方法論記事

共焦点走査型レーザー検眼鏡法によるアデノ随伴ウイルス血清型を用いた網膜細胞の縦断的In vivoイメージング

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DOI:

10.3791/67106

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2024年10月11日

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1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, 2Second Clinical Medical School, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Brain Disorders, Collaborative Innovation Center for Brain Disorders, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Fundamental Research on Biomechanics in Clinical Application, Capital Medical University

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、細胞特異的標識および共焦点走査型レーザー検眼鏡(CSLO)を使用した in vivo イメージングのためのアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの使用について説明します。この方法により、さまざまな網膜細胞タイプと、それらが網膜機能および疾患に寄与しているかどうかを調べることができます。

要約

網膜細胞プロセスのダイナミックな性質は、眼疾患の理解と治療を強化するために、遺伝子送達とライブモニタリング技術の進歩を必要としています。この研究では、特定の血清型とプロモーターを利用して、網膜神経節細胞(RGC)やミュラーグリアなどの標的網膜細胞で最適なトランスフェクション効率を達成する、最適化されたアデノ随伴ウイルス(AAV)アプローチを紹介します。この研究では、共焦点走査型レーザー検眼鏡(CSLO)の精度を活用して、AAV媒介性緑色蛍光タンパク質(GFP)の縦方向の発現を捕捉する in vivo イメージングの非侵襲的方法を提示します。このアプローチにより、終末的な手順が不要になり、観察の連続性と被験者の幸福が維持されます。さらに、GFPシグナルは、AAVに感染したRGCにおいて、上丘(SC)および外側膝状核(LGN)への視覚経路に沿って追跡することができ、直接的な視覚経路マッピングの可能性を可能にします。これらの知見は、詳細なプロトコルを提供し、網膜細胞の挙動、疾患の病因、および遺伝子治療介入の有効性のリアルタイム研究に対するこの強力なツールの適用を実証し、生きた網膜とその接続に関する貴重な洞察を提供します。

概要

網膜は、中枢神経系の中で唯一光学的にアクセス可能な部分であり、神経科学研究の貴重なモデルとして機能しています1。網膜神経節細胞(RGC)は、視覚情報を脳に伝達する網膜の出力ニューロンであり、視覚機能において重要な役割を果たしています。それらの喪失または機能障害は、緑内障やその他の視神経障害に見られるように、視力障害や不可逆的な失明につながります2。網膜の主要なグリア細胞であるミュラーグリアは、網膜の恒常性を維持し、ニューロンに構造的および代謝的なサポートを提供し、神経伝達物質のレベルを調節し、網膜の修復と再生に貢献するために不可欠です3。その機能不全は、糖尿病性網膜症4、加齢性黄斑変性症5、眼虚血症候群6など、さまざまな網膜疾患に関与しています。RGCとミュラーグリアは密接な相互作用と相互依存性を示します。ミュラーグリアはRGCに不可欠なサポートを提供しますが、RGC活性はミュラーグリア機能に影響を与える可能性があります3,7。RGCとミュラーグリアの両方を研究することは、網膜機能を理解し、複数の網膜疾患に対する効果的な治療法を開発するために重要です。

網膜研究における現在の評価は、主に光干渉断層撮影法(OCT)のような技術を利用して、網膜神経線維層の厚さまたは軸索束の軌跡を測定する8,9。これらの方法はRGC損失の検出に非常に役立ちますが、分解能が限られているため、RGCの形態とグリア細胞の詳細なビューは提供されません。同様に、補償光学走査型レーザー検眼鏡検査(AO-SLO)のような高度な技術により、生きているヒト網膜のRGC、光受容体、およびグリア細胞の細胞レベルのイメージングが可能になります10が、その技術的な複雑さとアクセスのしやすさの制限により、その使用は主に専門的な研究環境に限定されています。これらの制約を考慮すると、in vivo で特定の網膜細胞集団を詳細に研究するための、よりアクセスしやすく信頼性の高い方法の開発が継続的に必要とされています。

