天然マイクロバイオームを持つ実験用マウスの施設の手術および生物学的封じ込め手順:イムノフェノタイピング手順

サマリー

ここでは、イムノフェノタイピングのための採血を例に、ワイルディングマウスの施設における微生物封じ込め対策を含む構造と運用手順について述べる。

要約

「野生マウス」のような天然のマイクロバイオームを持つ実験用マウスの使用は、ヒトの超生物によく似ているため、基礎科学と応用科学の両方にとって有望な研究ツールとなります。しかし、細菌、ウイルス、寄生虫など多様なマイクロバイオームを持つこれらのマウスの繁殖や維持は、研究機関の畜産施設にとって大きな課題となっています。これらの課題に対処するために、シャリテ-ベルリン大学に「野人のネズミ」を収容するための特別な施設コンセプトが開発されました。このアプローチには、特定の構造的特徴と運用プロトコルを備えた施設を設計し、自然のマイクロバイオームを効果的に封じ込めることで、より高い衛生基準を持つ地域を保護することが含まれていました。

免疫表現型検査のための指定病原体フリー(SPF)と「野生マウス」の両方からの採血の方法論が示され、施設で実施されているワークフローと生物学的封じ込め対策が強調されています。驚くべき結果から、天然のマイクロバイオームに曝露された「野生マウス」は、異なる免疫細胞集団を発達させ、厳しい衛生条件下で飼育および維持されたマウスでは、免疫細胞集団が大幅に減少することが明らかになりました。

この研究の重要性は、人間の成人と同様の自然なマイクロバイオームと成熟した免疫システムを持つマウスへのアクセスを研究者に提供する可能性にあります。このアプローチにより、前臨床所見の臨床実践への翻訳可能性が向上し、生物医学研究の分野が進歩する可能性があります。

概要

マウスでの実験は、前臨床研究や毒物学研究など、基礎科学や応用科学において依然として不可欠です。しかし、生物学的ノイズを低減し、実験結果のばらつきを最小限に抑えることを目的とした実験室環境の衛生の標準化により、天然微生物叢が大幅に排除されるようになりました。したがって、衛生的に標準化された特定病原体フリー(SPF)実験用マウスが生まれ、飼育される条件は、人間や動物が通常さらされる実際の条件とは異なります。実験室の条件と人間の病気が発生する自然環境との間のこの不一致は、実験条件の変動を最小限に抑えることでトランスレーショナルアウトカムが向上すると仮定する「標準化の誤謬」を引き起こします。しかし、実際には、それは発見の生物学的関連性を制限します^1,2。例えば、SPFマウスに微生物や環境の多様性がないと、免疫系が未発達になり、免疫学的研究や前臨床研究の妥当性が損なわれる可能性があることが研究で示されています³。

マウスモデルにおける生物学的変異に対処するためにいくつかのアプローチが提案されており、それぞれに独自の利点と制限があり、これには、野生マウスおよびペットショップマウス^3,4,5,6,7,8との共同飼育、共生動物9への逐次曝露⁹、動物を屋外の囲い¹⁰または大型動物の寝具11に保管すること¹¹、および野生のマウス¹²からの糞便移植が含まれる.前臨床および毒物学研究のための有望な新しいマウスモデルは、天然のマイクロバイオーム¹³を持つ標準的な実験用マウス系統からなる「Wildlingマウス」モデルである。この「野性マウス」は、実験用マウス系統の胚を野生で捕獲したマウスに移植することで作製されます。出生中、実験用マウス系統は、ヒトの分娩中に起こる自然な接種を模倣して、代理母の自然なマイクロバイオームを獲得する¹³。「野生ネズミ」は、他の実験用マウスと同様に繁殖することができ、その自然なマイクロバイオームは世代を超えて保存されています。

「野生マウス」は、細菌、ウイルス、寄生虫など、通常はSPFマウス施設から除外される多様な微生物叢を宿主としています。その結果、研究施設で天然のマイクロバイオームを維持することは、これらの微生物を全体的なSPF衛生基準を損なうことなく封じ込める必要があるため、課題を提示します。

ベルリンのシャリテ大学では、「野人マウス」の専用施設が設立され、厳格な生物学的封じ込め措置によってSPFエリアから分離されました。この施設には繁殖室と実験室があり、「野生ネズミ」の自然なマイクロバイオームを維持しながら、SPFエリアが保護されています(図1)。

