方法論記事

タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR 15N緩和実験

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DOI：

10.3791/67088

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2024年11月1日

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1Institute of Biological Information Processing (IBI-7), Forschungszentrum Jülich, 2Institute of Physical Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Heinrich Heine University Düsseldorf

この記事について

サマリー

核磁気共鳴(NMR)分光法は、構造タンパク質のダイナミクスを残留物特異的な方法で特徴付けることができます。私たちは、ピコ秒からナノ秒の時間スケールに敏感なNMR 15N R1 およびR2 緩和、および{1H}-15Nヘテロ核オーバーハウザー効果(hetNOE)実験を記録するための実践的なプロトコルを提供します。

要約

核磁気共鳴(NMR)分光法により、溶液中および生理学的温度下でタンパク質を研究できます。多くの場合、タンパク質骨格のアミド基または側鎖のメチル基のいずれかが、タンパク質の構造ダイナミクスのレポーターとして使用されます。 15N標識および完全プロトン化サンプル上の球状タンパク質のタンパク質骨格の構造動力学研究は、通常、分子量が最大50 kDaのタンパク質に対して良好に機能します。横方向緩和最適化分光法(TROSY)と組み合わせた側鎖重水素化を適用すると、球状タンパク質では最大200 kDaまで、側鎖に焦点が当てられている場合は最大1 MDaまでこの制限を延長できます。天然変性タンパク質(IDP)または天然変性領域(IDR)を持つタンパク質を調査する場合、これらの重量制限は適用されませんが、それをはるかに超える可能性があります。その理由は、内部の柔軟性が高いという特徴を持つ IDP または IDR は、頻繁に動的に分離されるためです。さまざまなNMR法により、ピコ秒から数時間までの幅広い時間スケールで構造タンパク質のダイナミクスを原子分解能で把握することができます。標準的な 15Nリラクゼーション測定は、タンパク質の内部柔軟性を概観し、ピコ秒からナノ秒の高速タイムスケールで経験するタンパク質骨格のダイナミクスを特徴付けます。この記事では、NMR 15N R1、R2、およびヘテロ核オーバーハウザー効果(hetNOE)実験をセットアップおよび記録するための実践的なプロトコルを紹介します。私たちは、より高度な分析の前に、例示的なデータを示し、それらを単純に定性的に解釈する方法を説明します。

概要

タンパク質の機能は、その三次元構造だけでなく、タンパク質が採用する異なるコンフォメーション間の内部柔軟性と構造遷移を含む構造ダイナミクスによっても決定されます。核磁気共鳴(NMR)分光法は、溶液1,2,3中のタンパク質の構造ダイナミクスを調べることができます。プロトン検出固体NMRの最近の開発により、例えば脂質二重膜4,5,6のような難溶性状態でのタンパク質ダイナミクスの特性評価も可能になりました。溶液NMRでは、タンパク質骨格とタンパク質側鎖の構造動態を調べることができます。球状タンパク質の場合、タンパク質が15N同位体標識されると、タンパク質骨格の構造ダイナミクス研究を最大50 kDaで達成できます。側鎖重水素化および横緩和最適化分光法(TROSY)を使用する場合、この制限は最大200 kDaまで拡張できます7,8。側鎖ダイナミクスに焦点が当てられると、アクセス可能なタンパク質と複合体の範囲を最大1 MDa 2,9まで拡張できます。

名前付きの重み制限は、高い内因性ダイナミクスを頻繁に示す天然変性タンパク質(IDP)には適用されません。真核生物のプロテオームの30%以上は、IDPまたは天然変性領域(IDR)10,11,12,13で構成されています。それらは、シグナル伝達や転写1などの多くの細胞プロセスで中心的な役割を果たし、細胞内相分離14,15,16,17に頻繁に関与しています。IDPは、生理学的条件下で明確に定義された3次元(3D)ネイティブ構造を欠いており、弱く漏斗状または起伏のあるエネルギーランドスケープを持っています17,18。IDPまたはIDRのバックボーンに分布する低い疎水性と強い静電反発力のために、剛性構造に折り畳むための駆動力が欠けています19。IDPは、他の結合パートナーと複合体を形成するときに、折り畳まれたコンフォメーションを頻繁に採用する10,20,21。また、翻訳後修飾(PTM)は、IDPまたはIDRのフォールディングの可能性を広げる22,23。IDPのミスフォールディングは、神経変性疾患15,24,25,26を含むさまざまな疾患の原因として特定されています。

IDPとIDRは高い内部柔軟性を示しています21,27,28。原子位置と二面角の変化を示すコンフォメーションアンサンブルは、分子動力学シミュレーションと実験データ29,30,31,32から得られた拘束から導き出された。凍結状態ではダイナミクスとそれに伴う乱れにより、拡散電子密度により、クライオ電子顕微鏡やX線結晶構造解析などの構造生物学の最先端の方法を使用してそれらを構造的に特徴付けることが困難になります。また、極低温での実験のための結晶化条件やサンプル調製技術は、IDPが経験するコンフォメーション空間に影響を与える可能性があります。しかし、溶液NMRは高ダイナミックなタンパク質にうまく機能するため、IDP16、20、22、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38の研究に適しています。

上記で紹介したように、溶液NMRは、主にスピン緩和31,33,38,39,40,41,42に基づいて、広範囲の時間スケールで内部タンパク質のダイナミクスを研究するためのさまざまな手法を提供します(図1)。

タンパク質骨格のアミド基における15N核のスピン緩和は、内部タンパク質のダイナミクスと集団運動(関連する場合は回転拡散を含む)による1 H-15N結合角の配向変化によって誘導されます27,43,44,45,46,47,48,49,50,51.回転相関時間τR(分子が1つの放射体を回転させる必要がある時間、全体のタンブリング相関時間とも呼ばれる)よりも短い時間スケールでは、化学シフト異方性(CSA)と双極子結合(D)はアクティブであり、タンパク質の回転拡散によって平均化されません。結合角の変動、結合の再配向、および回転タンブリングを含むタンパク質骨格の内部ダイナミクスは、CSAと双極子結合テンソルの確率的揺らぎを誘発し、局所磁場の変動をもたらし、最終的にNMRスピン緩和47,48,52,53をもたらす.これらの変動は、全体的な相関関数で表すことができます。全体の相関関数のフーリエ変換は、スペクトル密度関数と呼ばれます。半古典的レッドフィールド緩和理論では、NMR緩和速度定数は、これらのスペクトル密度関数の線形結合によって記述することができる54。

1990年代初頭に開発されたバックボーン15N NMR緩和実験は、15N R1、R1ρ、および{1H}-15N核オーバーハウザー効果実験を含み、タンパク質45,55,56,57の回転相関時間τRよりも速い高速ピコ秒(ps)ナノ秒(ns)の時間スケールに敏感です。回転相関時間τRよりも遅いバックボーンダイナミクスを特徴付けるために、いわゆる緩和分散実験、R1ρ、およびマイクロ秒(μs)-ミリ秒(ms)ダイナミクス44,46,58,59,60,61に敏感なCarr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)実験が使用されます。マイクロ秒より遅いダイナミクスは、15N化学交換飽和移動(CEST)NMR62、交換分光法(EXSY、ミリ秒から秒)、またはリアルタイム(RT)NMR(秒から時間)63,64によって捕捉することができる。常磁性プローブのPRE(常磁性緩和強化)効果、および残留双極子カップリング(RDC)を使用して、psからmsのダイナミクス65,66,67,68の全範囲を評価できます。

figure-introduction-1
図1:タンパク質骨格ダイナミクスの時間スケールと、さまざまなNMRダイナミクス実験の感度の高い時間枠。 NMRは、幅広い時間スケールでタンパク質骨格のダイナミクスを特徴付けるためのさまざまな方法を提供します。タンパク質骨格が経験するさまざまな動きが、それぞれの時間スケールで示されます。タンパク質の回転相関時間τRは、タンパク質が全体の回転(1ラジアント分)に必要な時間です。タンパク質の回転相関時間τRよりも速い運動は、タンパク質の内部の柔軟性と関連している可能性があります。さまざまなNMR実験とそれぞれの時間スケールに対する感度は、矢印の下に示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

以下のプロトコルは、Lakomek et al.69 およびStief et al.70による、感度向上型異種核単一量子コヒーレンス(HSQC)検出スキームを用いたNMR緩和実験のセットアップについて説明する。実験の実施に進む前に、NMRスピン緩和とNMR緩和実験の非常に簡単な概要を説明します。サイズの制限と、このプロトコルを理解できるようにするために、この概要は単純化する必要があります (したがって不完全です)。

