げっ歯類の心臓組織からの堅牢なミトコンドリア単離

サマリー

ミトコンドリアの生体エネルギーおよびメタボローム研究により、多くの疾患におけるミトコンドリアの多面的な役割が明らかになっていますが、これらのオルガネラの単離方法はさまざまです。ここで詳述する方法は、複数の組織源から高品質のミトコンドリアを精製することができます。品質は、高解像度呼吸測定で評価される呼吸制御比やその他の指標によって決定されます。

要約

ミトコンドリアの単離は、分子生物学と生化学の分野のパイオニアが代謝障害や疾患を研究するために確立した手順に従って、何十年にもわたって行われてきました。ミトコンドリアの生理学と生体エネルギー学を適切に調査するには、一貫したミトコンドリアの品質が必要です。しかし、研究者は多くの異なる分離方法が公開されています。実験戦略が異なれば必要な単離方法も異なりますが、基本的な原理と手順は似ています。このプロトコールは、小動物や細胞を含む様々な組織源からよく結合したミトコンドリアを抽出することができる方法を詳述しています。概説されているステップには、臓器解剖、ミトコンドリア精製、タンパク質定量、およびさまざまな品質管理チェックが含まれます。高品質のミトコンドリアを特定するために使用される主要な品質管理指標は、呼吸制御比(RCR)です。RCRは、酸化的リン酸化中の呼吸数とADPがない場合の呼吸数との比です。代替メトリックについて説明します。このプロトコルでは、組織源に対する高いRCR値が得られますが、研究者の個々のニーズに合わせていくつかのステップを最適化することができます。この手順は堅牢であり、動物モデルと組織供給源全体で平均以上のRCR値を持つミトコンドリアを一貫して分離しました。

概要

ミトコンドリアは、特定の細胞機能に最適化された細胞質エネルギー条件を確立する細胞内小器官です。細胞、組織、生物レベルの研究は、ミトコンドリアの機能に関する洞察を提供することができますが、オルガネラを単離することで、他の方法では不可能なレベルの実験的制御が可能になります。ミトコンドリアの単離は1940年代から行われており、さまざまな細胞や組織にわたる代謝と呼吸の機構的研究を可能にしています^1,2。ミトコンドリアの歴史的関連性も十分に文書化されています³。ATPの主な産生者として、ミトコンドリアは細胞および臓器の最適な機能に不可欠な多くの重要な役割を果たしています⁴。ミトコンドリアマトリックス内では、基質はTCAサイクルによって酸化され、還元当量やNADHやUQH_などの可動電子キャリアが生成されます2 ^5,6。シトクロムCは、ミトコンドリアの生化学反応ネットワーク⁷における3番目の主要な移動電子キャリアである。これらの分子は、ミトコンドリア内膜⁸に埋め込まれた電子伝達系(ETS)の膜貫通複合体によって酸化される。ETSの酸化還元反応は、マトリックスから膜間空間へのプロトン転座と結合しています。これらのプロセスは、_F1F₀ ATP合成酵素によってPiでADPをリン酸化してATP ^9,10を生成するために使用される電気化学的プロトン勾配を確立します。各複合体で発生する個々のプロセスは、クラーク型電極またはマイクロプレート酸素消費アッセイ^11,12を使用した高分解能呼吸測定で探索することができる。さらに、単離されたミトコンドリアを用いた疾患モデルと治療法は、特定の病状の進行におけるミトコンドリア機能の影響または重要性を判断できます。これは心臓病学の分野で実り多いことが証明されており、ミトコンドリアの機能不全が心不全にどのように影響するかを解明するために、燃料と基質の送達の変化が使用されてきました13,14,15,16。ミトコンドリアは、糖尿病、癌、肥満、神経障害、およびミオパチーなどの他の病状の発症にも影響を与えることが知られている^17,18。したがって、単離または精製されたミトコンドリアを使用すると、ソース組織における酸化代謝とATP産生のメカニズム調査が可能になります。

