このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

げっ歯類の心臓組織からの堅牢なミトコンドリア単離

1.9K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/67093

⸱

2024年8月23日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Michigan State University, 2Department of Kinesiology, Michigan State University

この記事について

サマリー

ミトコンドリアの生体エネルギーおよびメタボローム研究により、多くの疾患におけるミトコンドリアの多面的な役割が明らかになっていますが、これらのオルガネラの単離方法はさまざまです。ここで詳述する方法は、複数の組織源から高品質のミトコンドリアを精製することができます。品質は、高解像度呼吸測定で評価される呼吸制御比やその他の指標によって決定されます。

要約

ミトコンドリアの単離は、分子生物学と生化学の分野のパイオニアが代謝障害や疾患を研究するために確立した手順に従って、何十年にもわたって行われてきました。ミトコンドリアの生理学と生体エネルギー学を適切に調査するには、一貫したミトコンドリアの品質が必要です。しかし、研究者は多くの異なる分離方法が公開されています。実験戦略が異なれば必要な単離方法も異なりますが、基本的な原理と手順は似ています。このプロトコールは、小動物や細胞を含む様々な組織源からよく結合したミトコンドリアを抽出することができる方法を詳述しています。概説されているステップには、臓器解剖、ミトコンドリア精製、タンパク質定量、およびさまざまな品質管理チェックが含まれます。高品質のミトコンドリアを特定するために使用される主要な品質管理指標は、呼吸制御比(RCR)です。RCRは、酸化的リン酸化中の呼吸数とADPがない場合の呼吸数との比です。代替メトリックについて説明します。このプロトコルでは、組織源に対する高いRCR値が得られますが、研究者の個々のニーズに合わせていくつかのステップを最適化することができます。この手順は堅牢であり、動物モデルと組織供給源全体で平均以上のRCR値を持つミトコンドリアを一貫して分離しました。

概要

ミトコンドリアは、特定の細胞機能に最適化された細胞質エネルギー条件を確立する細胞内小器官です。細胞、組織、生物レベルの研究は、ミトコンドリアの機能に関する洞察を提供することができますが、オルガネラを単離することで、他の方法では不可能なレベルの実験的制御が可能になります。ミトコンドリアの単離は1940年代から行われており、さまざまな細胞や組織にわたる代謝と呼吸の機構的研究を可能にしています1,2。ミトコンドリアの歴史的関連性も十分に文書化されています3。ATPの主な産生者として、ミトコンドリアは細胞および臓器の最適な機能に不可欠な多くの重要な役割を果たしています4。ミトコンドリアマトリックス内では、基質はTCAサイクルによって酸化され、還元当量やNADHやUQHなどの可動電子キャリアが生成されます2 5,6。シトクロムCは、ミトコンドリアの生化学反応ネットワーク7における3番目の主要な移動電子キャリアである。これらの分子は、ミトコンドリア内膜8に埋め込まれた電子伝達系(ETS)の膜貫通複合体によって酸化される。ETSの酸化還元反応は、マトリックスから膜間空間へのプロトン転座と結合しています。これらのプロセスは、F1F0 ATP合成酵素によってPiでADPをリン酸化してATP 9,10を生成するために使用される電気化学的プロトン勾配を確立します。各複合体で発生する個々のプロセスは、クラーク型電極またはマイクロプレート酸素消費アッセイ11,12を使用した高分解能呼吸測定で探索することができる。さらに、単離されたミトコンドリアを用いた疾患モデルと治療法は、特定の病状の進行におけるミトコンドリア機能の影響または重要性を判断できます。これは心臓病学の分野で実り多いことが証明されており、ミトコンドリアの機能不全が心不全にどのように影響するかを解明するために、燃料と基質の送達の変化が使用されてきました13,14,15,16。ミトコンドリアは、糖尿病、癌、肥満、神経障害、およびミオパチーなどの他の病状の発症にも影響を与えることが知られている17,18。したがって、単離または精製されたミトコンドリアを使用すると、ソース組織における酸化代謝とATP産生のメカニズム調査が可能になります。