T1時間またはR1 = 1 / T1レート定数によって特徴付けられる縦方向またはスピン格子緩和は、磁化がボルツマン平衡に戻ることを説明しています。平衡状態では、磁化は外部磁場の軸に沿って整列し、実験室フレームのz軸を定義します。高(1H)および小(15N)のLarmor周波数(NMR共振周波数、たとえば、14.1テスラ磁石の1Hで600 MHz)でのスペクトル密度と、これらのLarmor周波数の線形の組み合わせは、rad·s-1で測定された15N R1レート定数によって特徴付けられる15N R1緩和に寄与します.タイムスケール上の運動は、これらのラーマー周波数に反比例します。したがって、ピコ秒からナノ秒の時間スケールでの動きは、緩和速度定数R1に寄与します。全体的なタンブリングを示し、回転相関時間を定義できる分子の場合、R1 (T1) 曲線は ωτR = 1 の最大 (最小) を示し、回転相関 τR とスピンのラーマー周波数 ω を考慮します。複数のLarmor周波数が寄与する場合、周波数が最も低い周波数が支配的な周波数になります(たとえば、15N R1の場合はωN)。高速運動領域(ωτRは1よりはるかに小さい)は、非常に速く転倒する小分子に適用され、低磁場と低粘度に適用されます。スローモーション領域(ωτRは1よりはるかに大きい)は、ゆっくりと転がる大きな分子や、高磁場、高粘度に有効です。

球状折り畳まれたタンパク質は、溶液中で全体的にタンブリングを示し、回転相関時間を割り当てることができます。しかし、全体的なタンブリングの概念は、天然変性タンパク質にはもはや有効ではなく、単一の回転相関時間を割り当てることとは異なることがよくあります。ここでは、残基特異的な内部相関時間がより重要になります。

15N R1緩和率を測定する記載のパルスシーケンス(図2)は、直交検出69,70,71のためのエコー/アンチエコー検出を用いた感度向上HSQC読み出し実験に基づいています。可変強度および長さを有する短いグラジエントは、コヒーレンス選択および改善された水抑制70に使用される。その間、15Nの縦偏光は緩和されます。減衰時間が長くなると、この疑似 3D スペクトルの関連する 2D 平面の強度が低下します (遅延データ ポイントは 3 次元に記録されます)。以下で説明するループ要素は、緩和時間が長くなるほど実行回数が増えます。15Nの化学シフト異方性(CSA)と1Hおよび15Nの双極子結合(D)との間の相互相関緩和も緩和遅延中にアクティブであるため、アミドプロトンに選択的な中央のI-BURP-2 180°パルス72は、相互相関緩和による寄与を再焦点化する必要があります(これは、再焦点を合わせない場合、歪んだ誤った15NR1レート定数につながります)。

figure-introduction-2
図2:NMR緩和速度定数を決定するためのNMRパルスシーケンススキーム。 (A)15N R1ρ、(B)15N R1、および(C)hetNOE実験、感度向上HSQC読み出しスキーム69,70を使用。90°(x)パルスは幅の狭い長方形で視覚化され、180°(x)パルスは幅の広い長方形で視覚化されます(特に明記されていない限り)。次の位相サイクルが適用されます:φ6 = y、y、-y、-y;φ7 = y、-y、φrec = y、-y、y、y。直交検出は、グラジエントG5の極性とφ7の位相サイクルを反転させることで実現します(エコー/アンチエコー検出)。(A)15N R1ρ実験:黒い長方形はスピンロックを表し、持続時間は異なる緩和遅延を獲得するために変化します。スピンロックの前後の三角形は、有効磁場軸Beffに沿って磁化を整列させる断熱形状パルスを示しています。G10は、進化段階での水磁化の放射減衰を防ぐためのオプションの勾配です。(B)15N R1実験:括弧で囲まれた部分は、シーケンスのループ要素を示しており、所望の緩和遅延に一致するようにn回繰り返されます。(C)hetNOEパルス方式は、R1およびR1ρパルス方式の後半、すなわちt1 evolution timeおよびHSQC検出素子と類似しています。ただし、15Nの磁化はINEPTなしで直接励起されます。陽子磁化の飽和(1Hと15Nの間の交差緩和を達成するため)は、少なくとも5秒間印加された180(1H)パルスの列によって達成されます。同じ長さ(ここでは5秒)のパルス列のないアイドル遅延が参照実験に適用されます。G5は輻射減衰を防止するためのオプションのグラジエントであり、グラジエントG4の極性の反転は、位相φ7=y、-y、-y、yとの組み合わせにより、直交検出を実現します。製品オペレーターによって表される磁化転写ステップは、赤でマークされています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

緩和速度定数R2は、スピン間の位相コヒーレンスの喪失による横分極(外部磁場に直交するxy面内)の緩和を表し、検出可能な磁化53,54の減衰につながる。高周波数と低周波数でのスペクトル密度関数は、R1と同様にR2に寄与します。ただし、R2 に最も大きく寄与するのは、ゼロ周波数でのスペクトル密度です。このため、R2は回転タンブリングに非常に敏感であり、回転相関時間τRで表され、室温での小さな球状タンパク質の場合、数nsのオーダーです。したがって、数百psから低ns領域の遅いバックボーンの動きが最も寄与します。15N原子核の化学シフトテンソルの等方性部分の変調を引き起こすバックボーンの交換ダイナミクスは、原則として、R2速度定数43,44,49,60,61に交換寄与R2exを追加します。説明された実験では、R2exの寄与は、スピンロックの逆円周波数よりも遅いダイナミクスを再焦点化するスピンロックによって抑制されます。スピンロックは、磁化を有効磁場軸Beff(スピンロックω1フィールドと15Nキャリア周波数からの化学シフトオフセットのベクトル和（下記参照）)に沿って整列させる長波無線周波パルスです。B1,eff軸に沿って整列した磁化の緩和をR1ρ緩和と呼び、R1成分とR2成分があります。式(1)を使用すると、R2はR1ρとR144,73から計算できます。

figure-introduction-3 (1).

実効磁場Beffと外部磁場B0の軸との間の角度はfigure-introduction-4です。 ω1はスピンロックのRF振幅であり、対応する残基の15N化学シフトと15Nキャリア周波数44,73との間の化学シフトオフセットΩです。

R1ρ パルス方式(図2A、 70)は、緩和遅延を除いて 15NのR1 方式と非常によく似ています。 15N R1ρ 緩和率を測定するには、スピンロックと同じ無線周波数(RF)振幅の断熱パルスによって磁化が有効磁場軸Beff に沿って整列した後、スピンロックがアクティブになる必要があります。スピンロックの長さは、異なる緩和遅延を得るために変化します。

定常状態{1H}-15N核オーバーハウザー効果(1 H-15N NOE)は、以下でhetNOEと呼ばれ、交差緩和率と15Nの縦緩和率の比です。これは、陽子分極45,53,54,74,75の飽和時に陽子との交差緩和により、15Nの定常分極の減少につながります。交差緩和は、1H と 15N の Larmor 周波数の合計と差のスペクトル密度関数に依存します。したがって、hetNOEは、高速ピコ秒ダイナミクス(< 100ps)とps-nsダイナミクス(R1依存性による)の両方に敏感です。シーケンス69(図2C)は、直交検出用のエコー/アンチエコー勾配を使用した感度向上HSQC読み出しに基づいています。陽子磁化とその結果生じるhetNOEの飽和のために、平衡陽子磁化は反転され、続いて15N T1の約5倍の180°パルスを急速にパルスすることによって飽和します。参照実験では、回復遅延は飽和遅延と等しくなりますが、1H 180°パルス列はありません。参照実験と飽和時間が1Hの実験には、D1 = 2秒の遅延が追加されます。どちらの実験も連続して記録され、1H180°パルス(飽和)を適用するかどうか(参照)のみが異なります。実験で記録されたスペクトル強度と 1H 飽和の比を参照実験の強度 (180° 陽子パルス列なし) で割ると、{1H}-15N NOE (hetNOE) 値が得られます。

以下のプロトコルは、Lakomekら69およびStiefら70によるNMR緩和実験の設定を説明しています。私たちは、感度を向上させたHSQC検出スキームを用いたNMRパルス配列に焦点を当てています。15N R1およびR1ρ実験は、Stief et al.70によって詳細に記述されているように実施されており、hetNOE実験はLakomek et al.69によって記述されている。

プロトコル

1. NMRサンプル調製

注:タンパク質の同位体標識は、高次元NMRおよび高度なNMR実験のために行われます。 大腸菌 でのタンパク質発現およびタンパク質精製が、リッチ培地(Luria-Bertani [LB]や2x 酵母抽出物トリプトン培地[2YT]など)を用いて数ミリグラム/リットルの収量で確立されていた場合、同位体標識NMRサンプルの調製は通常比較的簡単です。

  1. 同位体標識には、 15N塩化アンモニウムが唯一の窒素源であり、 13Cが高濃度グルコースが唯一の炭素源である遺伝子発現にM9最小培地を使用します。
  2. タンパク質の精製には、それぞれのタンパク質について実験室で確立された標準プロトコルに従ってください。
    注:結果セクションは、IDP、単量体SNAREタンパク質Synaptobrevin-2(1-96)の代表的な結果を示しています。シナプトブレビン-2のNMR同位体標識は、70に記載されているように行われてきた。非常に高精度な測定を行うには、低濃度のD2O(5%未満)を使用することをお勧めします。これは重水素同位体効果によるもので、これはHahn-Echo 15N T2 および低周波 15N CPMG緩和分散実験(ここでは議論しない)で観察できるが、 15N R1ρ 実験(主に再焦点化される)では最小限の影響しか持たない76。

2. 分光器上でのNMR緩和実験の実施準備

注:記載されているNMR緩和実験は、ブルカー分光器に特有のものです。これらの製品は、極低温および室温の 1H、 15N、 13C 三重共鳴プローブ、および Bruker のソフトウェア Topsin 3.6 以降で操作する Avance III および Avance Neo コンソールでテストされています。