ミトコンドリアの単離プロトコルは、生体エネルギー研究におけるその重要性から、不足はありません。さらに、組織および細胞内のミトコンドリアの亜集団に合わせた非常に特異的な方法が見出される^19,20。基本的な手順手順は単離法間で似ていますが、ミトコンドリアの量と品質を改善するために、組成、均質化ステップ、および遠心分離スピンを緩衝するバリエーションを作ることができます。これらの側面の変化は、組織の代謝要求、全体的な臓器機能、ミトコンドリア密度、およびその他の要因に基づいています。肝臓や骨格筋などの組織では、ミトコンドリアの完全性を維持し、ミトコンドリア膜²¹の損傷を制限するために、ハンドヘルドホモジナイザーが使用される。しかし、腎臓から単離する場合、一部のプロトコルでは、手動駆動の均質化または市販のキットを使用してより良い結果を得ることを提案しています²²。どちらの方法でも機能的なミトコンドリアが得られますが、これらのプロトコルを使用して分離を完了するのにかかる時間が増えると、細胞小器官の品質が損なわれる可能性があります。遠心分離は、核や他のオルガネラなどの細胞成分をミトコンドリアから分離するため、ミトコンドリアタンパク質の抽出にも不可欠です²³。単離プロセス中に、より純粋な分離物を得るために、差分遠心または密度ベースの遠心分離を実施すべきかどうかが議論される²⁴。密度遠心分離では、ペルオキシソームなどの比重が類似したオルガネラからミトコンドリアを分離できますが、これらの方法によるミトコンドリアが、分画遠心分離を使用して単離されたミトコンドリアと比較して、in situオルガネラの機能をよりよく表しているかどうかは十分に確立されていません。ミトコンドリア生理学の分野では、密度ベースの遠心分離が好まれており、単離品の純度を高めるために簡単に変更することができます。gフォース、遠心分離時間、および遠心分離スピン数の変化を組み込むかどうかは、ミトコンドリアの精製に影響を与えるため、実験前に考慮する必要があります。さらに、ミトコンドリアの再懸濁は、おそらく単離中の最も重要なステップであるが、スクレイピング、ボルテックスベースの混合、または均質化の使用により、研究間で大きく異なる23,25,26。これらのタイプの機械的再懸濁は、研磨性が高すぎて、ミトコンドリアの膜の完全性を損なう可能性があります。このため、これを修正するために穏やかな洗浄を行う必要があります。多くのモジュレーションと推奨される方法論にもかかわらず、げっ歯類モデルに対する高い再現性と適応性を備えた包括的なプロトコルは少ないです。

本明細書に記載の方法は、小動物の心臓組織から精製された、よく結合したミトコンドリアをもたらす、詳細で堅牢で再現性の高いプロトコルの概要を示しています。実証されたように、この方法は、腎臓、肝臓、および培養細胞からミトコンドリアを単離するための各実験および/または実験室環境の特定のニーズに合わせて容易に適合させることができます。ここに記載されていない組織や他の動物からミトコンドリアを単離するために、さらなる改変を加えることができる。すべての分離に使用されるバッファーレシピが提供されており、必要に応じて変更できます。他の公開プロトコルと同様に、電動均質化と示差遠心分離が実装されています。ただし、分離源に応じて、高品質のミトコンドリア分離物を一貫して送達するために、サンプルを遠心分離するせん断時間と力の両方に調整が加えられます。特に、このプロトコルは他のプロトコルとは異なり、ペレット化されたミトコンドリアを再懸濁するためにピペッティング による 穏やかな洗浄を使用し、ミトコンドリア膜の完全性を維持し、オルガネラの全体的な機能を維持するのに役立ちます。ミトコンドリアタンパク質は、全タンパク質測定またはクエン酸合成酵素活性の測定によって定量されます。この単離法の有用性と幅広い適用性は、さまざまな生物や組織源で達成される呼吸制御比(RCR)の値によってさらに裏付けられています。

プロトコル

すべての脊椎動物の使用と治療は、ミシガン州立大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって審査され、承認されたプロトコルに従って行われました。このプロトコルは、雄と雌の両方のハートレーアルビノモルモットとスプレイグドーリー(SD)ラットを使用して設計されました。モルモットからの心臓ミトコンドリアの単離のために、動物を4〜6週齢(300〜450g)で犠牲にした。雌雄のSDラットからの心臓ミトコンドリアは、10〜13週齢(250〜400g)で得られた。バッファーのレシピは 表1 に記載されており、事前に準備する必要があります。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 実験の準備

1. 単離を開始する前に、2本の50 mL遠心分離チューブに「Spins 1 and 2」および「Spin 3」とラベル付けします。
2. チューブ、解凍したばかりの分離バッファー(IB)、鋭利なミンチハサミ、組み立てた均質化プローブ、および5 mLのビーカーまたは同等のサイズの容器を氷の上に置きます。
3. 解凍したばかりの呼吸緩衝液(RB)をインキュベーターに入れ、その後の呼吸器アッセイのために温めます。
4. 冷蔵遠心分離機を4°Cに予冷します。
5. すべての機器が配置され、 Bacillus licheniformis 由来の7-15 U/mgプロテアーゼ20 μLが「スピン1および2」とラベル付けされたチューブに追加されていることを確認してください。
6. Cardioplegia buffer (CB、表 1)、ガラス カニューレ、およびストップコック バルブが取り付けられたプラスチック チューブを使用して、カニューレ挿入による灌流用の重力依存圧力システムを設定します。
7. 手術器具を配置し、心臓の解剖とカニューレ挿入のための適切なはさみと鉗子を含めます。
   注:すべての水は純粋な品質(18.2MΩ・cm)である必要があります