シャリテのコロニーの創設者ペアは、ドイツのエアランゲン大学病院、フリードリヒ・アレクサンダー・ユニバーシテート・エアランゲン大学(FAU)のマイクロバイオーム研究部門に設立された「ワイルディングマウス」コロニーから輸入されました。彼らには健康証明書が支給され、コロニーの創設者が輸入される前に、人獣共通感染症の病原体のための拡張パネルで監視されます。センチネルは、マイクロバイオームを経時的に監視するために使用されます。SPFと「野人マウス」はどちらも同じ条件下で飼育されています。マウスは、5匹のマウスのグループで、個別換気ケージ(IVC)II型で優先的に飼育されます。施設内の温度は22°Cで、明暗サイクルは12時間です。マウスは、標準的な穀物ベースのチャウと水道水を受け取ります。寝具やエンリッチメントアイテムの除菌は「野生ネズミ」には不要です。しかし、これらのアイテムをオートクレーブすることで、SPFマウスが飼育されている場所での材料の取り違えを防ぐことができます。

このプロトコルでは、SPFと「Wildlingマウス」の両方の免疫表現型検査手順が実証され、「Wildlingマウス」施設での厳格な微生物封じ込めプロトコルが強調されています。これらの対策は、SPF環境の完全性を確保しながら、天然のマイクロバイオームを持つマウスを扱う利点を提供します。

図1:野生ネズミの施設のレイアウト。 E1 = 施設へのアクセス。矢印は施設への入館ルートを示しています。E2 = 施設の外部から層流キャビンへのアクセス。PA = エアシャワー付き人員エアロック。AS = エアシャワー。R1、R2 = 野生ネズミの繁殖のための部屋。R3 = ワイルディングマウスを飼うためのスペース。R4 = SPFマウスを飼うためのスペース。PR1 = SPFマウスの処置室。PR2 = 野人マウスの処置室。SB = 滅菌作業台。EE = 非常口。CR = LAFキャビン前の更衣室。LAF = 保護気流下での介入のための層流キャビン。A = オートクレーブ。ER = 機器室。緑の矢印はSPFの動物を扱うときにアクセス可能なルートを表し、黄色の矢印はエアシャワーを浴びた後に野人のマウスと一緒に働くために利用できる経路を示しています。青い矢印は、飼育スタッフのみのアクセスを示しています。赤い線はLAFキャビン内のガラス壁を示しており、スペースを2つのセクションに分割し、E1からPR2またはE2からCR経由でアクセスできます 。

プロトコル

「ワイルディングマウス」の施設と生きた動物を使った処置は、動物実験を担当する州立事務所「Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin」(LAGeSo)によって承認されました。プロトコルの最も重要なステップを 図 2 にまとめます。

1. ワイルディング施設へのアクセス

1. 施設の運営手順と生物学的封じ込め手順について、担当の動物福祉担当官から個別に紹介を受けてください。
2. 「Wildling mice」の施設に入るためのトランスポンダーキーを取得し、オンライン予約システムを介して手続き室を予約します。

2.「野人のネズミ」の施設内に入る

1. 衣類は更衣室に預けてください。
2. エリアウェア(ズボン、カサック、使い捨てシューズカバー)に着替えます(図3)。

3. SPF領域におけるSPFマウスの採血

1. SPFマウス(雄と雌、8〜20週)を飼育室(R4)から密閉IVCケージ内のSPF動物(PR1)の処置室に移します。
2. 層流ベンチのスイッチを入れ、作業スペースの表面を70%Vol.エタノールで消毒します。ベンチの中で作業します。
3. キャピラリーチューブに壊れた部分や欠けた部分がないか検査して、破損や損傷のリスクが増さないようにします。
4. イソフルランによる短時間の全身麻酔下(酸素が豊富な医療用空気中の5%イソフルランでの誘導、続いて維持のために1.5%〜2.0%)、ペダル離脱反射が失われた後(つま先のピンチで示されるように)、首筋をつかんでマウスの首の静脈を圧迫します。.
5. 片手で、親指と人差し指で動物の頭を固定します。新しい毛細血管を瞬膜の下の眼の内側眼瞼に挿入します。毛細血管が眼球と眼の骨の軌道の間に配置されていることを確認してください。
   注意: 外傷を避けるために、毛細血管の先端が目の表面に触れないようにしてください。
6. キャピラリーを副鼻腔膜を通して、軸方向に緩やかに回転させます。血液が流れるまで、眼窩の後ろでチューブを回転させ続けます。エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む採血管に最低15μLの血液を採取します(約1滴)。
7. 毛細血管を取り外す前に、首筋のグリップを緩めて、組織への出血を最小限に抑えます。良好な止血を確保するために、清潔なガーゼパッドまたは綿棒を使用して出血を止めます。
8. チューブを少し回転させて血液とEDTAを混合します。チューブを振らないでください。血液サンプルを氷上に保存します。
9. 作業面を消毒し、層流ベンチのスイッチを切ります。閉じたIVCのSPFマウスをSPFハウジングルーム(R4)に戻します。