  1. 注意事項に従ってください。
    1. NMR分光計で働く前に、安全ブリーフィングを行ってください。
    2. 使用した分光器のプローブのパワー仕様を確認し、Topspinの「prosol」テーブルエントリとの一貫性を比較するなどして、各パルスに適切なパルス長とパルスパワーを選択します。
  2. パルスシーケンスをインポートします。
    1. NMRパルスプログラムは、以下に示すウェブサイトから、または拡張されたBiological Magnetic Resonance Bank(BMRB)リポジトリ(bmrbig102)から、NMR分光計を操作しているコンピューターのディレクトリ/opt/topspin4.1.4/exp/stan/nmr/lists/pp/userにダウンロードしてください。topspinのバージョンを調整してください(ここでは、topspin4.1.4を分光器にインストールされているそれぞれのバージョンに合わせます)。
    2. NMR形状パルスは、以下に示すウェブサイトから、または拡張されたBiological Magnetic Resonance Bank(BMRB)リポジトリ(bmrbig102)から、NMR分光計を操作するコンピューターのディレクトリ/opt/topspin4.1.4/exp/stan/nmr/lists/pp/userにダウンロードしてください。topspinのバージョンを調整してください(ここでは、topspin 4.1.4を分光計にインストールされているそれぞれのバージョンに合わせます)。
  3. 分光計とサンプルを校正します。
    1. 対象の温度を設定します。温度校正については、施設のプロトコルを適用してください。例えば、メタノール-d4サンプルを使用し、ウェブアプリケーションの NMR温度計 (https://chem.ch.huji.ac.il/nmr/software/thermometer.html)を使用して観察された化学シフト差を解釈します。77も参照してください。
    2. サンプル(およびロック用に5% D2Oを追加)を挿入し、サンプルの温度が平衡化するまで約10分間待ちます。重水素(2H)信号をロックします(コマンド: ロック、H2O + D2Oを選択)。
    3. 1H、15N、13Cチャネルを一致させ、調整します(例:atmaまたはatmmルーチンを使用)。 自動マッチングおよびチューニングユニットが取り付けられていない場合は、wobbコマンドを使用してプローブを手動でマッチングおよびチューニングします。
    4. 均質なB0 フィールドに対してシミングを実行します(例:topshimルーチンtgを使用)。
  4. 90°(1H)のパルス長を校正します。
    1. zg 実験を使用します。 getprosol を使用してプローブ パラメーターをインポートします。P1には5μsの短い持続時間を選択します。必要に応じて、PLW1のプローブの指定された電力レベルを確認して修正します。
    2. zgで実験を開始します。efp でデータを処理します。で位相を調整します。ベースラインが均一で、水共鳴のNMR信号が同相になるようにph。
    3. 360°(1H)パルスを推定するには、一般的なまたは約90°(1H)のパルス(たとえば、リストされた分光器の仕様から)を取り、それに4を掛けます。実験を実行し、処理します。
      注意: 信号が正の場合は選択した持続時間が長すぎ、負の場合は短すぎます。360°(1H)パルスがゼロクロッシングになります。
    4. それに応じてパルス長を調整します。これを繰り返して、ゼロクロッシングを見つけます。取得した値を4で割ります。これが 90° (1H) パルスになります。
      注:説明されている360°メソッドの代替は、コマンドラインから開始でき、自動1Hパルスキャリブレーションを可能にするパルサルルーチンです。
  5. キャリア周波数O1を水の共振に校正します。
    1. コマンドラインに 「edc 」と入力して、zg experiment を新しい実験番号にコピーします。 「rpar 」と入力して、パラメーター・セットを開きます (補足図 1A)。
    2. パラメータ・セット ZGPR を検索します。パラメータセット ZGPR (補足図1A)をクリックし、[ 読み取り]をクリックし、["getprosol"の実行]を選択して [OK ]をクリックします(補足図1B)。
    3. P1を校正済みの90°(1H)パルス長に変更します。飽和長を D1 = 2 秒、パルス電力を PLW9 に 50 dB に選択します。レシーバーゲイン(rg)を16に設定します。または、 rga と入力し、レシーバーゲインを指定された値に設定して、レシーバーゲイン調整を実行します(ただし、「レシーバーゲインオーバーフロー」は避けてください)。
    4. コマンドラインに gs と入力すると、連続的な集録が繰り返されます。集録ウィンドウに移動し、O1を変更して、水信号が支配するFID領域を減らします(補足図2)。
    5. マーカーの下をクリックしてO1を減らし、マーカーの上をクリックして増やします。感度ボタンを使用して、ステップサイズを変更します。現在のO1 を保存します 。「閉じる」は、繰り返しの収集を停止します(補足図2)。
  6. 90°(15N)のパルス長を校正します。
    1. zg experiment を新しい実験番号 ( edc と入力) にコピーします。 rpar と入力してパラメータセットを読み取り HSQCFPF3GPPHWG パルスプログラムを 1 H-15N HSQC実験に変更します。 「パラメータ P1、O1、および PLW1 を保持する 」オプションを使用します (補足図 1)。
    2. コマンドラインに getprosol 1H 1H) pulse length in μs> <90° (1H) pulse strength in db> と入力して、プローブパラメータをインポートします。スキャン数 (NS) を 8 に、ダミー スキャン数 (DS) を 2 に設定します。
      注: < > ここで設定する値を指定します。たとえば、getprosol 1H 8.5 -11.79 です。
    3. 実験の最初のインクリメントを実行するには、コマンド ラインに 「zg 」と入力します。最初の増分を rser 1 <新しい実験番号> の新しい実験番号にコピーします。 データを efp で処理し、 でスペクトルを位相化します 。ph.次の手順では、実験の最初の増分 (1D 実験) を使用します。
      注:< >は、新しい実験に選択された番号を指定します(例:rser 1 101)。
    4. コマンドラインにasedと入力して、1D実験のパルスシーケンスパラメータを開きます。PULPROG行のE(補足図3Aを参照)をクリックして、パルスプログラムエディターを開きます。
    5. 次のワークフローを使用して、パルス シーケンスを新しい名前で保存します: [ファイル ] (左上隅)、[ 名前を付けて保存] の順にクリックし、新しい名前を入力して [OK] をクリックします。次に、「 PULPROG を データ・セットに設定」をクリックし ( 補足図 3B を参照)、「 OK」をクリックします。
    6. 元の1 H-15N HSQCシーケンス(新しい名前で保存、2.6.4.を参照)を、t1進化期間後(バックトランスファー前)の90°(15N)に2を掛けて変更します(90°(15N)パルスは180°(15N)になります)。Ctrl Sを押して、パルスシーケンスを保存します。パルス長を90°(15N)(P21)に設定して、最初の増分のNMR信号が(ゼロクロッシングで)消えるようにします(補足図3B)。
    7. 1 H-15N HSQC実験(2D実験)を開き、校正済みの90°(15N)パルス長(P21)を入力します。コマンドラインで「getprosol 1H 1H) pulse length in μs> <90° (1H) pulse strength in db> 15N 15N) pulse length in μs> <90° (15N) pulse strength in db>と入力します。
  7. スペクトル幅と取得時間の割り当てを決定します。
    1. 1 H-15N HSQC実験の取り込みパラメータウィンドウ(コマンドラインにedaを入力)で、スペクトル幅(取り込みパラメータSW)と直接寸法と間接寸法の次元増分数(取り込みパラメータTD)を調整します。
      1. SWは、直接寸法(1H)で16 ppm、間接寸法(15N)で30 ppmを選択します。TD の場合は、直接 (1H) 次元で 2048、間接 (15N) 次元で 512 を選択します。
    2. 1 H-15N HSQC実験を取得します。
      1. 対象のすべての信号が検出され、スペクトルにエイリアシング アーティファクトが存在しないことを確認します。スペクトルの中心が 15N軸に沿ったタンパク質シグナル分布の中心に適合しない場合は、O3Pを変更します。
      2. スペクトルウィンドウが小さすぎる場合は 、SW を大きくします。 TD を上げると、FID分解能が高くなります(デカップリングの最大持続時間については、プローブの仕様を確認してください)。
        注:これは一般的なセットアップであり、NMR緩和実験のセットアップの出発点です。 1 H-15N HSQC実験は、全実験セットの開始時と終了時に記録し、さらに実験時間が長くなる場合は、サンプルの完全性を監視するために、その間に記録することをお勧めします。

3. NMR緩和実験の実施

注:NMR緩和パルスシーケンス(図2)は、https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences または拡張Biological Magnetic Resonance Bank(BMRB)リポジトリ(bmrbig102)で入手できます。