ミトコンドリアの単離プロトコルは、生体エネルギー研究におけるその重要性から、不足はありません。さらに、組織および細胞内のミトコンドリアの亜集団に合わせた非常に特異的な方法が見出される19,20。基本的な手順手順は単離法間で似ていますが、ミトコンドリアの量と品質を改善するために、組成、均質化ステップ、および遠心分離スピンを緩衝するバリエーションを作ることができます。これらの側面の変化は、組織の代謝要求、全体的な臓器機能、ミトコンドリア密度、およびその他の要因に基づいています。肝臓や骨格筋などの組織では、ミトコンドリアの完全性を維持し、ミトコンドリア膜21の損傷を制限するために、ハンドヘルドホモジナイザーが使用される。しかし、腎臓から単離する場合、一部のプロトコルでは、手動駆動の均質化または市販のキットを使用してより良い結果を得ることを提案しています22。どちらの方法でも機能的なミトコンドリアが得られますが、これらのプロトコルを使用して分離を完了するのにかかる時間が増えると、細胞小器官の品質が損なわれる可能性があります。遠心分離は、核や他のオルガネラなどの細胞成分をミトコンドリアから分離するため、ミトコンドリアタンパク質の抽出にも不可欠です23。単離プロセス中に、より純粋な分離物を得るために、差分遠心または密度ベースの遠心分離を実施すべきかどうかが議論される24。密度遠心分離では、ペルオキシソームなどの比重が類似したオルガネラからミトコンドリアを分離できますが、これらの方法によるミトコンドリアが、分画遠心分離を使用して単離されたミトコンドリアと比較して、in situオルガネラの機能をよりよく表しているかどうかは十分に確立されていません。ミトコンドリア生理学の分野では、密度ベースの遠心分離が好まれており、単離品の純度を高めるために簡単に変更することができます。gフォース、遠心分離時間、および遠心分離スピン数の変化を組み込むかどうかは、ミトコンドリアの精製に影響を与えるため、実験前に考慮する必要があります。さらに、ミトコンドリアの再懸濁は、おそらく単離中の最も重要なステップであるが、スクレイピング、ボルテックスベースの混合、または均質化の使用により、研究間で大きく異なる23,25,26。これらのタイプの機械的再懸濁は、研磨性が高すぎて、ミトコンドリアの膜の完全性を損なう可能性があります。このため、これを修正するために穏やかな洗浄を行う必要があります。多くのモジュレーションと推奨される方法論にもかかわらず、げっ歯類モデルに対する高い再現性と適応性を備えた包括的なプロトコルは少ないです。

本明細書に記載の方法は、小動物の心臓組織から精製された、よく結合したミトコンドリアをもたらす、詳細で堅牢で再現性の高いプロトコルの概要を示しています。実証されたように、この方法は、腎臓、肝臓、および培養細胞からミトコンドリアを単離するための各実験および/または実験室環境の特定のニーズに合わせて容易に適合させることができます。ここに記載されていない組織や他の動物からミトコンドリアを単離するために、さらなる改変を加えることができる。すべての分離に使用されるバッファーレシピが提供されており、必要に応じて変更できます。他の公開プロトコルと同様に、電動均質化と示差遠心分離が実装されています。ただし、分離源に応じて、高品質のミトコンドリア分離物を一貫して送達するために、サンプルを遠心分離するせん断時間と力の両方に調整が加えられます。特に、このプロトコルは他のプロトコルとは異なり、ペレット化されたミトコンドリアを再懸濁するためにピペッティング による 穏やかな洗浄を使用し、ミトコンドリア膜の完全性を維持し、オルガネラの全体的な機能を維持するのに役立ちます。ミトコンドリアタンパク質は、全タンパク質測定またはクエン酸合成酵素活性の測定によって定量されます。この単離法の有用性と幅広い適用性は、さまざまな生物や組織源で達成される呼吸制御比(RCR)の値によってさらに裏付けられています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

