSigma | 1336-21-6 | 1000 mL、化学試薬 |
| 自動ティッシュプロセッサ | ライカ | TP1020 | 100包埋ボックスは一度に処理できます |
| C57BL/6マウス | 南医科大学実験動物センター | ||
| Eosin-Y | BASO | BA4024 | 1000 mL、パラフィン切片、凍結切片などの染色に使用 |
| ヘマトキシリン | BASO BA4041 | 1000 mL、パラフィン切片、凍結切片などの染色に使用 | |
| HALO Image Analysis Platform | Indica labs | この装置は、使いやすさと拡張性、強力な分析機能、最速の処理を特長としています速度 | |
| 止血クランプ | HUAYON | 18-5021 | 全長 1.8 cm と 0.7 cm 顎 |
| 止血鉗子 | HUAYON | 18-5020 | 全長 10 cm |
| HistoCore ロータリー ミクロトーム | ライカ | 149BIO000C1 | スライスの厚さは 1 から 60 μm |
| Indorphor | ADF | 1005 | 500 mL、消毒試薬 |
| イソフルラン | RWD ライフサイエンス | R510-22-10 | 100 mL、有効成分 100% イソフルラン |
| マッソンのトリクローム染色 | SOLARBIO | G1340 | 7 × 100 mL 100 回の検査 |
| 顕微鏡スライド | Gene Tech | GT100511 | 長さ: 75 cm;幅:25cm |
| モジュラーティッシュエンベディングセンター | ライカ | EG1150 C | この装置には、コールドステージと加熱パラフィン分配モジュールが含まれており、埋め込み作業に柔軟性を提供します |
| 天然樹脂 | SAKURA | 4770 | 樹脂コーティングフィルム、組織学染色に適しています |
| オリンパス SLIDEVIEW VS200 | PANOVUE | VS200 | この装置は、高品質の仮想スライド画像をキャプチャし、高度な定量的画像分析を可能にします |
| パラホルムアルデヒド固定液 | Servicebio | G1011 | 500 mL、万能組織固定剤(中性) |
| 外科用鉗子 | HUAYON | 18-1300 | 2.2 mm ストレート、幅 12.5 cm |
| 外科用ハサミ | HUAYON | 18-0110 | 10 cm、ステンレス製手術用ハサミ |
| シリンジ | 親切60017031 | 1 mL、針付き使い捨て滅菌シリンジ | |
| ティッシュカセット | CITOTEST | 80106-1100-16 | ホワイト; フロースルースロット; 0neピース一体型蓋; ラベリングエリアは3つの側面に配置されています |
| Tissue-Tek Prisma Plus | SAKURA | DRS-Prisma-P-JCS | 処理能力は一度に60枚のスライドです |
| Xylene | Guangdong Guanghua Sci-Tech | 1330-20-7 | 1000 mL, 有機溶剤 |
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