2. 組織解剖

1. 無菌の硫酸ヘパリンを500 U / kgの用量で腹腔内に動物に注射します。.
2. ヘパリン投与後15分間、動物を誘導室に座らせます。この間、2 L/minの純粋なO₂ ガスを供給して、動物を完全に酸素化し、落ち着かせ、関心のある組織に悪影響を与える可能性のあるストレスを最小限に抑えます。
3. 0.5%のイソフルランの連続的な流れによって麻酔導入を開始します。1分後、1%に増やします。5%に達するまで、1分ごとに1%ずつ増加し続けます。5%になったら、1分間待ってから動物の呼吸パターンを観察します。
4. 呼吸が遅くなり、苦しくなったら(約6.5分あたり)、イソフルランと酸素の流れを止めます。
5. 動物を誘導室から素早く取り出し、足を絞って角膜反射を確認し、適切な麻酔の深さを確認します。動物がいずれかの刺激に反応した場合は、それを誘導室に戻し、麻酔を読んで、麻酔薬の深さチェックを繰り返します。
6. 麻酔の適切な深さに達したら、ギロチンですぐに首を切って頸椎を厳しくし、うつ伏せの体を氷の上に置きます。
7. 鎖骨から外側胸郭に沿って胸部の長さに沿って進む2つの平行な垂直切開を行います。切開部が胸部外側の肋骨を貫通するのに十分な深さであることを確認してくださいが、心臓や大血管などの胸腔内構造を損傷しないようにしてください。
   注:垂直方向の切開サイズは、使用する動物によって異なります。モルモットやラットを使用する場合は、横隔膜(ラットで約6.35cm、モルモットで約11cm)までカットします。マウスを使用する場合は、標準的な開胸術²⁷を行います。
8. 止血剤を使用して心臓を露出させ、前胸部を変位させ、露出した胸腔に氷を詰めます。このステップにより、温かい虚血時間が最小限に抑えられ、単離された細胞小器官の生存率が向上します。
9. ピンセットを使用して胸腺と心膜を鈍く解剖し、心臓を完全に露出させます。
10. 鉗子を使用して、心臓に穏やかな下牽引力を加えて、大動脈を露出させて識別します。大動脈は、心臓の基部から枝分かれした最も太い大きな血管です。肺静脈などの他の大きな血管は、大動脈よりも著しく半透明です。
11. 大動脈を大動脈根根の約4〜6mm上、頸動脈の分岐点より下に切断します。
12. 大動脈をカニューレに伸縮させ、重力依存の圧力ヘッドを使用して氷冷した心臓麻痺(CB)溶液で心臓^28,29を灌流し、冠状動脈の血液が取り除かれ、臓器が白くなったように見えるまで。
    注:大きなげっ歯類の場合、1.8〜2.2 mmのカニューレの直径がうまく機能しますが、小さなげっ歯類の場合は、1.4〜1.8 mmの直径範囲をお勧めします。再灌流は、冠状血管から血液が排出されるまでに15〜30秒しかかからないはずです。
13. 心房、軟骨弁組織、および脂肪組織を解剖することにより、心室心筋を分離します。
14. 0.1〜0.2mLの氷冷IBを含む予め冷却した10mLビーカーに心室を置きます。
15. 鋭利な外科用ハサミで組織を細かく刻み、片が約1 mm³になるまで挽きます。