すべての脊椎動物の使用と治療は、ミシガン州立大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって審査され、承認されたプロトコルに従って行われました。このプロトコルは、雄と雌の両方のハートレーアルビノモルモットとスプレイグドーリー(SD)ラットを使用して設計されました。モルモットからの心臓ミトコンドリアの単離のために、動物を4〜6週齢(300〜450g)で犠牲にした。雌雄のSDラットからの心臓ミトコンドリアは、10〜13週齢(250〜400g)で得られた。バッファーのレシピは 表1 に記載されており、事前に準備する必要があります。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 実験の準備

  1. 単離を開始する前に、2本の50 mL遠心分離チューブに「Spins 1 and 2」および「Spin 3」とラベル付けします。
  2. チューブ、解凍したばかりの分離バッファー(IB)、鋭利なミンチハサミ、組み立てた均質化プローブ、および5 mLのビーカーまたは同等のサイズの容器を氷の上に置きます。
  3. 解凍したばかりの呼吸緩衝液(RB)をインキュベーターに入れ、その後の呼吸器アッセイのために温めます。
  4. 冷蔵遠心分離機を4°Cに予冷します。
  5. すべての機器が配置され、 Bacillus licheniformis 由来の7-15 U/mgプロテアーゼ20 μLが「スピン1および2」とラベル付けされたチューブに追加されていることを確認してください。
  6. Cardioplegia buffer (CB、表 1)、ガラス カニューレ、およびストップコック バルブが取り付けられたプラスチック チューブを使用して、カニューレ挿入による灌流用の重力依存圧力システムを設定します。
  7. 手術器具を配置し、心臓の解剖とカニューレ挿入のための適切なはさみと鉗子を含めます。
    注:すべての水は純粋な品質(18.2MΩ・cm)である必要があります

2. 組織解剖

  1. 無菌の硫酸ヘパリンを500 U / kgの用量で腹腔内に動物に注射します。.
  2. ヘパリン投与後15分間、動物を誘導室に座らせます。この間、2 L/minの純粋なO2 ガスを供給して、動物を完全に酸素化し、落ち着かせ、関心のある組織に悪影響を与える可能性のあるストレスを最小限に抑えます。
  3. 0.5%のイソフルランの連続的な流れによって麻酔導入を開始します。1分後、1%に増やします。5%に達するまで、1分ごとに1%ずつ増加し続けます。5%になったら、1分間待ってから動物の呼吸パターンを観察します。
  4. 呼吸が遅くなり、苦しくなったら(約6.5分あたり)、イソフルランと酸素の流れを止めます。
  5. 動物を誘導室から素早く取り出し、足を絞って角膜反射を確認し、適切な麻酔の深さを確認します。動物がいずれかの刺激に反応した場合は、それを誘導室に戻し、麻酔を読んで、麻酔薬の深さチェックを繰り返します。
  6. 麻酔の適切な深さに達したら、ギロチンですぐに首を切って頸椎を厳しくし、うつ伏せの体を氷の上に置きます。
  7. 鎖骨から外側胸郭に沿って胸部の長さに沿って進む2つの平行な垂直切開を行います。切開部が胸部外側の肋骨を貫通するのに十分な深さであることを確認してくださいが、心臓や大血管などの胸腔内構造を損傷しないようにしてください。
    注:垂直方向の切開サイズは、使用する動物によって異なります。モルモットやラットを使用する場合は、横隔膜(ラットで約6.35cm、モルモットで約11cm)までカットします。マウスを使用する場合は、標準的な開胸術27を行います。
  8. 止血剤を使用して心臓を露出させ、前胸部を変位させ、露出した胸腔に氷を詰めます。このステップにより、温かい虚血時間が最小限に抑えられ、単離された細胞小器官の生存率が向上します。
  9. ピンセットを使用して胸腺と心膜を鈍く解剖し、心臓を完全に露出させます。
  10. 鉗子を使用して、心臓に穏やかな下牽引力を加えて、大動脈を露出させて識別します。大動脈は、心臓の基部から枝分かれした最も太い大きな血管です。肺静脈などの他の大きな血管は、大動脈よりも著しく半透明です。
  11. 大動脈を大動脈根根の約4〜6mm上、頸動脈の分岐点より下に切断します。
  12. 大動脈をカニューレに伸縮させ、重力依存の圧力ヘッドを使用して氷冷した心臓麻痺(CB)溶液で心臓28,29を灌流し、冠状動脈の血液が取り除かれ、臓器が白くなったように見えるまで。
    注:大きなげっ歯類の場合、1.8〜2.2 mmのカニューレの直径がうまく機能しますが、小さなげっ歯類の場合は、1.4〜1.8 mmの直径範囲をお勧めします。再灌流は、冠状血管から血液が排出されるまでに15〜30秒しかかからないはずです。
  13. 心房、軟骨弁組織、および脂肪組織を解剖することにより、心室心筋を分離します。
  14. 0.1〜0.2mLの氷冷IBを含む予め冷却した10mLビーカーに心室を置きます。
  15. 鋭利な外科用ハサミで組織を細かく刻み、片が約1 mm3になるまで挽きます。