4.「野人のネズミ」のエリアに入る

1. エアシャワー(PA)の控え室で靴と靴下を脱ぎます。エリアソックスと、タイベックのオーバーオール、ヘアネット(必要に応じて)、綿手袋、ニトリル手袋、フェイスマスクで構成される全身個人用保護具(PPE)を着用します(図3)。
2. 粘着性の床材を介して靴下でエアシャワーに入ります。エアシャワーを浴びながら、腕を上げて360°回転させます。
3. エアシャワーを出て、反対側でエリアシューズを履きます。

5.「ワイルディングマウス」からの採血

1. 「野生マウス」(オスとメス、8〜20週間)を、密閉されたIVCケージに飼育されている部屋(R3)から処置室(PR2)に移します。
2. 層流ベンチのスイッチを入れ、作業スペースの表面を消毒します。
3. セクション3のステップ2〜8でSPFマウスのサンプリングについて説明した手順に従います。
4. 採血が完了したら、手袋を交換します。すべての材料と表面を消毒します。層流ベンチのスイッチを切ります。

6. 「野生マウス」エリアからLAF(Laminar Airflow)キャビネット経由で血液サンプルをエクスポート

注:処置室(PR2)には、材料ロックと滅菌介入室として機能するLAFキャビネットが含まれています。サンプルはLAFキャビンを介して転送されます。内部は、ワイルドリングエリアの内側(E1とPR2経由)と外側(E2とCR経由)の両方からアクセスでき、スライドドア付きのガラス壁によって中央が分割されています(図1)。材料をエクスポートするには2人が必要です:パーソン1(ワイルドリングエリア内[PR2経由])は、手順6.1と6.2を実行します。パーソン2(ワイルドリングエリア外[E2経由])は、手順6.3〜6.5を実行します。

1. サンプル容器を消毒します。LAFキャビンのガラス壁にあるスライドドアからサンプルコンテナを取り出します。
2. 人2へのサンプル容器の移し替えが完了したら、LAFキャビンの反対側にいる人2(キャビンのスモックロックで防護服を着用している)から防護服を受け取り、廃棄します。すべての表面を消毒します。
3. LAFキャビンの前のアクセスLAFで防護服を着用します(CR、 図1)。
4. 消毒されたサンプルコンテナは、LAFキャビンのガラス壁にあるスライドドアを介して、ワイルドリングエリアから非接触で受け取ります。
5. 防護服を脱ぎ、スライドドアを通してLAFキャビンの内部に通して廃棄します。

7.「野人のネズミ」の施設からの退出

1. 使い捨てのオーバーオールとエリアシューズはエリア内に置いておきます。ヘアネット、ゴム手袋、フェイスマスクは廃棄してください。
   注:靴とオーバーオールは再利用できます。
2. エリアソックスですぐにエアシャワーに入ります。エアシャワーを浴びながら腕を上げて360°回転します。
3. エアシャワーを放っておき、エリアソックスをランドリーコレクターに入れます。靴下と靴、使い捨ての靴カバーを履きます。ランドリーコレクターの更衣室にエリアの衣類を預けます。更衣室で着替える