  1. を設定します。 15N・R1ρ 実験。
    1. HSQC の実験 ( edc と入力) を新しいディレクトリにコピーします。 ased と入力し、パルスシーケンスパラメータのパラメータラインPULPROGの3つのドットをクリックして、パルスプログラムを 15N R1ρ 実験に変更します(ased、 補足図3Aを参照)。パルスプログラムをダブルクリックし、[ Set PULPROG to dataset]( 補足図3Bを参照)をクリックし、[ OK]をクリックします。
      注: 一部のエラー メッセージが表示される場合があります。これらのメッセージを閉じます。
    2. コマンドラインに gpnam と入力して、パルスシーケンス(補足図4)で説明されているように、欠落しているすべての勾配形状(gpnam1-gpnam9)を挿入します。
    3. コマンドラインに vplist と入力します。3 つのドット (補足図 5A)、 ファイル (左上隅)、 および新規 (補足図 5B) をクリックします。
    4. 新しいダミーvplistの名前を入力し、[ OK]を押します。ダミーの vplist を作成します (5m、65m、25m、45m、15m、55m、35m、10m、vplist エントリごとに新しい行)。 Ctrl S を押してリストを保存し、vplist のウィンドウを閉じます (補足図 5C)。
    5. 新しく作成したvplistの名前をダブルクリックします(補足図5B)。
      注:これは、パルスシーケンスのコンパイルエラーを回避するために必要です。vplist の適切なエントリは、以下 (ポイント 3.1.29.) で決定されます。
    6. asedと入力して、パルスシーケンスパラメータを開きます(補足図6)。パルスシーケンスで指定されているすべての欠落しているグラジエント強度とグラジエントの長さを入力します(補足図6D)。
    7. ループカウンタ L3 (間接次元の複素点の数) に、取得パラメータウィンドウ (eda) の 15N TD エントリの 1/2 を入力します。ループカウンターL6に、緩和曲線のフィッティングに使用される記録された緩和データポイントの数を入力します。
      注: この番号 L6 は、vplist エントリの数 (ここでは 8) に対応します (補足図 6A)。
    8. 上記で指定したWebサイトからダウンロードした断熱TanhTan_half.nlパルスを 15NSP8パルスの形状として設定します。Webサイトから断熱TanhTan_2nd.nlパルスを 15N SP9パルスの形状として設定します(補足図6C)。
    9. P8エントリを断熱TanhTanパルスの長さに設定します-パルスの断熱性を保証するのに十分な長さです。ここでは、P8 = 3000 μs が選択されます (補足図 6C)。
    10. 15N デカップリング (CPDPRG 3) を garp デカップリング・スキームに設定します。PCPD3 200 μsのデカップリングの長さに使用します(補足図6C)。
    11. スキャン間回復遅延を少なくとも D1 = 2 秒以上に設定します。
      注: 適切な回復遅延の選択については、「ディスカッション」セクションを参照してください。
    12. 最終実験では、ダミースキャン(DS)を少なくとも64に設定します(セットアップ中は、時間上の理由からDS = 4で十分です)。開始点として、4 のスキャン数 (NS) を使用します。信号対雑音比(SNR)が低すぎる場合は、4の倍数を使用します(補足図6A)。
    13. O1をステップ2.5の校正済みキャリア周波数に設定します。O2Pを176ppmに設定し、 1 H-15N HSQC実験(補足図6A-C)のO3Pをコピーします。
    14. パルス長P7を、手順90で校正した15°(2.6N)パルス長に設定します。また、ステップ 2.6 の 90°(15N)パルスのパルス電力レベルを PLW3 と PLW7 にコピーします (補足図 6C)。
    15. パルス長P1とP19を、手順2.4で計算した90°(1H)のパルス長に設定します。(補足図6B)。
    16. 間接寸法 TD = l3 * 2 * l6 の増分数を設定します (eda またはコマンド ラインに td と入力します)。
      注意: ここで説明するすべてのパルスシーケンスパラメータは、パルスシーケンスに追加で注釈が付けられます。
    17. シェイプパルスSP5をI-BURP2形状(Iburp2.1000)にセットします。パルス長P15を2000μsに設定します。Topspin pulse sequence parameter window (ased) で I-BURP2 shape pulse の隣にある E をクリックして、シェイプツールディスプレイを開きます (補足図 6B)。
    18. 正しい長さで形状パルスをシミュレートするには、「NMRシミュレーションの開始」ボタンをクリックします。シミュレーションウィンドウで、成形パルス長[μs](=2000μs)と回転角[°](=180°)を確認します。 「NMR-SIMの開始」をクリックします(補足図7A)。
    19. 励起範囲を確認し、タンパク質の 1Hスペクトル分散をカバーする適切なI-BURP2パルス長を選択しますが、同時に水の励起は避けてください。P15 を、最適な IBURP-2 パルスがシミュレートされたシミュレーション ウィンドウの Shaped パルス長に設定します (補足図 7B)。
      注:I-BURP2がアミド領域全体を励起(95%の効果>)する場合は、適切な長さが選択されます。異なる長さの I-BURP2 パルスをシミュレートするには、励起プロファイル ウィンドウを閉じ、シミュレーション ウィンドウで成形パルス長を編集します。 Start NMR-SIMをクリックします。長さが短いパルスは、Hz単位での励起範囲が広くなります。
    20. I-BURP2パルスのキャリア周波数を変更し、励起範囲を左または右にシフトして、I-BURP2パルスが水の磁化に触れて乱れないように SPOFFS5 を設定します(補足図6B)。
    21. 整形パルスの適切なパワーレベルを決定するには、Bruker Shapeツールを開き、「 Start NMR Simulation 」ボタンをクリックして、I-BURP2パルス長を「Shaped pulse length [μs]」に設定します。ソフトな長方形の90°(1H)パルスの対応する長さは、シミュレーションウィンドウに対応する90°の方形パルス[μs]で表示されることに注意してください(補足図7A)。
    22. 「calcpowlev」と入力します。基準長としてマイクロ秒単位のハード90°(1H)パルス(P1)を使用し(補足図8B)、新しい長さとしてI-BURP2パルスに対応する90°(1H)ソフト長方形パルス(マイクロ秒)を使用します(補足図8A)。ハード90°(1H)パルスとソフト矩形パルスの間の電力差Δ(dB)を覚えておいてください(補足図8C)。ハード90°(1H)パルスのパルス強度(dB)をSPW5にコピーし、記憶された差Δ(dB)をdBで追加します(補足図6B)。
    23. スピンロックのパワーレベルを決定するには、スピンロックの対応する90°(15N)パルス長を計算します。式を使用します:90°(15N)パルス長(s = 0.25 )/(スピンロック電力(Hz))。
    24. calcpowlev を使用して、スピン ロックのパワーと 90° (15N) ハード パルス (P7) の間のパワー差 Δ (dB) を計算します。新規:スピンロックのパルス長90°(15N)(μs)(補足図8A)。参照:硬質90°(15N)パルス長(μs)(補足図8B)。90°(15N)のハードパルス(dB)のパワーレベルPLW7をスピンロックパワーレベルPLW8(補足図6C)にコピーし、計算されたパワー差Δ(dB)を加算します(補足図8C)。
    25. スピンロック PLW8 の電力レベルを電力レベル SPW8 と SPW9 にコピーします。(補足図6C)。
    26. 15N デカップリングの電力レベルを決定するには、calcpowlev を使用して、90° (15N) のデカップリング パルス (PCPD3) と 90° (15N) ハード パルス (P7) の電力の間の電力差 Δ を計算します。新規:PCPD3(μs)(200)(補足図8A)。参照:硬質90°(15N)パルス長(μs)(補足図8B)。90°(15N)のハードパルスの電力レベルPLW7(dB)をデカップリングレベルPLW31(補足図6C)にコピーし、Δ(dB)をdBで追加します(補足図8C)。
    27. 温度補償を使用するには、 #define TEMP_COMPENSATION を含めます(パルスシーケンスのセミコロンを削除します)。P18 を 15N R1ρ 実験で使用したスピンロックの最大持続時間に設定します。
      注:実験の最初の試行では、温度補正をオフにすることをお勧めします。
    28. 15N 13Cラベル付きサンプルの場合は、パルスプログラムにLABEL_CNを定義するために#を含めます(パルスシーケンスのセミコロンを削除します)。P4を78の式で計算されたパルス長に設定します。たとえば、600 MHz で 23.70 μs、1200 MHz で 11.85 μs に相当します。「calcpowlev」と入力して、P4 と (13C) ハード パルスの電力差を dB 単位で計算します。(13C)ハードパルス電力(dB)をPLW4にコピーし、Δ(dB)を加算します。PLW4 を PLW2 にコピーします (補足図 6B)。
    29. 適切なサンプリングのための緩和遅延を決定します。
      1. 最初の 8 つの FID (L6 = 8 の場合) を実行し、これらを処理します (rser <新しい実験番号>)。 遅延が最も長い実験のピーク強度が、遅延が最も短い実験(参照として)と比較して、少なくとも1/e(約37%)に減少するが、25%以上に減少するエントリをvplistで選択します。
      2. vplist の残りのエントリを調整して、遅延が最も長い FID と遅延が最も短い FID の間で強度が減少するサンプリングを均等にします。プローブの注と電源仕様をお読みください。
        注:ゆっくりと緩和する残留物が最初のFIDを支配します。vplist の残りのエントリを調整して、1 番目と 2 番目の FID の間で強度が減少するサンプリングが均等になるようにします。プローブの最大許容スピンロック電力と長さを超えないようにしてください(プローブのマニュアルとプローブの仕様を参照してください)。温度補償の場合は、P18 (最大スピンロック持続時間) にチェックを入れます。これは、P18 の全体的なスピンロック持続時間が適用され、緩和遅延と温度補償に分割されます。時間(緩和遅延)+時間(温度補償)= const = P18を保持します。2kHzのスピンロックの場合、2秒の回復遅延(D1)を使用して、65ミリ秒を超えるスピンロック時間を超えないようにします。その場合、最大スピンロック期間と最長緩和遅延との間の妥協点を、最大許容スピンロック期間を優先する必要があります。D1回復の遅延が長い場合は、より長いスピンロックパワーが適用される場合があります。重要なのは、プローブ内の経時的な電力蓄積です。スピン ロックの持続時間を長くする必要がある場合は、スピン ロックの長さを少しずつ増やし、ロック信号を監視します。経験則として、ロックディスプレイの上3分の1でロックレベルを調整します。パルス・シーケンスの実行中にロック・レベルが2乗以上減少すると、プローブに蓄積されるスピン・ロック電力が大きすぎます。
    30. コマンドラインにrgaと入力して、レシーバーゲインを決定します。良好な信号対雑音比を得るには、レシーバーゲイン(rg)値が128〜256であることを目指してください。これは、良好な水抑制を証明しています。
      注意: レシーバーゲインが128〜256に到達できない場合は、水信号が強すぎることを示しています。その場合、レシーバーのゲインに達するまで、勾配の電力と持続時間は緩やかに調整されます。ディスカッションのセクションも参照してください。
    31. 15N R1ρ 実験のテスト実行を開始するには、コマンド ラインに「zg」と入力します。すべての遅延(vplistで8つの遅延の場合、1〜8)で水信号が十分に抑制されていることを確認します。直交検出方式(エコー/アンチエコー)の2番目の増分であるインクリメント9もオンにします。
  2. 15N R1 実験を設定します。
    1. 15N R1ρ 実験をコピーし、パルス プログラムを 15N R1 実験に変更します。
    2. 「vclist」と入力し、vclistを生成し、70で説明されているダミーのvclistを入力します:0、24、6、20、4、16、8、12。vclist エントリごとに新しい行)。
    3. オープン アス。グラデーションの長さと強度を確認します。GPZ9を14%に変更します。
    4. パルス長、パルス形状、およびパルス強度を確認します( 正しい値は15N R1ρ 実験からコピーされているはずです)。
    5. 15N13C標識サンプルの場合は、パルスプログラムで #define LABEL_CN を使用します。
    6. 温度補償を使用する場合は、 #define TEMP_COMPENSATION を含めます。
    7. 最初の 8 つの FID (L6 = 8 の場合) を実行し、これらを処理します (rser <新しい実験番号>)。遅延が最も長い実験のピーク強度が、遅延が最も短い実験と比較して少なくとも 1/e (約 37%) に減少し、25% 以上になる vclist のエントリを選択します。vplist の残りのエントリを調整して、遅延が最も長い FID と遅延が最も短い FID の間で強度が減少するサンプリングを均等にします。
      注: vclist エントリに使用できるのは偶数のみです。
  3. {1H}-15N NOE 実験を設定します。
    1. 15N R1緩和実験をコピーし、パルスシーケンスを{1H}-15N NOEパルススキームに変更します。
    2. 飽和期間の長さをループカウンターL8で設定します。180°(1H)パルス間の間隔は22 ms79 (2 * 1 / JNH)です。最も正確な結果を得るには、タンパク質の 15N T1(15N)の約5倍の飽和期間を使用します。ここ:5秒。これは L8 = 230 に相当します。
      注: 「ディスカッション」セクションでは、飽和期間/回復遅延の選択に関する追加のアドバイスを提供します。
    3. パルス方式で説明されているように、勾配の長さと強度を変更します。sine.20グラデーション形状を使用します。
    4. 間接寸法の増分数を TD = l3 * 2 * 2 に等しく設定します
    5. 15N13C標識サンプルの場合、#define LABEL_CNと-DLABEL_CNをZGOPTNSとして使用します。
    6. コマンドラインに「zg」と入力して、パルススキームを実行します。