3. ミトコンドリアの精製とタンパク質の定量

  1. ミンチ組織を、プロテアーゼ溶液を含む「スピン1および2」とラベル付けされた予め冷却した遠心分離チューブに移します。
  2. 氷冷したIBを最終容量25mLまで加えます。
  3. 電動ハンドヘルドローターステーターホモジナイザーを使用して、組織を18,000rpmで氷上に20〜25秒間分散させます。
  4. 「Spins 1 and 2」とラベル付けされたチューブ内でホモジナイズした組織を、8,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。
  5. 上清(プロテアーゼを含む)を廃カーボイに注いで捨て、ペレットを5mLのIBで優しくすすぎ、残留プロテアーゼを除去します。
  6. すすぎ液を廃棄した後、ペレットを新鮮な氷冷IBで穏やかな渦で最終容量25 mLに再懸濁します。
  7. 800 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  8. 上清(ミトコンドリアを含む)を、「Spin 3」とラベル付けした予め冷やした50mLチューブに静かに注ぎます。注ぐときは、ペレットの緩い上部が外れないように注意してください。別の方法として、トランスファーピペットまたはストリペットを使用して上清を収集することができます。
  9. 上清を8000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  10. 得られた上清を廃棄し、ミトコンドリア含有ペレットを保持します。
  11. 糸くずの出ないワイプを使用して、ペレットを乱さないように注意しながら、チューブの内壁から余分な上清を吸収します。ペレットは氷上でできるだけ4°Cに保ちます。
  12. ミトコンドリアを再懸濁するには、チューブの底に80μLの氷冷したIBを加えます。ペレット上でIBを繰り返し洗浄することにより、ペレットを穏やかに再懸濁します。
  13. 気泡の発生を防ぐには、マイクロピペットを吸引するように設定し、40〜60μLの容量で送液します。
  14. ミトコンドリアペレットが分散するにつれて、マイクロピペットの容量を増やして、ペレット化されたミトコンドリアを効率的に再懸濁します。ピペットの先端でペレットに触れたり、泡を立てたりしないでください。
  15. 再懸濁したら、ミトコンドリアを事前に冷却した微量遠心チューブに移し、ストックミトコンドリアとして標識します。再懸濁液の総量をメモします。
  16. サンプル中のミトコンドリアタンパク質濃度を測定するには、製造元の指示で定義されているように、よく知られているBCAまたはBradfordタンパク質アッセイを使用して全タンパク質アッセイを実施します。
    注:収量を評価するための代替または補完的な戦略は、クエン酸シンターゼ活性を決定することです。参考までに、ミトコンドリア含有量は、Vinnakotaら30に記載されているプロトコルに従うことで定量化できます。