8. 血液サンプルの処理と分析

1. 血液サンプルを検査室に持参してください。
   1. 蛍光色素標識抗体染色カクテルの調製:各サンプルについて、0.25 μL の Alexa Fluor 700 抗マウス CD45、0.25 μL の Brilliant Violet 605 抗マウス TCR-β 鎖、0.25 μL の APC 抗マウス CD4、0.25 μL の Brilliant Violet 785 抗マウス CD8、0.25 μL の FITC 抗マウス CD44、0.25 μL の PerCP/Cyanine5.5 抗マウス CD62L 抗体を 50 μL のフローサイトメトリーバッファー (リン酸緩衝生理食塩水、 2 mM EDTA、0.1% ウシ血清アルブミン、4 °C)。ステップ8.8まで氷の上で暗闇に保管してください。
      注:使用する蛍光色素は、サンプル取得に使用するフローサイトメーターの構成に適合させることができます。
2. 採血管を消毒します。2 mLの氷冷フローサイトメトリーバッファーを5 mLの丸底ポリスチレンチューブに加えます。チューブを氷の上に置きます。
3. 採血管を開きます。フローサイトメトリーバッファーとパルスボルテックスが入ったチューブに10 μLの血液を加えます。
4. 400 x g で4°Cで5分間スピンダウンします。
5. 上清を吸引します。1 mLの赤血球(RBC)溶解バッファー、パルスボルテックスを加え、室温(RT)で3分間インキュベートします。
6. 100 μL の 10x PBS を添加します。400 x g で4°Cで5分間スピンダウンします。
7. 手順8.5〜8.6を繰り返します。
8. 上清を吸引します。抗体染色カクテル50 μLを加え、ボルテックスし、暗所で氷上で20分間インキュベートします。
9. フローサイトメトリーバッファー1mLを添加します。400 x g で4°Cで5分間スピンダウンします。
10. 上清を吸引します。180 μLのフローサイトメトリーバッファーを添加します。
11. 生死弁別用に20 μLのSYTOX Blue Dead Cell Stain(最終濃度1:1000)を加えます。
12. フローサイトメーターでサンプルを取得し、フローサイトメーター取得ソフトウェアまたはフローサイトメトリーデータ解析プログラムを使用してデータを解析します。

結果

「ワイルディングマウス」は、通常はSPF施設から除外される微生物を宿している可能性があり、厳しい衛生基準を守る研究機関での畜産慣行に課題を投げかけています。過去4年間にわたり、ベルリンのシャリテ大学とドイツ実験動物保護センター(Bf3R)の科学者と獣医師は、天然のマイクロバイオームを持つマウス専用の施設を開発し、共同研究を通じて厳格な生物学的封じ込め対策を取り入れました(図1)。この設計を実現するために、既存のマウス施設は、エアシャワーや層流キャビンの設置など、大規模な改修が行われました。「ワイルドリングマウス」とSPFマウスを飼育・飼育するエリアは、エアシャワーで分かれており、両エリアには専用の処置室が設置されています。耐熱性材料はオートクレーブを介してのみ「野生マウス」の領域を離れますが、サンプルなどの熱不安定性材料はLAFキャビネットを介してエクスポートし、実験室エリアでさらに処理することができます(図2)。SPFの衛生状態が維持されている地域の汚染を防ぐためには、すべての生物学的封じ込め対策を厳守することが不可欠です(図3)。ベルリンのシャリテ大学にある「Wilding mousee」の施設の設計と生物学的封じ込め対策により、科学者は天然のマイクロバイオームを持つマウスで研究を行う機会を得ることができ、動物施設の衛生レベルが高いエリアへの微生物の拡散を効果的に防ぐことができます。

フローサイトメトリーは、細胞免疫学におけるゴールドスタンダードの方法であり、環境条件の変化に応答して血液や組織中の免疫細胞集団を調べるために使用されます。例えば、成人のヒトは、血液中を循環するメモリーT細胞を相当数有しており、これらは環境からの微生物への曝露により発生する³。ここでは、フローサイトメトリーを使用して、SPF条件下で飼育および飼育されたマウスの血液および「野生マウス」の血液中のメモリーT細胞を調査しました(図4)。天然のマイクロバイオームにコロニーを形成した「野生マウス」は、メモリーT細胞の明確な集団を示します。対照的に、SPF条件下で飼育されたマウスは、血液循環中の記憶T細胞を大幅に減少させました。したがって、フローサイトメトリーは、さまざまな微生物環境が免疫コンパートメントに与える影響を特徴付けることができます。免疫細胞マーカーを追加することで、データの粒状化を増やすことができます。Time-of-Flight(CyTOF)やスペクトルフローサイトメトリーなど、フローサイトメトリーで最近開発されたアプローチにより、多数のパラメータに関する情報を取得でき、その結果、同じ血液および組織サンプルで定量できる免疫細胞(サブ)集団の数を増やすことができます。さらに、細胞サイトカイン産生はフローサイトメトリーによっても評価できるため、天然のマイクロバイオームに応答する細胞の機能に関する洞察を得ることができます。