4. 記録されたNMR実験の処理と分析

注:スペクトルはBrukerシステムを使用して記録されています。処理は、Unix または Linux オペレーティング システムを使用して実行されます。スペクトル処理とデータ解析は、NMRPipe80 とpython3を用いて行いました。NMRPipeソフトウェアは https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/index.html からダウンロードできます。NMRPipeベースの処理スクリプトは、Webサイト(https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences)または拡張Biological Magnetic Resonance Bank(BMRB)リポジトリ(bmrbig102)からダウンロードできます。NMRPipeの使用を推奨します。NMRPipeが利用できない場合、または望ましくない場合は、CCPN81 またはSPARKY(SPARKY 3、またはその後継のNMRFAM-SPARKY82 またはPOKY83 )などの代替手段を使用できます。

  1. 処理と分析 15N・R1 実験。
    注: 次のコマンドは Unix ターミナルで実行されます。
    1. ダウンロードしたディレクトリ内のファイルをR1_processing実験用R1データを含むディレクトリ(作業ディレクトリ)にコピーします。
    2. ターミナルコマンドでファイルを実行可能にします > chmod u+x *.com
    3. > brukerを実行してNMRPipe変換ユーティリティを開き、fid.com ファイルを生成します。「パラメータの読み取り」をクリックします。3 つのディメンションがカウントされる場合は [ディメンション数] を 2 に変更し、再度 [パラメーターの読み取り] をクリックします。次に、[Clear Script]、[Update Script]、および [Save Script] をクリックします (補足図 9)。
      注:キャリア周波数が正しくない場合は、 2回目に[パラメータの読み取り ]をクリックした後で[中心位置]PPMを変更してください。
    4. > ./fid.com を実行します。
    5. vplist の vclist を ms エントリで変換します: 遅延 (ミリ秒 = 40 ミリ秒 * vclist のエントリ)。 > cp vclist vplist を使用して、vplist を編集します。
    6. > ./split.com を使用して、疑似 3D データを 8 つの 2D ファイルに分割します。
    7. nmrproc.com の tauValues (vplist の値を vplist の順に並べる) と idxExpmt の値 (tauValues の時間の順序) を編集します (補足図 10)。
    8. > ./nmrproc.com を使用して、8 つの 2D スペクトルすべての生データを処理します。
    9. > nmrDrawを使用してスペクトルを描画します。
      1. これらの手順では、参照スペクトル (vplist の最初のエントリ) を使用します。z 次元を 1 (左上隅) に変更して、そのスペクトルに切り替えます。 [係数 ]ボタンの横にある[+]と[-]を使用して、等高線レベルを調整します。 Drawボタンでスペクトルを再描画します。
      2. ノイズから来る信号はごくわずかで、関心のあるすべての信号を認識できるコンター・レベルを使用します(コンター・レベルはノイズ・レベルの端にあります)(補足図11)。
    10. スペクトル位相を補正し、垂直 1D 信号投影の場合は v 型、水平 1D 信号投影の場合は h を入力します。P0とP1で位相を調整し(補足図11)、位相差を覚えて、nmrproc.com ファイル(補足図10)で位相を修正します。
      注:スペクトルが15N次元で反転している場合は、行の-negを削除します:| nmrPipe -fn FT -neg \(補足図10)。
    11. nmrDrawを閉じて、>nmrproc.com で再度処理します。ピークピッキング(スペクトルが正しく位相化され、参照スペクトルがすべてのピークが存在する等高線レベルで表示された後)の場合、K(シフト+ k)と入力し、検出を押して保存をクリックします。(補足図11)。
    12. ピークリストを作業ディレクトリにコピーし、ass.com の-assNameをピークリストの名前に変更します(補足図12)。
      注:正しい形式のピークリストの例については、https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences
      拡張されたBiological Magnetic Resonance Bank(BMRB)リポジトリ(bmrbig102)にあります。
    13. > ./ass.com を実行してスペクトルを割り当てます。スクリプトがさまざまなピークに対して提案する割り当てを確認します。マウスの左ボタンを使用してピークを割り当て、マウスの右ボタンを使用してピークの割り当てを解除します。 [次へ ] ボタンを使用して次のアミノ酸に移動し、[ 前へ ] ボタンを使用して前のアミノ酸に移動します (補足図 13)。
      注:輪郭レベルは、右上隅の+と-で変更できます。 [Draw ] ボタンを使用して、新しい等高線レベルでスペクトルを再描画します (補足図 13)。
    14. 割り当てが完了したら、[保存] をクリックし、もう一度 [保存] をクリックします。その後、[Quit]、[Cancel]、および[Exit]をクリックします(補足図13)。
    15. python3 NoneDeleter.py を実行して>割り当てられたピークに関する情報のみを含む relax.tab を作成します。
    16. > ./relax.com を実行して、autofit.com スクリプトを生成します。
    17. > ./autoFit.com を実行してフーリエ補間を実行し、各アミノ酸の異なる遅延時間の擬似比を生成します (axt.tab と nlin.tab が生成されます)。
    18. > ./model.com を実行して、 nlin.tab のデータに基づいて modelExp.com スクリプトを生成します。
    19. > ./modelExp.com を実行して、非線形最小二乗最適化モデルを使用して各残基の進化曲線を適合させます。
    20. bash summary.tcl -in relax.tab > t1.tab >を実行します。潜在的なエラー メッセージを無視します: GDB Notice: 21 missing values in the table file can occur.
    21. t1.tab を新しく作成したディレクトリ R1R2 にコピーします。
  2. 15N R1ρ 実験を処理および分析します。
    1. ダウンロードしたディレクトリR1rho_processing内のファイルを、実験的なR1ρ データを含むディレクトリ(作業ディレクトリ)にコピーします。
    2. > chmod u+x *.com を実行します。
    3. > brukerを実行してNMRPipe変換ユーティリティを開き、fid.com ファイルを生成します。15N R1 スペクトルの処理も参照してください。
    4. > ./fid.com を実行します。
    5. > ./split.com を実行して、疑似 3D データを 8 つの 2D ファイルに分割します。
    6. > ./nmrproc.com を実行し ( tauValues [vplist values] と idxExpmt を事前に編集)、8 つの 2D スペクトルすべての生データを処理します (補足図 10)。
    7. nmrDraw>を実行してスペクトルを描画し、ピークを選択します。これらの手順では、参照スペクトル (vplist の最初のエントリ) を使用します。15N R1 の実験と同じ手順に従います。
    8. ピークリストを作業ディレクトリにコピーし、ass.com の-assNameをピークリストの名前に変更します(補足図12)。
    9. > ./ass.com を実行し、15N R1 実験と同じ手順に従います。
    10. python3 NoneDeleter.py>を実行して、割り当てられたピークに関する情報のみを含む relax.tab を作成します。
    11. > ./relax.com を実行
    12. > ./autoFit.com を実行
    13. > ./model.com を実行
    14. > ./modelExp.com を実行
    15. bash summary.tcl -in relax.tab > t1rho. tab >実行します。潜在的なエラー メッセージを無視する: GDB Notice: 21 missing values in the table file may occur.
    16. t1rho.tab ファイルに次のヘッダーをコピーします (値は fid.com ファイルから取得できます) (補足図 14)。
      備考 600MHz for T1rho
      備考 -yOBS = 60.818 (ここに fid.com で見つかった値を入れてください)
      備考 -yCAR = 119.06 (fid.com で求められた値をここに入れてください)
    17. > ./extract_PPM.com を実行して、キャリア周波数に対するピーク 15N 周波数のオフセットを含む fusionOffset.tab というテーブルを生成します (これは、R1 データと R1ρ データから R2 データを抽出するための角度 θ を計算するために必要になります)。
  3. リラクゼーションデータを要約します。
    1. t1rho.tab と fusionOffset.tab をディレクトリ R1R2 にコピーします。
    2. R1R2ディレクトリ内のスクリプトcrtR1p.tclをコピーし、分光器の周波数とスピンロック電力を調整して、bash crtR1p.tcl | sort -n > R1R2.tabを実行します。(補足図15)で囲まれています。 R1R2.tabには、適合されたR1ρレート定数、シータ角、R2レート定数、およびR1レート定数が含まれます。
  4. hetNOE実験を処理および分析します。
    1. ダウンロードしたディレクトリ内のファイルをNOE_processing実験NOEデータディレクトリ(作業ディレクトリ)にコピーします。
    2. > chmod u+x *.com を実行します。
    3. > brukerを実行してNMRPipe Conversion Utilityを開き、fid.com ファイルを生成します。「パラメータの読み取り」をクリックします。3 つのディメンションがカウントされた場合は [ディメンション数] を 2 に変更し、もう一度 [パラメーターの読み取り] を押します。次に、[スクリプトのクリア]、[スクリプトの更新]、および [スクリプトの保存] を押します。
    4. > ./fid.com を実行します。
    5. > ./split.com を実行 (2 つのエントリ (0, 1) を持つ vplist を事前に作成する必要があります)
    6. > ./ft2.com を実行
    7. nmrDraw >を実行してスペクトルを描画し、参照スペクトル (z 次元 = 1) のピークを選択します。ノイズを抽出して記憶します(T = shift + tを押します)。位相補正とピークピッキングは、15N R1 実験と同じ手順に従います。
    8. ピークリストを作業ディレクトリにコピーし、ass.com の-assNameをピークリストの名前に変更します(補足図12)
    9. > ./ass.com を実行してスペクトルを割り当てます。 15N R1 実験で詳述したのと同じ手順に従います。
    10. python3 NoneDeleter.py を実行して>relax.tab を作成します。
    11. > ./script.com を実行
    12. > ./autoFit.com を実行
    13. error_hetnoe.tcl のノイズを変更します。
    14. bash error_hetnoe.tcl |sort -n > hetNOE.tab >を実行します。