4. 品質管理チェック

  1. あらかじめ冷却した微量遠心チューブで、ミトコンドリアストックをIBで目的の作業濃度に希釈します。
    注:ミトコンドリアストックは、心臓組織からの分離株を使用する場合、呼吸器測定アッセイの最終濃度0.1 mg / mLで動作するように40 mg / mLに希釈されます。
  2. オキシグラフチャンバー、ストッパー、マイクロリットルシリンジを蒸留水で10回すすぎ、呼吸器アッセイで使用する前に洗浄します。
  3. ミトコンドリア分離株の生存率と品質をテストするには、2.3 mLの呼吸緩衝液(RB)をオキシグラフチャンバーにロードし、酸素消費シグナルを37°Cで約10分間、または速度が0に近いときに平衡化させます。
  4. 信号が平衡化したら、ストッパーを押し下げ、ストッパーの毛細血管から出てくる余分なバッファーを吸引します。
  5. マイクロリットルシリンジを使用して1 mM EGTAを添加し、バッファーまたはミトコンドリアサンプル中の残留カルシウムをキレート化します。
  6. 呼吸を促進するために、5 mMピルビン酸ナトリウムと1 mM L-リンゴ酸を追加します。.
  7. 基質を添加した後、希釈したミトコンドリアのボーラスを加えて作業集中を達成し、5分間呼吸を行います。この期間は、LEAKまたは状態2呼吸と呼ばれます。
  8. 5分経過時に、500 μM ADPのボーラスを添加して状態3の呼吸(OXHPOSとも呼ばれる)を開始し、ミトコンドリアが無酸素になるまで呼吸させます。
  9. 状態 3 の最大酸素消費量を、状態 2 で ADP を追加する直前の酸素消費量の割合で割ることにより、呼吸制御比 (RCR) を計算します ( 図 1 を参照)。
    注:1 - 1 / RCRの代替RCR式は、0と1の間の境界にある品質のメトリックとしても使用できます。ただし、RCRが10>の場合、このメトリックを使用して品質を区別することは困難になります( 図2を参照)。
  10. チャンバーとストッパーを純水で10回すすぎ、その後のアッセイのためにオキシグラフを洗浄します。呼吸測定が完了したら、チャンバーに70%エタノールを充填し、次の使用までチャンバーにストッパーを配置します。.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

ミトコンドリア単離が完了したら、高分解能呼吸測定法を使用して酸素消費量(JO2)を定量化することにより、分離株の品質と機能を試験する必要があります。そのために、ミトコンドリアストックを40 mg/mLに希釈して、単離された心臓ミトコンドリアを使用したすべての呼吸器測定アッセイで、2 mLのRB中に0.1 mg/mLの作業濃度を設定できるようにしました。呼吸は、カルシウムキレート剤である 1 mM EGTA の存在下で 5 mM ピルビン酸ナトリウムと 1 mM L-リンゴ酸によって燃料を供給され、5 分間平衡化して状態 2 の呼吸を確立しました。この状態では、酸素消費量は平均45〜55 pmol/mL/sまたは27〜33 nmol / mg / minである必要があります。電極依存性の酸素消費率に注意し、必要に応じて適切なバックグラウンド補正を行います。酸化的リン酸化(状態3)は、500 μM ADPのボーラスによって5分後に開始されます。基板の追加と代表的なトレースを図1に示します。機能的なミトコンドリアは、

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

このプロトコルに簡潔に記載されている方法に従うことで、他の組織タイプや供給源に加えて、小さなげっ歯類の心臓組織からよく結合したミトコンドリアを確実に単離することができます。全体として、このプロセスには合計3〜3.5時間かかり、その間、すべての動物組織、サンプル、および分離株は、劣化を制限するために可能な限り4°Cの氷上に留まる必要があります。この手順は堅牢であり、実験の目標と使用するモデルにより適合するようにいくつかの方法で変更できます。組織解剖プロセス中に行うことができる調節の1つは、ヘパリンの排除です。ヘパリンは血栓の形成を防ぐために投与されます31 が、心臓が十分に迅速に(斬首から1.5分以内に)カニューレ挿入および灌流される場合は必要ありません。さらに、大型のげっ歯類にはCBを使用した心臓の灌流が推奨されるため、マウスの心臓や他の臓器を扱う場合は、ミンチ化および初期均質化の前にIB洗浄を含めることをお勧めします。このステップにより、解剖プロセスから持ち越された血液を廃棄することができます。その他の変更には、ミトコン...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は、開示することは何もないと宣言します。