したがって、このプロトコルは、網膜細胞の研究アプリケーションに適した代替イメージングアプローチを導入することを目的としています。AAVを介した細胞型特異的標識の能力と、CSLOイメージングの非侵襲性を兼ね備えています。アデノ随伴ウイルス(AAV)は、免疫原性が低く、分裂細胞と非分裂細胞の両方を含む幅広い細胞タイプに形質導入できることで知られる汎用性の高い遺伝子導入ベクターです11。これにより、複雑な網膜環境内の特定の細胞集団を標的とするための理想的なツールになります。慎重に選択された血清型とプロモーターを持つAAVベクターを利用することで、RGCやMüllerグリアなどの複数の目的の細胞タイプで蛍光タンパク質の選択的発現を達成できます。例えば、AAV2はRGC12,13における高い形質導入効率で知られており、一方、AAV8は光受容体14を標的とするのに著しく効果的であり、AAV9はミュラーグリア15において強力なトランスフェクション能力を示し、さまざまな網膜細胞層にわたって広範な効率を示す。AAVの有効性は、血清型の選択だけでなく、導入遺伝子発現の強度と細胞特異性を決定するプロモーターにも依存することに注意することが重要です。これは、最適な形質導入を達成するための慎重な選択の重要性を強調しています。

RGC標識の場合、このプロトコルはAAV2とヒトシナプシン(hSyn)プロモーターを使用します。AAV2は、硝子体内注射13後にRGCの効率的な形質導入を示し、遍在するニューロンプロモーターであるhSynプロモーターは、これらの細胞内で強力かつ特異的な導入遺伝子発現を促進する16。Müllerグリアの場合、プロトコルはGfaABC1Dプロモーター17によって駆動されるAAV9ベクターを利用し、これらの細胞15で強力な導入遺伝子発現を示す。この標的標識アプローチにより、研究者はこれらの細胞を周囲の網膜組織と区別し、経時的に追跡することができ、網膜細胞の 生体 内監視と生体環境変化に対する細胞応答の基礎となります。

共焦点走査型レーザー検眼鏡検査(CSLO)は、生きている網膜の高解像度画像を提供する非侵襲的なイメージング技術であり、蛍光標識された網膜細胞集団18,19,20のリアルタイム可視化を可能にする。集束レーザービームが網膜を横切ってスキャンし、ピンホールを通過する放出された光を捕らえてピントが合っていない信号を排除し、コントラストを高めた鮮明な画像を実現します。このプロトコルは、トランスジェニック標識RGCs21,22およびミクログリア23を視覚化する研究を含む、生きた動物の網膜細胞イメージングに広く使用されているHeidelberg Spectralis CSLOシステムを利用しています。488 nmレーザーと適切なフィルターを備えたHRA CSLOユニットを使用することで、研究者は蛍光レポーター遺伝子を持つAAVベクターの硝子体内注射後に、生きた動物の蛍光標識RGCまたはミュラーグリアをイメージングできます。縦断的イメージングプロトコルは、中心網膜と末梢網膜の両方をカバーする毎週のセッションで、経時的な変化を追跡します。動物福祉を優先するために、このプロトコルはHRA CSLOユニットの自動視線追跡システム(ART)を利用し、全身麻酔やコンタクトレンズを必要とせずに正確な画像取得を可能にします。

このプロトコルは、AAVとCSLOの組み合わせたパワーを利用して、 in vivoでの特定の網膜細胞タイプの縦断的モニタリングを可能にします。AAVを介した標識の細胞型特異性とCSLOの非侵襲的で高解像度のイメージング機能を組み合わせることで、研究者はさまざまな刺激や介入に応答したRGCとミュラーグリアの動的変化を研究することができます。これらの洞察は、網膜疾患の新しい診断および治療戦略の開発に情報を提供するための大きな可能性を秘めています。

プロトコル

すべての実験は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って実施され、北京の首都医科大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。4週齢の成体雄C57BL/6Jマウス(体重15〜20g)をすべての実験に使用し、12/12時間の明暗サイクルの温度制御された部屋に収容しました。標準的なげっ歯類の餌と水は 自由に利用できました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. AAVを介した網膜細胞トランスフェクション

注:RGCの標的形質導入のために、このプロトコルはAAV2-hSyn-eGFPを使用します。これは、hSynプロモーターを組み込んで、強化されたGFPの強力な発現を促進します。ミュラーグリアは、AAV9-GfaABC1D-eGFPを使用して標的化されます。最適な形質導入効率と堅牢な導入遺伝子発現を達成するために、マウス13の硝子体内注射には、最小AAV力価1 x 1012ウイルスゲノム(vg)/mLが推奨されます。