結果

以下は、水疱性SNAREタンパク質Synaptobrevin-2(1-96)、しばしばVAMP2(小胞関連タンパク質2)に記録されたいくつかの例示的なNMR緩和データを示す。NMRデータの記録には、150 mM NaCl、0.1 mM TCEP、および1 mM EDTAを含む50 mM MES(pH 6.0)緩衝液中の171 μM 15N Synaptobrevin-2 (1-96)サンプル(以下、Syb-2と呼びます)を使用しました。すべての実験データは、3 mm NMRサンプルチューブに充填された250 μLの容量を使用して、278.15 Kで記録されました。実験は、Bruker 5 mm QCI 1H、 15N、 13C、 31P 四重共鳴クライオプローブを搭載した Bruker 600 MHz AVANCE III HD 分光器で行いました。

図3は、NMR緩和実験から得られたNMR緩和曲線に適合した残留物特異的な15N、R1、およびR2緩和速度定数を示しています。y軸には、タンパク質配列に沿った個々の残基(x軸)に対して、それぞれの緩和速度定数がプロットされています。また、1 H-15N異種核NMR測定の飽和実験と非飽和(参照)実験の強度比から抽出した1 H-15N異種核NOE値(hetNOE)を示します。

異種核NOEデータと 15N R2 速度定数は、 15N R1 データよりも簡単に解釈できます。したがって、私たちはそれらから始めます。

異種核NOE:
異種核{1H}-15N NOEは、高速ピコ秒の時間スケール(交差緩和依存性のため<100 ps)の内部ダイナミクスに敏感ですが、ps-nsダイナミクス(R1 依存性による)にも敏感であり、折り畳まれたタンパク質に対して通常は0から1より少し小さい)の値を取ることができます。フィールドが高いほど、それらは体系的に高くなります(ただし、常に1より低くなります)。

それらはタンパク質の内部の柔軟性を説明しています。同じ電界強度のhetNOE値を比較すると、{1H}-15N NOEが小さいほど、それぞれの残基はより動的になります。IDPの場合、通常、残留物特異的な{1H}-15N NOEが小さく、たとえば600 MHzで0.5以下のオーダーが観察されます。ただし、IDP では負の {1H}-15N NOE も検出され、500 MHz では -2 まで低下します。モノマー Syb-2 の場合、{1H}-15N NOE は、N 末端の -0.5 から C 末端リンカ ドメインの 0.5 までの 600 MHz 範囲で測定されました。値はN末端からC末端に向かって徐々に増加し、柔軟性が徐々に低下し、剛性が増加することを示しています(図3C)。

15N R2 レート定数
15名NR2レート定数は、タンパク質の全体的なタンブリング、ペプチド面の動き、およびバックボーン二面角のねじれによってN-H結合ベクトルの配向を調節するps-nsダイナミクスに敏感です。{1H}-15N NOE値およびR1とは異なり、15N R2速度定数は、タンパク質の全体的な(回転)タンブリングに関連するJ(0)スペクトル密度によって支配されます。したがって、球状折り畳まれたタンパク質の場合、15N R2 速度定数は、タンパク質の全体的なタンブリングとサイズに応じてサイズがスケーリングされます。真の IDP の場合、グローバル回転相関時間を割り当てることはできません。それでも、ポリマーで予想されるように、鎖長に依存する遅い相関時間を84に適合させることができますが、残基固有の内部ダイナミクスは15N R2速度定数に大きな影響を与えます。同じタンパク質内では、15N R2の速度定数により、内部残基特異的移動度が異なる構造領域と非構造化領域を区別できます。観測された15N R2速度定数が小さいほど、それぞれの残渣の移動性が高くなります。15N R2の高いレート定数は、αヘリックスやβストランドなどの二次構造要素の特徴です。低いR2緩和率定数は、ループおよび天然変性領域の特徴です。モノマーSyb-2(1-96)の場合、その固有の無秩序な特性と一致する全体的な低い15N R2レート定数が観察されます。内部剛性は、N末端からC末端リンカードメインまで増加(移動度の低下)してから、フレキシブルC末端に引きずり出されます(図3B)。