3. ミトコンドリアの精製とタンパク質の定量

1. ミンチ組織を、プロテアーゼ溶液を含む「スピン1および2」とラベル付けされた予め冷却した遠心分離チューブに移します。
2. 氷冷したIBを最終容量25mLまで加えます。
3. 電動ハンドヘルドローターステーターホモジナイザーを使用して、組織を18,000rpmで氷上に20〜25秒間分散させます。
4. 「Spins 1 and 2」とラベル付けされたチューブ内でホモジナイズした組織を、8,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。
5. 上清(プロテアーゼを含む)を廃カーボイに注いで捨て、ペレットを5mLのIBで優しくすすぎ、残留プロテアーゼを除去します。
6. すすぎ液を廃棄した後、ペレットを新鮮な氷冷IBで穏やかな渦で最終容量25 mLに再懸濁します。
7. 800 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
8. 上清(ミトコンドリアを含む)を、「Spin 3」とラベル付けした予め冷やした50mLチューブに静かに注ぎます。注ぐときは、ペレットの緩い上部が外れないように注意してください。別の方法として、トランスファーピペットまたはストリペットを使用して上清を収集することができます。
9. 上清を8000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
10. 得られた上清を廃棄し、ミトコンドリア含有ペレットを保持します。
11. 糸くずの出ないワイプを使用して、ペレットを乱さないように注意しながら、チューブの内壁から余分な上清を吸収します。ペレットは氷上でできるだけ4°Cに保ちます。
12. ミトコンドリアを再懸濁するには、チューブの底に80μLの氷冷したIBを加えます。ペレット上でIBを繰り返し洗浄することにより、ペレットを穏やかに再懸濁します。
13. 気泡の発生を防ぐには、マイクロピペットを吸引するように設定し、40〜60μLの容量で送液します。
14. ミトコンドリアペレットが分散するにつれて、マイクロピペットの容量を増やして、ペレット化されたミトコンドリアを効率的に再懸濁します。ピペットの先端でペレットに触れたり、泡を立てたりしないでください。
15. 再懸濁したら、ミトコンドリアを事前に冷却した微量遠心チューブに移し、ストックミトコンドリアとして標識します。再懸濁液の総量をメモします。
16. サンプル中のミトコンドリアタンパク質濃度を測定するには、製造元の指示で定義されているように、よく知られているBCAまたはBradfordタンパク質アッセイを使用して全タンパク質アッセイを実施します。
    注:収量を評価するための代替または補完的な戦略は、クエン酸シンターゼ活性を決定することです。参考までに、ミトコンドリア含有量は、Vinnakotaら³⁰に記載されているプロトコルに従うことで定量化できます。

4. 品質管理チェック

1. あらかじめ冷却した微量遠心チューブで、ミトコンドリアストックをIBで目的の作業濃度に希釈します。
   注:ミトコンドリアストックは、心臓組織からの分離株を使用する場合、呼吸器測定アッセイの最終濃度0.1 mg / mLで動作するように40 mg / mLに希釈されます。
2. オキシグラフチャンバー、ストッパー、マイクロリットルシリンジを蒸留水で10回すすぎ、呼吸器アッセイで使用する前に洗浄します。
3. ミトコンドリア分離株の生存率と品質をテストするには、2.3 mLの呼吸緩衝液(RB)をオキシグラフチャンバーにロードし、酸素消費シグナルを37°Cで約10分間、または速度が0に近いときに平衡化させます。
4. 信号が平衡化したら、ストッパーを押し下げ、ストッパーの毛細血管から出てくる余分なバッファーを吸引します。
5. マイクロリットルシリンジを使用して1 mM EGTAを添加し、バッファーまたはミトコンドリアサンプル中の残留カルシウムをキレート化します。
6. 呼吸を促進するために、5 mMピルビン酸ナトリウムと1 mM L-リンゴ酸を追加します。.
7. 基質を添加した後、希釈したミトコンドリアのボーラスを加えて作業集中を達成し、5分間呼吸を行います。この期間は、LEAKまたは状態2呼吸と呼ばれます。
8. 5分経過時に、500 μM ADPのボーラスを添加して状態3の呼吸(OXHPOSとも呼ばれる)を開始し、ミトコンドリアが無酸素になるまで呼吸させます。
9. 状態 3 の最大酸素消費量を、状態 2 で ADP を追加する直前の酸素消費量の割合で割ることにより、呼吸制御比 (RCR) を計算します ( 図 1 を参照)。
   注:1 - 1 / RCRの代替RCR式は、0と1の間の境界にある品質のメトリックとしても使用できます。ただし、RCRが10>の場合、このメトリックを使用して品質を区別することは困難になります( 図2を参照)。
10. チャンバーとストッパーを純水で10回すすぎ、その後のアッセイのためにオキシグラフを洗浄します。呼吸測定が完了したら、チャンバーに70%エタノールを充填し、次の使用までチャンバーにストッパーを配置します。.

結果

ミトコンドリア単離が完了したら、高分解能呼吸測定法を使用して酸素消費量(J_O2)を定量化することにより、分離株の品質と機能を試験する必要があります。そのために、ミトコンドリアストックを40 mg/mLに希釈して、単離された心臓ミトコンドリアを使用したすべての呼吸器測定アッセイで、2 mLのRB中に0.1 mg/mLの作業濃度を設定できるようにしました。呼吸は、カルシウムキレート剤である 1 mM EGTA の存在下で 5 mM ピルビン酸ナトリウムと 1 mM L-リンゴ酸によって燃料を供給され、5 分間平衡化して状態 2 の呼吸を確立しました。この状態では、酸素消費量は平均45〜55 pmol/mL/sまたは27〜33 nmol / mg / minである必要があります。電極依存性の酸素消費率に注意し、必要に応じて適切なバックグラウンド補正を行います。酸化的リン酸化(状態3)は、500 μM ADPのボーラスによって5分後に開始されます。基板の追加と代表的なトレースを図1に示します。機能的なミトコンドリアは、図2に示すように、組織源に応じて異なるADPの添加後、すぐにJ_O2が増加します。EGTAを使用しない場合、残留カルシウムは、ミトコンドリア濃度、基質の利用可能性、およびその他の環境要因に応じて、OXPHOS中のJ_O2の最大速度にさまざまな影響を及ぼします。バッファーの組成は、ミトコンドリア膜の完全性と機能の維持に重要です。プロトコル全体を通して言及されている全ての緩衝レシピは、表1にさらに詳述されており、本明細書に記載されている全てのミトコンドリア調製物に利用することができる。

