Method Article

偽層状肺気道上皮の毛様体機能と膜不透過性の決定

DOI:

10.3791/67094

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February 21st, 2025

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Medicine and Health Sciences, University of North Dakota

In This Article

Summary

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気液界面培養は、肺気道の頂端側を模倣する初代正常ヒト気管支上皮細胞を分化することにより、偽層状気道上皮を発達させるために一般的に使用されます。ここでは、繊毛機能や膜の完全性などの生物物理学的特性をモニタリングすることにより、その品質を決定するための簡単なプロトコルについて説明します。

Abstract

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気液界面(ALI)で初代肺気道上皮細胞を分化することは、肺気道の頂端側を模倣する多細胞偽層状気道上皮を開発するための一般的な手法です。初代肺気道細胞の分化が期待されますが、毛様体機能や膜不透過性などの生物物理学的特性の評価は、気道上皮の品質評価を提供し、実験の信頼性を確保します。ここでは、ALI培養における多細胞偽層状気道上皮の開発のための簡単なプロトコルについて説明し、2つの重要な生物物理学的特性、すなわち繊毛機能と膜不透過性を評価します。毛様体機能を決定するために、倒立顕微鏡に取り付けられた高速度カメラを使用して4週間の分化した気道上皮の毛様体運動を捉え、続いてSimon Amon Video Analysis(SAVA)システムを使用して毛様体拍動頻度(CBF)を定量化しました。また、ボルトオーム計を使用して経上皮電気抵抗(TEER)を測定し、気道上皮の上皮バリア完全性を決定しました。

Introduction

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喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症などの慢性呼吸器疾患は、世界中の主要な健康問題の一部です1。また、ヒトインフルエンザA型ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型(SARS-CoV-2)などのウイルスによる呼吸器疾患の蔓延も、経済的・公衆衛生上の負担となっています2。したがって、不可逆的な呼吸器組織の損傷につながる呼吸器疾患の治療計画を開発する必要性が非常に高くなっています。気道上皮組織自体は、酸素摂取に関与するだけでなく、侵入する病原体や危険な化学物質から体を保護するためのバリアも提供します3。呼吸器上皮は、繊毛細胞、杯細胞、基底細胞の3つの主要な細胞タイプで構成される複雑な細胞組織を持っています。最近、気道上皮4に新規ではあるがまれなイオン細胞の存在が報告されています。この複雑な組織は協調して機能し、抗菌ペプチドの分泌、サイトカインの放出による適応免疫応答の活性化、粘液繊毛クリアランス5などの自然免疫応答を提供します。適切な気道モデルがないことは、呼吸器感染症の研究と治療法の開発に対する障害の1つです。

気液界面(A....

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Protocol

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このプロトコルは、バイオセーフティ レベル 2 の層流フード (バイオセーフティ キャビネット) の下で無菌状態で実行する必要があります。すべての培地と溶液は、使用前に37°Cで解凍する必要があります。遠心分離は4°Cで行う必要があります。 実験で使用されるすべての材料は無菌でなければなりません。初代細胞(匿名化ドナー)は、ネブラスカ大学医療センター(UNMC、ネブラスカ州オマハ)のKristina Bailey博士と共同で取得しました。初代細胞は匿名化されたドナーからのものであり、細胞はNIHヒト被験者に該当しません。このセルは、ノースダコタ大学グランドフォークス校とノースダコタ州オマハのUNMCとの間で承認された材料移転契約(MTA)に基づいて取得されました。ここでは、継代した4つのNHBE細胞を使用しました。より高い継代NHBE細胞(継代8まで)も気道上皮に分化することが示されましたが、継代1から4の間で全ゲノム転写プロファイルに明らかな差がないことから、継代4つのNHBE細胞を日常的に使用しています6,14。

1. 初代細胞培養

注:初代細胞の慎重な取り扱いは非常に重要です。プロトコール全体では、初代....

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Results

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2人の独立した匿名化ドナー(2人の非喫煙、健康な成人、またはCOPDの成人、50歳以上の女性)からの分化初代NHBE細胞から得られた気道上皮の毛様体機能と膜不透過性の両方を評価しました。毛様体機能を決定するために、28日間の分化した気道上皮のCBFを決定しました。CBFは両方の気道上皮で少なくとも3Hzに達し、これは以前に発表された結果と同等であることが観察されました(図1)6,7,14。また、TEERを決定することにより、同じ気道上皮の膜不透過性を評価しました。両方の気道上皮で約800オーム/ cm2のTEERが見つかりました。これは、以前に発表されたデータと同様です（図2)6,7,14

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Discussion

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ヒト原発性気道上皮(ALI培養)は、機能とメカニズムを調査し、動物の使用を減らすための生物学的評価のためのin vitro肺モデルとしてますます使用されています14。ALIには、単層の水中培養に比べていくつかの利点があります。例えば、それは、肺気道6,7,14の頂端側を模倣する組織様の偽層状気道上皮を提供する。ただし、実験の信頼性と再現性を高めるために、分化した偽層別気道上皮の品質と完全性を評価する必要があります。高度に分化した頂端気道上皮の品質に関する情報を提供する 2 つの重要な生物物理学的指標は、毛様体機能と膜不透過性です。これらの特性は、ALIにおける一次上皮細胞分化の初期段階で評価することができるが、感染症研究においては、3週間または4週間の分化が偽層状気道上皮を作製するために確実に使用されてきた

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Disclosures

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著者には利益相反はありません。

Acknowledgements

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この研究は、NIH P20GM113123とUND SMHSのパイロット助成金によって資金提供されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国14190-144
気道上皮細胞増殖培地PromoCell、ドイツC-21060
アムホテリシン Bサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国15290-026
EVOM2 ボルトオーム計World Precision Instruments、米国該当
ヘパリン溶液STEMCELL技術、米国07980
ヒドロコルチゾンストックSTEMCELLテクノロジー、米国07926
顕微鏡:ライカDMI8(ライカ顕微鏡)と120f /秒の高速カメラ(Basler)が顕微鏡に関連付けられています。Microsopeは、ステージチャンバーインキュベーターi8でも固定されています。ライカ、米国該当なし
ペニシリン-ストレプトマイシンコーニング、米国30-002-CI
PneumaCult-ALI 基礎培地 STEMCELL technologies, USA05002
PureColAdvanced BioMatrix, USA5005
Sisson-Ammons ビデオ解析 (SAVA) システム.ソフトウェア V.2.1.15 Amson Engineering, USA該当なし
なし

References

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  1. GBDCRD Collaborators. Global burden of chronic respiratory diseases and risk factors, 1990-2019: an update from the Global Burden of Disease Study 2019. E Clin Med. 59, 101936(2023).
  2. Fendrick, A. M., Monto, A. S., Nightengale, B., Sarnes, M.

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