図 2: Wildling 施設のワークフロー。 採血やサンプル処理はその一例ですが、組織サンプリングや組織学による外科的介入など、他の手順に置き換えることができます。省略形については、 図 1 の凡例を参照してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:SPF地域と野人地域の個人用保護具(PPE)要件の比較。 SPFエリア(左)では、標準的なPPEは1層の防護服で構成されています。対照的に、ワイルドリングエリア(右)では、エアシャワーに入る前に3段階のPPEプロセスが必要です:カサック(保護下着=ステップ1)が全体の下(ステップ2)に着用されます。この追加層は、衛生状態を維持し、エリア間の相互汚染を防ぐのに役立ちます。エアシャワーの後、ワイルドリングエリア用の指定の靴を履く必要があります(ステップ3)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:「野生マウス」の免疫表現型。 14週齢の雄SPFマウス(n=5マウスおよび「ワイルディングマウス」(n=5マウス))の血液サンプルを、CD45、TCR β鎖、CD4、CD8、CD44、およびCD62Lに対する蛍光色素標識抗体のカクテルで染色した。数値は、親ゲート±標準偏差の比率です。ゲーティング戦略は、SPFマウスと「Wildlingマウス」の最後の2つのブロットを除いて、SPFマウスに示されています。「野生マウス」では、SPF条件下で飼育および維持されたマウスと比較して、中枢およびエフェクターメモリーT細胞が増加します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

天然のマイクロバイオームを持つマウスは、人間の超生物^3,9,10,11,12により類似しているため、基礎科学および応用科学の有望な研究ツールです。生物学的な複雑さをマウスモデルに組み込む試みは、さまざまなアプローチの開発につながり、それぞれに独自の利点と制限があります3,7,8,9,10,11,12。「野生マウス」は、制御された実験室環境の利点と自然のマイクロバイオームを兼ね備えています。このアプローチは、複雑な生物学的相互作用の研究に必要な天然の微生物の多様性を維持しながら、実験条件での安定性を維持します。その結果、「野生マウス」で開発およびテストされた生物医学的治療法は、臨床応用への応用を成功させる大きな可能性を秘めています。

しかし、どの前臨床疾患モデル「野生型マウス」がSPFマウスよりも優れているかはまだ判断する必要があります。さらに、天然のマイクロバイオームを持つマウスには、感染力の高い寄生虫などの微生物が潜んでおり、通常は施設施設から除外されています。したがって、これらのマウスの繁殖と研究は、研究機関内の畜産慣行に課題をもたらします。

「野性ネズミ」のための施設の設立には、シャリテ大学、ドイツ実験動物保護センター(Bf3R)、エアランゲン・ニュルンベルク自由主義大学(FAU)の科学者、獣医師、機関職員の協力による取り組みが行われた。施設コンセプトの開発後、既存のマウス施設は、厳格な生物学的封じ込め対策を組み込むために大規模な再建を受けました。この施設は、ヒト病原体を用いた研究に関するバイオセーフティレベル2(BSL-2)の運用に認定されています。

ここでは、「野生マウス」の施設内での手術手順と生物学的封じ込め手順について、フローサイトメトリーによる免疫表現型検査のための採血を例に説明します。「野人ネズミ」の施設で働く間は、動物施設の他のエリアへの微生物の拡散を防ぐために、生物学的封じ込め措置を厳守することが義務付けられています。これには、研究グループごとに施設へのアクセスをできるだけ少ない人に制限することが含まれます。さらに、施設に最初にアクセスする前に、施設の動物福祉担当官が実施する必須の紹介セッションが必要です。ワイルドリング施設内で働くための一般的な情報と標準作業手順書(SOP)は、内部ウェブサイト(「ワイルドリングウィキ」)^14,15でも入手できます。