ミトコンドリアの単離が成功したことは、 表2に示すように、各種および組織源ごとに所与の範囲内にあるRCR値を取得することによって示されます。このプロトコルを使用して収集されたデータに基づいて、モルモット、ラット、またはマウスから心臓ミトコンドリアを分離する場合、RCRはそれぞれ≥16、≥8、および≥5である必要があります。ラットの肝臓または腎臓から単離する場合、RCRは≥6であるべきですが、細胞からのRCRは3.8を超える場合は許容できると考えられます。RCR値がこれらの範囲を下回る場合、または呼吸器測定のトレースに質的な違いがある場合は、汚染による問題を除外するために、新しいRBと基質を使用した追加のアッセイを実行することをお勧めします。1-1/RCR 変換は 0 から 1 の間の値を制限しますが、RCR 値が 10 より大きい場合に性別または種間でミトコンドリアの品質を比較する場合、このメトリックはお勧めしません。このため、すべての実験で標準RCR値(状態3/状態2またはOXPHOS/LEAK)を定量化しました。マウスの心臓、肝臓、腎臓、および細胞からミトコンドリアをより良く単離するためにこのプロトコルに対して行うことができる調節に関する情報は、 表3に詳述されています。

図1:高解像度呼吸器を用いた品質管理チェックの対象領域。 呼吸室に2mLのRBを充填し、酸素消費率が0に近づくまで37°Cで平衡化させた。平衡化したら、カルシウムキレート剤である1 mM EGTAを、5 mMピルビン酸ナトリウムおよび1 mM L-リンゴ酸とともに添加しました。これらの基質を添加した後、ミトコンドリアを所望の作業濃度(0.1 mg / mL)で添加し、5分間呼吸させて状態2の呼吸(黄色)を達成しました。5分経過時に500μM ADPを添加し、状態3の呼吸を開始しました(赤)。RCRは、赤と黄色のボックスで示された酸素消費率を時間平均して決定し、州3と州2を比較しました。状態 4 は緑色のボックスで示され、ATP のミトコンドリア外 ATPase 加水分解の期間を表し、シトクロム C アッセイの外膜完全性の評価に使用できます。表示されたデータは、SDラット心臓ミトコンドリアを用いて収集した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:代表的なJ_O2 トレースと、動物および組織源全体の呼吸制御比。 単離されたミトコンドリアの品質は、高分解能呼吸器法を使用して酸素消費率を定量化することによりテストされました。呼吸は、1 mM EGTAの存在下で5 mMピルビン酸ナトリウムと1 mM L-リンゴ酸によって促進されました。ミトコンドリアと基質は、状態 2 の呼吸が安定するために 5 分間呼吸することを許されました。ADPの追加後の酸素消費量の最大速度をADP前の状態2の酸素消費量と比較して、各組織の呼吸制御比(RCR)を計算しました。ミトコンドリアの品質は、PL制御効率基準によって特徴付けられる1-1 / RCR値を計算することにより、さらに評価されました。各トレースの右側にある棒グラフは、特定の組織のSD±男性(青)と女性(緑)の平均RCRおよび1-1/RCR値を示しています。(A)、(B)、(C)はそれぞれモルモット、Sprague Dawley(SD)ラット、Friend leukemia virus B(FVB)マウスの心臓を用いて収集したデータです。(D)および(E)はSDラットの肝臓および腎臓からの詳細な結果であり、(F)はHEK293細胞を指します。3つの大きな肝葉を採取し、両方の腎臓を分離に使用しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:バッファレシピ。 分離プロセス全体で使用される心臓麻痺バッファー (CB)、分離バッファー (IB)、および呼吸バッファー (RB) は、記載されている指示に従って事前に準備する必要があります。CBは4°Cで最大1ヶ月間、IBとRBは-80°Cで4ヶ月間保存できます 。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:呼吸制御比の分析。 機能解析のためのミトコンドリア単離は、雌雄のげっ歯類と雌のげっ歯類、およびHEK293細胞の幅広い種と組織源で行われました。各性別、組織源、および種のサンプルサイズは、SD±平均RCRおよび1-1/RCR値とともに詳細に説明されています 。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表3:タンパク質収量を増やすための、異なる組織に対するミトコンドリア単離プロトコルへの推奨調節。 プロテアーゼと遠心分離の量の変化は、組織源に応じて表示されます。BSAタンパク質アッセイの結果と最終ミトコンドリアペレットの再懸濁量から、総タンパク質の平均量(mg)を計算しました。値は平均± SD として報告されます。遠心分離カラムに含まれる太字の指示は、上清を廃棄するか、保持するか、またはプールするかをアドバイスします。廃棄とは、上清を生物学的廃棄物容器に廃棄することを指し、保持とプーリングとは、それぞれ上清を次の遠心分離チューブに移すか、最終スピンのために収集することを指します。プロトコルの変更に関する詳細は、ディスカッションセクションをご覧ください。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルに簡潔に記載されている方法に従うことで、他の組織タイプや供給源に加えて、小さなげっ歯類の心臓組織からよく結合したミトコンドリアを確実に単離することができます。全体として、このプロセスには合計3〜3.5時間かかり、その間、すべての動物組織、サンプル、および分離株は、劣化を制限するために可能な限り4°Cの氷上に留まる必要があります。この手順は堅牢であり、実験の目標と使用するモデルにより適合するようにいくつかの方法で変更できます。組織解剖プロセス中に行うことができる調節の1つは、ヘパリンの排除です。ヘパリンは血栓の形成を防ぐために投与されます³¹ が、心臓が十分に迅速に(斬首から1.5分以内に)カニューレ挿入および灌流される場合は必要ありません。さらに、大型のげっ歯類にはCBを使用した心臓の灌流が推奨されるため、マウスの心臓や他の臓器を扱う場合は、ミンチ化および初期均質化の前にIB洗浄を含めることをお勧めします。このステップにより、解剖プロセスから持ち越された血液を廃棄することができます。その他の変更には、ミトコンドリアタンパク質の収量を増やすための均質化速度と遠心分離速度の変更が含まれます。上記のものは、モルモットやラットから心臓ミトコンドリアを単離するためのものです。重要なことに、このプロトコルは、げっ歯類の肝臓、腎臓、マウスの心臓、および細胞からミトコンドリアを単離するために適応させることができます。特定の組織タイプおよび動物に基づくプロテアーゼ、均質化、および遠心分離の体積に対する推奨される変更については、 表3でさらに詳しく説明します。