15N R1 レート定数
R1緩和率は、ピコ秒(ps)とより高速なナノ秒(ns)のダイナミクスに敏感です。ただし、内部ダイナミクスの直接的な解釈は、以前のものよりも複雑です。T1 を回転相関 τR: T1min at τR, min = 1/ ω の関数としてプロットすると、フィールド T1 (R1) 最小 (最大) があります。τR < τR, minの高速タンブリング分子、例えば、低分子または小さな球状タンパク質の場合、R1レート定数が低いほど、タンパク質骨格ダイナミクスが増加していることを示します(R2と同じ)。より大きなタンパク質の場合、τR > τR, min の場合、それは逆であり、R1 緩和速度定数が高いほど、ダイナミクスの増加 (R2 とは逆) を表します。

figure-results-1
図3:NMR緩和データ。データは、上記のプロトコルとワークフローに従って記録および評価されました。(A)Syb2(1-96)のタンパク質骨格に沿った残基特異的な15N R1緩和速度定数。(B)式(1)を使用してR1ρとR1のデータから計算された15NR2緩和率定数。(C)Syb2のバックボーンに沿ったhetNOE転送速度(1-96)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:NMRパラメータの読み込み。 macro rpar のインターフェースが表示されます。(A) すべてのパラメータセットの概要。赤いボックスは検索バーを示しています。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。ダブルクリックしてパラメータセットを選択します。(B)現在の実験にインポートできるパラメータの概要。 getprosol を実行するオプション、または現在の実験の特定のパラメーターを保持するオプションは、赤いボックスでマークされています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:最適な水抑制のための 1Hキャリア周波数の配置。 マクロ gs のインターフェースが表示されます。実験がループされている間、実験のさまざまなパラメーターを変更することができます。ここでマーカーを使用して、取得中に選択したパラメータを変更できます。マーカーの上をクリックすると、「感度」で指定した値だけパラメータが上昇します。感度スイッチを使用して、マーカーのステップサイズを調整できます。右側には、ライブFIDが表示されています。O1のキャリブレーションでは、FIDは通常、水信号によって支配されるため、赤いボックスでマークされたFID領域を最小限に抑えることを目的としています。FID面積の減少は、水信号の減少と水抑制の改善と密接に関連しています。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:1 H-15N HSQCパルスシーケンスとその取得パラメータの詳細。(A)H-15N HSQC実験HSQCFPF3GPPHWGのパルスシーケンスパラメータ。「E」をクリックすると、B. (B) 1 H-15N HSQC実験HSQCFPF3GPPHWGのパルスプログラムエディタでパルスプログラムエディタウィンドウが開きます。15N 90°パルスのコメント行(91行目)は、1 H-15N HSQC実験の元の線を示しています。92行目では、15N 90°のパルスが15N 180°のパルスに変更されています。この変更により、1 H-15N HSQC実験は、90°15Nハードパルスキャリブレーションのキャリブレーションパルスプログラムになります。パルスシーケンスを編集するには、まずシーケンスを新しい名前で保存します。次のワークフローを使用します: [ファイル]、[名前を付けて保存] の順にクリックし、新しい名前を入力して [OK] をクリックし、[データセットに PULPROG を設定] をクリックします。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4:グラデーションの設定。 グラデーションの形状、長さ、強度を変更する ためのgpnam マクロのインターフェースが示されています。使用するパルスシーケンスパラメータインターフェースを開くには、すべてのグラジエント形状GPNAMを入力する必要があります。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図5:緩和遅延の設定。 vplist マクロのインターフェース (vclist マクロと同一)。(A) vplist を選択するためのインターフェース。3つのドットをクリックすると、インターフェースBが開きます。(B)DoubleClickでvplistを選択するか、ファイルをクリックして新しいリストを作成するためのインターフェース、および新規。(C) インターフェースは、新しいリストを作成するか、既存のリストを編集すると開きます。リストは、[ファイル] と [保存] をクリックして保存できます。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図6:15N R1ρ実験のパルスシーケンスパラメータ。(A-D)プロトコルで変更する必要があるすべての重要なパラメータは、赤いボックスと関連する手順でマークされています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図7: shapetool マクロのインターフェース。 I-BURP2(実験で使用)を形状パルスとして開きます。(A)選択した形状パルスのパラメータ。赤いボックスでマークされた 「NMRシミュレーションの開始 」ボタンをクリックすると、シミュレーションパラメータの「Shaped pulse length [μs] (= 2000 μs)」と「Rotation angle [°] (= 180°)」のシミュレーションパラメータウィンドウが開きます。 Start NMR-SIM ボタンをクリックすると、(B)シミュレーションウィンドウが開き、I-BURP2パルスの反転帯域幅が表示されます。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図8: calcpowlev マクロのインターフェース。 (A) 電力を計算するパルスのパルス長の入力ウィンドウ。(B)基準パルスの入力ウィンドウ(主に90°のハードパルス)。(C) 結果ウィンドウには、新しいパルス長のパルスと基準パルス長のパルスとの間のパルス強度差が dB 単位で表示されます。重要:この違いは、両方のパルス長が形状と回転角度に関して同一のパルスに対応している場合にのみ有効です。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図9:NMRスペクトル処理:NMRPipe変換ツールのインターフェース。 Read Parametersをクリックすると、実験のパラメータが自動的に読み取られます。変換スクリプトを右側に示します。すべてのパラメータは個別に設定できます。Clear Scriptを使用してパラメータを変更した後は、スクリプトの更新を推奨します。「スクリプトの保存」をクリックして、右側に示すように、スクリプトを fid.com の下に保存します。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図10:スペクトル処理用の nmrproc.com ファイル。 nmrproc.com ファイルで生データをNMRPipe形式で処理するために使用されたコードが示されています。tauValues エントリと idxExpmt エントリは、処理する前に設定する必要があります。tauValues は、 15N R1ρ 実験の vplist エントリ (ミリ秒単位) に対応します ( vclist エントリは 15N R1 実験のミリ秒単位で再計算されます)。緩和遅延の長さに関しては、idxExpmt エントリは vplist エントリ (15N R1 実験の vclist エントリ) の順序に対応します。スクリプトでは、スペクトルの位相を変更する位置は赤いボックスでマークされています。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図11:NMRスペクトルの表示とピークピッキング。 オープンスペクトルを用いたnmrDrawの概要を示します。 「+ 」と 「- 」を使用して「係数」を変更し、これはコンターレベルの変更と密接に関連しています。 Z 次元を変更すると、異なる緩和遅延を持つHSQC実験を切り替えることができます。 Draw を使用して、変更されたパラメータでスペクトルを再描画します。P0スライダーとP1スライダーでは、スペクトルの位相を変更できます。これらのフェーズ変更は、処理されたデータには保存されません。相変化は nmrproc.com ファイルに手動で入力し、nmrproc.com ファイルを再度実行する必要があります。 ピーク検出 マクロでは、コンター レベル セットでスペクトル ピークをピッキングできます。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図12:NMRDrawによる半自動NMRピークアサイン。 ass.com ファイルのコードが表示され、NMR信号の割り当てを開始するには、このファイルを実行する必要があります。-assName を、生成された対象物のピークリストに変更します。このピークリストは、peaklistフォルダ(https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences でダウンロードしたzipフォルダ内)に添付されているピークリストass.syb2.hn_1200.tabと同じ形式である必要があります。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図13:NMRのピークとアサイン検査。 代入マクロのインターフェースは、ass.com を実行することで開きます。マウスの左ボタンでピークを割り当て、マウスの右ボタンでピークの割り当てを解除します。次のアミノ酸に移動するには Next を、前のアミノ酸に移動するには Prev を使用します。 + と - を使用すると、スペクトルを再描画する Draw を使用して等高線レベルを変更できます。ワークフローの使用: [終了]、[ 保存]、および [終了 ] は、課題を保存し、プログラムを終了します。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図14:R1ρおよびR1データから15N R2レート定数を抽出します。ステップ1.t1rho.tab ファイルの内容が表示されます。R1ρ レートから R2 レートを計算する前に、赤いボックスでマークされたコードを追加する必要があります。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図15:R1ρおよびR1データから15N R2レート定数を抽出します。ステップ2.crtR1p.tcl ファイルの内容が表示されます。実行する前に、赤いボックス内のエントリをプロトコルで説明されているように変更する必要があります。赤い数字は、プロトコルのそれぞれのステップを示しています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは、Lakomekら69およびStiefら70によるNMR 15N緩和実験のセットアップについて説明しました。私たちは、感度を高めたHSQC検出スキームを用いたNMRパルス配列に着目しました。15N R1およびR1ρ実験は、Stief et al.70によって詳細に記述されているように実施されており、hetNOE実験はLakomek et al.69によって記述されている。

NMR緩和実験を設定する際には、最大緩和期間が長すぎたり、スピンロックのRF振幅が高すぎたりするとプローブが損傷する可能性があるため、 15N R1ρ が最も重要です。緩和期間では、100%の強度から25%の強度(参照実験と比較して)の完全な減衰曲線を均等にサンプリングすることが望ましいです。IDPのように、 15N Tが2 倍長いゆっくりとリラックスするタンパク質の場合、プローブへのパワー蓄積を制限する必要があるため、崩壊曲線を完全にサンプリングすることは手が届かないことがよくあります。

15Nの無線周波数(RF)振幅の場合、理論的には、RF振幅νスピンロックが大きいほど、より多くの交換プロセスを再焦点化できるため、より良い結果が得られます。経験則として、1 / (2π νスピンロック) より遅い交換プロセスは、再焦点を合わせることができます。ただし、RF 電力の制限が適用されます。たとえば、私たちの手では、安全側にとどまるために2kHzのRF振幅が適用された場合、最大スピンロック期間の65ミリ秒を超えません。同時に、600 MHzの分光器でのスピンロックRF振幅は1 kHz(たとえば、600 MHzで1.4 kHz)よりも高くなければなりません。これは、小さな球状タンパク質gb369に対して十分であることが証明されています。スペクトル幅をカバーし、より高い電界強度でのオフ共振効果を回避するには、対応するRF振幅を磁界に合わせてスケーリングする必要があります(たとえば、900MHzで1.5倍(νスピンロックfigure-discussion-12kHz)。ただし、プローブの制限内にとどまる必要があります。(分光器の電力制限に関するローカルリストを参照し、NMR施設マネージャーにアドバイスを求めてください。 