謝辞

私たちは、この議定書への基本的な貢献に対して、Daniel A. BeardとKalyan C. Vinnakotaに感謝します。この研究は、NSF CAREER 助成金 MCB-2237117 によって資金提供されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.7mL微量遠心チューブ
10mLガラスビーカー臓器の解剖およびミンチ用
50mL遠心チューブ遠心分離
アデノシン5'-二リン酸一カリウム塩二水和物シグマ A5285呼吸器測定アッセイ
BSA タンパク質アッセイキットThermo ScentificPI23225Mitochondrial protein quantification
DextroseSigma DX0145緩衝液用(CB)
エチレングリコール-ビス(2-アミノ-エチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸 シグマ E4378緩衝液(CBおよびIB)および呼吸測定アッセイ用ガラス
カニューレ、ラドノティ、モルモットおよびラット、心臓灌流
ヘパリン、ブタナトリウム、粘膜、シグマ SRE0027-250KUアニマルIPインジェクション
高分解能呼吸計クラーク型電極; 2mLチャンバー付きオキシグラフ
インダクションチャンバー
イソフルランシグマ 792632麻酔 
L-リンゴ酸シグマ 02288-50G呼吸器測定アッセイ
塩化マグネシウム六水和物Sigma M9272バッファ用(RB)
マンニトールシグマ MX0214バッファ用 (IB)
マイクロリットルシリンジサイズ 5 &ndash からの範囲。50 マイクロ;L
マイクロプレートリーダー37°Cでインキュベートできる必要があります。C 
MOPSシグマ 475898全バッファー用
O2タンク
OMNI THQ ホモジナイザーOMNI International 12-500同様のローターステーターホモジナイザーは
、ピペットの容量  2&ndashで動作します。20 µL;20–200 µL;200–1000 &マイクロ;L
塩化カリウムSigma P3911バッファー(RBおよびCB)用
カリウム二塩基性Sigma 795496バッファー(IBおよびRB)の場合
Bacillus licheniformis Sigma由来プロテアーゼ P5459
塩化ナトリウムΣ S9888緩衝液用 (CB)
ピルビン酸ナトリウムフィッシャー バイオ試薬BP356-100呼吸器測定アッセイ
スクロース シグマ 8510-OPバッファー用 (IB)
外科解剖キット動物と組織の供給源によって異なります
卓上遠心分離機4°Cに冷却する必要があります。C 
、リン酸

参考文献

  1. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  2. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  3. Ernster, L., Schatz, G. Mitochondria: A historical review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  4. Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease. Nat Commun. 11 (1), 102(2020).
  5. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  6. Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).
  7. Kalpage, H. A., et al. Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis. Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).
  8. Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. Mitochondrial respiratory chain complexes. Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).
  9. Mitchell, P., Moyle, J. Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation. Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).
  10. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  11. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).
  12. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  13. Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association. Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).
  14. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  15. Holzem, K. M., et al. Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts. FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).
  16. Cordero-Reyes, A. M., et al. Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function. J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).
  17. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  18. Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).
  19. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).
  20. Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide. PLoS One. 7 (9), e44667(2012).
  21. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  22. Micakovic, T., et al. Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes. Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).
  23. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).
  24. Hubbard, W. B., et al. Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue. Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).
  25. Zhou, D., et al. Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).
  26. Hernandez-Camacho, J. D., et al. Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays. J Vis Exp. (180), e63336(2022).
  27. Farrugia, G. E., et al. A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts. STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).
  28. Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function. PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).
  29. Vinnakota, K. C., et al. Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2). Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).
  30. Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria. Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).
  31. Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. Statpearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).
  32. Sercel, A. J., et al. Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer. STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).
  33. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. J Vis Exp. (97), e52076(2015).
  34. Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential. PLoS One. 7 (10), e47254(2012).
  35. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  36. Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster. J Vis Exp. (155), e59454(2020).
  37. Tomar, N., et al. Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).
  38. Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis. FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).
  39. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709(2011).
  40. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).
  41. Zhou, Z., et al. Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease. Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).
  42. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members. Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).
  43. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate. J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  44. Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer. Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).
  45. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).
  46. Huerta, B., et al. Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites. Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).
  47. Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism. PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

さらに記事を探す

ミトコンドリア精製呼吸制御比タンパク質定量臓器摘出バイオエナジェティクス障害リン酸カルシウム顆粒心不全ミトコンドリア生理学
げっ歯類の心臓組織からの堅牢なミトコンドリア単離
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。