最終遠心分離ステップで精製されたミトコンドリアペレットが形成された後、ミトコンドリアは予冷したIBに再懸濁されます。添加されるIBの量は、ミトコンドリアペレットのサイズに依存しますが、モルモットやラットでは約80μLです。マウスの心臓から単離する場合は、再懸濁のために60μLのIBを添加します。ミトコンドリアを初めて単離するときは、ストック溶液を希釈しないように、少量のIBを追加することをお勧めします。肝臓や腎臓からサンプルを精製した後に形成されるミトコンドリアペレットは粘稠度が高いため、再懸濁のために添加するIB(20μL)ははるかに少なくなります。他の方法は、ミトコンドリア膜を研磨し、全体的な完全性を低下させる可能性のある掻き取りによる機械的再懸濁の使用を示唆しています^32,33。このプロトコルを使用する場合は、ミトコンドリアの品質を向上させるために、ペレットをIBで穏やかに洗浄することをお勧めします。このプロセス中に、気泡を生成したり、ピペットの先端でペレットを乱したりしないように注意してください、これは膜の破裂とタンパク質のミスフォールディング³⁴につながる可能性があるからです。ピペットの最初のストップまで押すだけで、気泡が発生する可能性を減らすことができます。ペレット全体が懸濁状態になるまで、ピペットを穏やかに洗浄します。モルモットおよびラット由来の心臓ミトコンドリアの総再懸濁収率は150〜200μLで、色は薄茶色に見えます。より濃縮されたサンプルは、より濃い茶色の色合いになり、ミトコンドリアタンパク質の定量後に目的の作業濃度範囲に合うように希釈できます。

BSAを用いた標準的なタンパク質アッセイは、ミトコンドリアタンパク質の定量に最適です³⁵。タンパク質アッセイは、メーカーのプロトコルで定義されている推奨期間と温度で遅延させ、インキュベートする必要があります。単離されたミトコンドリアの場合、37°Cで30分間インキュベートすると、色が十分に広がり、正確なタンパク質定量が可能になります。タンパク質の総量を定量する際には、まず再懸濁したミトコンドリアとIBを1:50、1:100、1:200の比率で希釈し、タンパク質アッセイの結果がキャリブレーション範囲内に収まるようにすることをお勧めします。BSAを標準物質として使用したタンパク質アッセイの実施方法に関する詳細は、メーカーのキットごとに提供されているため、ここに記載されている推奨事項は適用されない場合があります。また、各サンプル中のミトコンドリア含有量を測定するために、CSアッセイも実施する必要があります。このアッセイは十分に確立されており、ミトコンドリアサブタイプ間の生物学的な違いを研究する場合、さらなる標準化を可能にします³⁶。