施設内で作業する際は、PPEを適切に着用する必要があります。例えば、毛髪ネットの外側に髪の毛が露出しないようにすることが大切です。これは、寄生虫の卵が毛ネットに付着する可能性があるためです。実験に「野人マウス」とSPFマウスの両方が含まれる場合は、SPFマウスを最初に処理する必要があります。施設内の「野人マウス」とSPFマウスのエリアはエアシャワーで仕切られており、各エリアには専用の処置室が設置されています。これらの部屋はオンライン予約システムを通じて予約できるため、スムーズな作業プロセスと施設内の限られた人数が保証されます。処置室(PR1、PR2、LAF)ごとにエリアごとに最大2人まで、各バリアで同時に作業することができます。ただし、手順の倫理的かつ熟練した実行を確保するために追加の人員を必要とする実験には例外が適用されます。マウスは、微生物の封じ込めと作業の安全性を確保するために、層流ベンチの下でのみ開くことができる密閉されたIVCケージ内のそれぞれのエリア内の部屋間を移動します。「Wilding mice」エリアの処置室には、層流(LAF)キャビンもあります。このLAFキャビンは、胚移植を含む「野生マウス」の解剖と手術に使用する必要があります。胚移植は、「Wilding mouse」の文脈では重要な手順であり、新しい「Wildlingマウス」モデルを生成するために使用されます。例えば、遺伝子組み換え(GMO)マウス系統の胚を野生型の「ワイルディングマウス」に移すと、野生型GMO系統が作製されます。LAFキャビンは、サンプルの輸出にも使用されますが、これには「ワイルドリングマウス」エリア外の人との調整が必要です。隣接する実験室スペースでさらなるサンプル処理を行うことができるため、研究者は「野生マウス」のサンプルを処理する場所を制限しながら、時間的制約のある材料を現場で取り扱うことができます。

他のすべての材料は、ワイルドリング施設内に残しておくか、施設を出る前にオートクレーブ滅菌する必要があります。作業後は、BSL2の状態に適した消毒剤ですべての材料と表面を消毒します。「野人ネズミ」で施設に入所した人は、同日、他の動物施設への入館は禁止されています。

施設での研究は、科学コンソーシアム「The Wildling Mouse Model in Health and Disease(Wildling HeaD)」の枠組みの下で行われ、「Wildling Mouse」を扱う科学者間のコミュニケーションを促進し、方法と専門知識の交換を促進します。このコンソーシアムは、ベルリン衛生研究所(BIH)のQUEST責任ある研究センターのResponsible PrecliniXの支援を受けており、動物研究の事前登録手続き、堅牢な実験デザイン、品質管理(www.bihealth.org/en/quest/service/service/responsible-preclinix)を支援しています。

要約すると、安全で倫理的な前臨床研究をサポートするために、厳格な生物学的封じ込め対策を備えた最先端の施設が設立されました。この施設は、天然のマイクロバイオームを持つ「野生マウス」の研究を促進し、制御された実験室条件と現実世界の微生物環境との間のギャップを効果的に埋めます。このような施設を建設するためには、科学者、獣医師、機関職員の専門知識を取り入れて、高度な生物学的封じ込め環境を効果的に設計し運用するために、チームサイエンスと学際的な協力を優先することが不可欠です。さらに、厳格な生物学的封じ込め対策の実施、包括的なトレーニングの提供、明確な標準作業手順書(SOP)の策定が重要です。社内Wikiなどの効率的なコミュニケーション構造を確立し、実験条件を継続的に監視・検証することで、「野人マウス」のような複雑なモデルを管理する施設の有効性と安全性がさらに向上します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Alexa Fluor 700 抗マウス CD45 抗体	BioLegend	103127	クローン 30F-11
アニマル チョウ	アルトロミン	1324
APC 抗マウス CD4 抗体	BioLegend	100515	クローン RM4-5
採血管	Greiner	450475	MiniCollect K3E, K3EDTA
ウシ血清 アルブミン	Sigma-Aldrich	A9647-100G
Brilliant Violet 605 抗マウス TCR-β 鎖抗体	BioLegend	109241	Clone H57-597
Brilliant Violet 785 抗マウス CD8 抗体	BioLegend		100749 Clone 53-6.7
Capillary	Hirschmann	9000210	Hirschmann minicaps, Na-hep
EDTA	Corning	46-034-CI
FITC 抗マウス CD44 抗体	BioLegend	103021	クローン IM7
PerCP/Cyanine5.5 抗マウス CD62L 抗体	BioLegend	104431	クローン MEL-14
リン酸緩衝生理食塩水 (10x)	Gibco	12579099
リン酸緩衝生理食塩水 (1x)	Gibco	14190094
RBC 溶解緩衝液	BioLegend	420302
丸底ポリスチレンチューブ	Sarstedt	55.476.005
SYTOX Blue Dead Cell Stain	Invitrogen	S34852
Tyvek overall (デュポン)	Fisher Scientific	11371633