参照実験(短絡遅延)と最長遅延期間(上記の要因によって決定)との間の緩和遅延の間隔の選択については、緩和遅延データポイントの間隔を等しくし、8の数を選択します(割り当てられた測定時間と信号対雑音比が許される場合)。最初のインクリメント(およびその後のインクリメント)は、最も強い(そしてしばしば最も遅いリラックスする)残留物によって支配されます。したがって、タンパク質のダイナミックレンジによっては、タンパク質配列中のいくつかの残基のNMRシグナルは、選択された最大緩和期間後にすでに崩壊している可能性があります。遅延ポイントを等間隔にすることで、高速緩和残基の緩和曲線も、緩和曲線をサンプリングする十分な数のデータ ポイントによってカバーされます。

また、正確な緩和データを取得し、プローブへの長期的な損傷を避けるためには、回復遅延の適切な選択が不可欠です。プローブの損傷を防ぐために、少なくともD1 = 2秒の回復遅延を選択します。正確な結果を得るためには、タンパク質 1Hおよび 15Nの縦分極も、平衡状態または少なくとも安定した定常状態に戻るのに十分な時間を与える必要があります。 1H T1 は通常、600 MHzで1秒から4秒の間で変化し、中小規模のタンパク質(最大20 kDa)です。より大きなタンパク質や高磁場では、 1H T1 はさらに増加します。小さな球状タンパク質gb3については、 15N R1 およびR1ρ の実験にD1 = 3.5秒で十分であることがわかりました。このプロトコルで提示された小さなIDP Syb-2については、最近、D1 = 2 sが適切な70であることを示しました。

15N hetNOEは、励起が15Nで開始され、パルスシーケンスの先頭に1 H-15N INEPTが適用されないため、感度が最も低くなります。さらに、正確なデータを得るためには、1H飽和期間と15N回復遅延を15NT1の5倍にする必要があります。ここで紹介するIDP Syb-2では、5秒の飽和/回復遅延と追加の2秒のD1回復遅延(合計7秒)で十分でしたが、より大きなタンパク質および/または重水素化タンパク質の場合、この時間は大幅に長くなる可能性があります(例:10秒以上)。ただし、定性的データが十分に優れている場合は、わずかな系統的オフセットを受け入れることができます。その場合、飽和度の95%が達成されるため、15NT1の3倍ですでに合理的な結果を得ることができます。その場合、結果の hetNOE 値は、より高い値へのシステマティック オフセットを示します。

このプロトコルでは、最もコスト効率の高い完全プロトン化 15N Syb-2を使用しました。側鎖重水素化は、リラクゼーション経路の数を減らし、最も単離された 1 H-15N骨格アミドスピンペアと連携するために推奨されます。しかし、 15N2H Syb-2と 15N syb-2を比較すると、重水素化サンプルと完全プロトン化サンプルとの間にはわずかな違いしか見られない70。実用的な目的のために、NMR緩和データは、二重または三重標識サンプル(15N13Cまたは 2H15N13C)に頻繁に記録されます。今回取り上げたNMRパルスシーケンスは、 13Cと 1Hまたは 15N核との間のJ結合進化を再集束させることができます。明らかに、 13C標識が導入されると、リラクゼーション経路も増加します。しかし、私たちの手元では、実用的な目的では、導入された誤差は、たとえあったとしても5%未満であり、定性的なデータのみが必要な場合には許容できる可能性があります。

検出のために異なるサイズのタンパク質を扱う場合、感度を高めたHSQC検出実験70 とTROSY検出実験69のどちらを選択するかという問題がしばしば生じる。低分子タンパク質の場合、感度を高めたHSQC検出NMR実験により、S/N比が2倍向上します(良好な水抑制が得られる場合)。より大きなタンパク質の場合、TROSYで検出された実験が優先されます。損益分岐点は、折り畳まれたタンパク質で約20kDaです。鎖長の増加に伴ってほぼ直線的に増加する低いR2 レート定数が得られるIDPの場合、損益分岐点はより高い分子量にシフトできます。実用的な目的では、疑わしい場合は、感度を高めたHSQC検出実験またはTROSY検出実験の両方を実施することをお勧めします。次に、最初の増分で最高の信号対雑音比を提供するものを選択します。

感度を高めたHSQC検出実験とTROSY検出実験のどちらを選択するかという議論は、S/N比が主な基準である場合にのみ当てはまります。最小の線幅と最高の解像度が必要な場合、TROSYは常に勝ちます。また、TROSYは、プロトンパルスが少なく、プロトンデカップリングが不要なため、常に最高の水抑制を提供します。より広範な議論については、以前に公開された記事69 を参照してください。

水抑制の問題について、もう一つお話しします。Bruker Avance NEOコンソールではレシーバー・ゲイン(rg)を16に設定するだけで十分な場合がありますが、(古い)Bruker Avanceコンソールでは通常、レシーバー・ゲインを128〜256の範囲にすることが望ましいです。達成可能なrg(ブルカーコマンド rgaによって決定される)は、残留水信号の強度から騒音レベルまで頻繁に得られます。水の抑制が悪いと、常にスペクトルに追加のノイズが発生します。したがって、Bruker Avance NEOコンソールでrg = 16を達成できたとしても、残りの水信号はノイズレベルに大きく寄与する可能性があります。したがって、信号対雑音比は減少します。したがって、rg レベルを 128-256 にすることをお勧めします。提示されたパルスシーケンス70 は、600MHzおよび1200MHzでテストされている。どちらの電界強度も、パルスシーケンスに記述されている同じグラジエント設定で機能します。少なくとも、さらなる最適化のための良い出発点として、これらをお勧めします。

冒頭で述べたように、議論されたNMR緩和実験は、ピコ秒からナノ秒の時間範囲のみをカバーしています。マイクロ秒からミリ秒のダイナミクスに関する洞察を得るために、緩和分散実験、CPMG実験、およびスピンロック振幅(またはキャリア周波数)を変化させるR1ρ実験の拡張が使用されています44,46,58,59,60,61,85,86。マイクロ秒より遅いダイナミクスは、15N CEST(化学交換飽和移動)NMR62、交換分光法(EXSY、ミリ秒から秒)、またはRT(リアルタイム)NMR(秒から時間)63,64を捕捉することができる。常磁性プローブのPRE(常磁性緩和強化)効果、および残留双極子カップリング(RDC)を使用して、psからmsのダイナミクス65,66,67,68の全範囲を評価できます。

これらの実験はすべて、バックボーンのダイナミクスのみをカバーしています。側鎖ダイナミクスを調べるために、Kay氏らは、1 MDa 2,87までのタンパク質の側鎖ダイナミクスに関する情報を提供する、別の多数のNMR実験を導入しました。

タンパク質骨格ダイナミクスについてより定量的な洞察を得るためには、15N R1、R2、hetNOEの3つのNMRパラメータすべてを組み合わせた解析が必要であり、時には相互相関した緩和速度定数など、さらに追加のパラメータが含まれることもあります。さまざまな洗練された分析方法が開発されています。いわゆるモデルフリーアプローチは、生体分子NMR43,88,89,90,91に広く適用されています。また、スペクトル密度マッピングは貴重な洞察を提供することができます55,92,93。これらは、回転相関時間が明確に定義された球状タンパク質の強力な解析方法ですが、IDPへの適用性は限られています。回転相関時間39を定義するためには、折り返し領域が必要である。これは、相関関数C(t)を指数関数的に減衰する関数の合計でモデル化できる場合、関連するさまざまな時間スケールが十分に分離できる場合、部分的に回避できます23,31,84。明確に定義された回転相関時間がない場合、相関時間の分布を含む代替アプローチ、例えば、IMPACT解析94またはDETECTOR解析95,96が代替である。さらに、NMR緩和データとMDシミュレーションの複合解析もIDPs97にとって有望です。現在、より大きなIDP31,98の全原子シミュレーションでは、サンプリングと力場の制限にまだ直面しています。

開示事項

著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる可能性のある既知の競合する金銭的利益や個人的な関係がないことを宣言します。

謝辞

有益な議論をしてくれたMelinda Jaspert氏とKevin Bochinsky氏に感謝します。N.L.は、ハイゼンベルクプログラム(DFG助成金番号433700474)を通じて資金提供してくれたドイツ科学財団に感謝します。この研究は、ヘルムホルツ協会のイニシアチブとネットワーキング基金からの助成金であるプロジェクト「COVID-19病因のウイルス学的および免疫学的決定要因-将来のパンデミックに備えるための教訓」(KA1-Co-02「COVIPA」)によってさらにサポートされています。私たちは、ユーリッヒ国立大学とデュッセルドルフ・ハインリッヒ・ハイネ大学(HHU)が共同で運営するユーリッヒ・デュッセルドルフ生体分子NMRセンターへの寛大なアクセスを認めます。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Bruker 600 MHz AVANCE III HD 分光計 Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.htmlNMR実験を実施 

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