タンパク質の測定後、ミトコンドリアストックを希釈して、呼吸器測定アッセイの所望の最終使用濃度を達成する必要があります。モルモットおよびラット心臓から単離されたミトコンドリアを40 mg/mLに希釈し、このストックの5 μLを呼吸腔に添加して、0.1 mg/mLの作業濃度にします。マウスの心臓1本または腎臓や肝臓から単離する場合は、ミトコンドリアストックの希釈は必要ないかもしれません。また、所望の濃度を得るために、大量のミトコンドリアを添加することもできます。状態2中の酸素消費量は、35〜55 pmol/mL/sで、ほとんどの呼吸器分析で許容できる²⁸。RCRの実施方法と分析方法に関する詳細は、図1と代表的な結果セクションで説明されています。ただし、呼吸はピルビン酸とリンゴ酸によって促進されることに注意することが重要です。コハク酸やロテノンなどの他の基質条件は、P / O比と他の生体エネルギー変数が異なるため、異なるRCR値をもたらす³⁷。呼吸燃料としてのピルビン酸およびリンゴ酸の使用は、ほぼ最大TCAサイクルの回転率および還元当量の生成を達成する;ただし、最大TCAサイクル活性と結合ETS機能は、5 mMピルビン酸、1 mM L-リンゴ酸、および20 mMコハク酸で得られます。酸化的リン酸化を刺激して状態3中の酸素消費速度を定量化する場合、ADPは、アデニンヌクレオチドトランスロケー^ター38のADP_の推定KDの少なくとも10倍の濃度で添加される。これは、350 μM ADPを超えるボーラスによって達成できるため、すべての実験アッセイで500 μMが使用されました。状態3の持続時間が短すぎる場合は、ミトコンドリア濃度を低くして延長することができます。呼吸のさらなる解析のために、実験パラメータ³⁹により適合するようにシステムに導入されるADPの濃度を調節することができる。このプロトコルを最初に開発したとき、シトクロムCアッセイを使用して、ミトコンドリア分離株⁴⁰の外膜完全性を評価した。RCR値が予想範囲を下回っている場合は、シトクロムCテストを実行して、外膜の損傷が重要であるかどうかを評価します。これを行うには、10 μM のシトクロム C を呼吸室に追加し、呼吸の増加が状態 4 の割合の 5 または 10% 未満であることを確認します。予想される範囲は、以前に発表された研究から得られたもので、種、組織、および基質特異的です。シトクロムcの添加により状態4の呼吸が10%以上で刺激される場合、最後の8,000 x gスピンを繰り返して損傷したミトコンドリアを取り除くことができます。とは言うものの、外膜の損傷は疾患の表現型の一部である可能性があるため、シトクロムCテストはそれを念頭に置いて解釈する必要があります⁴¹。低 (<10%) のシトクロム C 刺激効果で一貫して高い RCR 値が得られたら、このテストは RCR 値が許容範囲外にある場合にのみ必要になり、推奨されます。表2に詳述されているように、シトクロムCテストが<10%で、RCR値が予想範囲外にある場合は、蒸留水で10回洗浄した後、新しいRBで呼吸測定アッセイを繰り返します。それでも減少率が観察される場合は、問題を診断するために新しい試薬(ピルビン酸、リンゴ酸、EGTA、およびADP)を作成する必要があります。さらに、シトクロムCアッセイは、ELISAおよびTMRE^33,42などのミトコンドリア色素を使用して実施できます。組織の種類と供給源によっては、これらのオプションが外膜の完全性を決定するのにより適している場合があります。

このプロトコルが心臓ミトコンドリアの単離に使用されることに大きな制限はありませんが、これらの方法を利用する際には特定の考慮事項が必要であることに注意することが重要です。ミトコンドリア分離株の品質は、温度と、心臓の灌流と精製されたペレットの再懸濁にかかる時間に大きく影響されます。したがって、ここで報告されているものと同等のRCRを取得するには、これらのプロセスに精通している必要がある場合があります。さらに、単離プロセス中に使用されるバッファーおよび溶液の組成は、ミトコンドリアの完全性および機能に直接影響するため、重要である⁴³。表1にリストされているバッファーは参考文献として提供されており、さまざまな組織源でよく結合したミトコンドリアの単離を可能にしていますが、アデニンヌクレオチドの転座とETS機能を妨げる可能性があるため、呼吸分析で塩化物の量を制限するために変更を加えることができます²⁸。緩衝液の組成を変更して、肝臓のミトコンドリアをより良く分離することもできます。肝臓は脂肪酸濃度が高いため、予想範囲外のRCRが観察された場合は、臓器とミンチ組織を高濃度のBSAを含むバッファーで洗浄することをお勧めします。.肝臓切片から得られるミトコンドリア分離株の品質はよく結合しており、一貫性がありますが、この変化によりオルガネラ機能が改善される可能性があります。また、これらの方法を用いて細胞からミトコンドリアを単離するには、大量の培養細胞が必要であり、これが潜在的な制限をもたらすことも認識されるべきです。さらに、このプロトコルは細胞分離株用に特別に設計されたものではありませんが、実装すると成功していることが証明されています。したがって、培養細胞の標的単離法がより適している可能性があります。あるいは、ミトコンドリアの品質を評価するために、研究者は蛍光プローブを使用してRCRを計算することもできます。特に少量のタンパク質が抽出される場合は、蛍光分光法が一般的な選択肢です^44,45。

全体として、このプロトコルは、モルモットやラットなどの小動物から良好に結合した心臓ミトコンドリアを一貫して単離するために使用できます。ホモジナイズ速度、遠心分離時間、スピン回数を変更することで、マウスの心臓、肝臓、腎臓、細胞からのミトコンドリアの単離を可能にすることで、タンパク質の収量を増やすために簡単に改変することができます。さらに、このプロトコルは、ウミヤツメウナギ⁴⁶のような非哺乳類種からのミトコンドリア機能を調査するために使用されてきただけでなく、古典的およびクライオ電子顕微鏡^40,47を用いて構造解析を行うために使用されてきたほど一般的で堅牢である。最近の多くの研究は、無傷の細胞および組織系におけるミトコンドリアの挙動の探索に焦点を当てていますが、これらの方法を使用して単離されたミトコンドリアから抽出された情報の幅と深さは、メタボロミクス、酸化ストレス、およびATP産生への影響を明らかにしています。よく結合したミトコンドリアを単離することで、研究者は、全細胞モデルでは不可能な疾患の発症と進行の重要な側面を調査することができます。このプロトコルの汎用性により、心血管疾患、糖尿病、および神経障害などの病状で観察されるミトコンドリアエネルギーティクスの変化は、本明細書に記載の方法論を用いて調査することができる。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.7mL微量遠心チューブ
10mLガラスビーカー			臓器の解剖およびミンチ用
50mL遠心チューブ			遠心分離
アデノシン5'-二リン酸一カリウム塩二水和物	シグマ	A5285	呼吸器測定アッセイ
BSA タンパク質アッセイキット	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	緩衝液用(CB)
エチレングリコール-ビス(2-アミノ-エチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸	シグマ	E4378	緩衝液(CBおよびIB)および呼吸測定アッセイ用ガラス
カニューレ	、ラドノティ		、モルモットおよびラット、心臓灌流
ヘパリン、ブタナトリウム、粘膜、	シグマ	SRE0027-250KU	アニマルIPインジェクション
高分解能呼吸計			クラーク型電極; 2mLチャンバー付きオキシグラフ
インダクションチャンバー
イソフルラン	シグマ	792632	麻酔
L-リンゴ酸	シグマ	02288-50G	呼吸器測定アッセイ
塩化マグネシウム六水和物	Sigma	M9272	バッファ用(RB)
マンニトール	シグマ	MX0214	バッファ用 (IB)
マイクロリットルシリンジ			サイズ 5 &ndash からの範囲。50 マイクロ;L
マイクロプレートリーダー			37°Cでインキュベートできる必要があります。C
MOPS	シグマ	475898	全バッファー用
O2タンク
OMNI THQ ホモジナイザー	OMNI International	12-500	同様のローターステーターホモジナイザーは
、ピペット			の容量  2&ndashで動作します。20 µL;20–200 µL;200–1000 &マイクロ;L
塩化カリウム	Sigma	P3911	バッファー(RBおよびCB)用
カリウム二塩基性	Sigma	795496	バッファー(IBおよびRB)の場合
Bacillus licheniformis Sigma由来プロテアーゼ		P5459
塩化ナトリウム	Σ	S9888	緩衝液用 (CB)
ピルビン酸ナトリウム	フィッシャー バイオ試薬	BP356-100	呼吸器測定アッセイ
スクロー	ス シグマ	8510-OP	バッファー用 (IB)
外科解剖キット			動物と組織の供給源によって異なります
卓上遠心分離機			4°Cに冷却する必要があります。C