  1. AAVを介した網膜細胞トランスフェクション手順を実施する際には、偶発的な曝露を防ぎ、安全な作業環境を確保するために、厳格な安全プロトコルを順守してください。
  2. ウイルスベクターに関連するすべての手順は、認定されたバイオセーフティキャビネット(BSC)内で実行します。手順の期間中、白衣、手袋、目の保護具などの適切な個人用保護具(PPE)を人員に装備します。
  3. すべての鋭利物とバイオハザード材料は、コンプライアンスを維持し、すべての実験室の人員を保護するために、機関の安全プロトコルに従って適切に廃棄してください。

2. ウイルスベクターおよび動物の調製

  1. -80°Cで保存したAAV2-hSyn-eGFPまたはAAV9-GfaABC1D-eGFPベクターを取得します。 ウイルスの完全性を維持するために、使用直前にベクターを氷上で解凍してください。
  2. ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射でマウスを麻酔します 50 mg / kgの投与量。.麻酔の深さを確認するには、その後の行動の前に後足の反射神経をテストします。
  3. 処置中の手術領域との干渉を防ぐために、ひげをトリミングします。眼窩を20%ポビドンヨード溶液で2秒間消毒し、滅菌生理食塩水で十分にすすいでください。
  4. 不快感を最小限に抑え、不随意の眼球運動を防ぐために、0.5%プロパラカインの滴を局所的に塗布します。.

3. ウイルスベクターの取り扱いと硝子体内注射

  1. 選択したAAV溶液(AAV2-hSyn-eGFPまたはAAV9-GfaABC1D-eGFP)1 μLを、事前に冷却した清潔なパラフィンフィルムに移し、ウイルス活性に影響を与える可能性のある温度変動を回避します。
  2. Hamilton ガラスシリンジと 33 G の斜角針を眼科用手術用顕微鏡で使用して AAV 溶液を吸引します。
  3. 顕微鏡下でマウスを腹側横臥位に置きます。頭を少し傾けて、注射する眼側を持ち上げます。.顕微鏡の倍率を調整および最適化して、マウスの軌道の優れた領域を明確に識別します。
  4. 針を眼の上強膜縁の輪部の後方1〜2mmに硝子体腔に挿入します。逆流や圧力による損傷を避けるために、AAV溶液をゆっくりと注入します。
    注:注射部位の位置:眼の上側頭象限、輪部の約1mm後方で注射を行います。主要な血管を避け、レンズの損傷のリスクを最小限に抑えるために、この場所を選択してください。虹彩の浸透やレンズの摩耗を防ぐために、注射部位がリンバスに近すぎるのは避けてください。血管系の回避:手術用顕微鏡を使用して、注射前に計画された注射部位に見える血管がないか慎重に調べます。船舶が存在する場合は、侵入口を少し調整して回避してください。虹彩と平行な浅い角度で針を挿入して、血管損傷のリスクをさらに減らします。網膜下出血のリスクを減らすために、同じ領域に繰り返し注射することを避けてください。.
  5. 針を30秒間所定の位置に保ち、ベクターが硝子体チャンバー内に分散して網膜表面に落ち着くようにすることで、形質導入が成功する可能性を最大限に高めます。
  6. 硝子体の逆流のリスクを最小限に抑えるために、針をゆっくりと引き抜きます。
  7. 注射直後に局所抗生物質軟膏を注射部位に塗布します。.軟膏が眼の表面を完全に覆うように均一に塗布され、眼の感染や炎症を防ぐことを確認してください。
    注:抗生物質軟膏には、1 mg / gのデキサメタゾン、3500 IU / gのネオマイシン硫酸塩、および6000 IU / gのポリミキシンB硫酸塩が含まれています。.
  8. マウスを温熱パッドに置き、麻酔からの回復中に体温を維持し、苦痛や異常の兆候がないか注意深く監視します。完全に回復し、合併症が見られなくなったら、通常の餌と水にアクセスできるケージに戻します。

4. CSLOによる in vivo イメージング

  1. 動物の調理法
    1. 硝子体内注射の4週間後に、AAV2-hSyn-eGFPまたはAAV9-GfaABC1D-eGFPに感染したマウスを選択します。0.5%のトロピカミドと0.5%のフェニレフリンを含む眼液を眼球表面に1滴塗布して、瞳孔を直径約2mmに拡張します22。
      注: 硝子体内注射13 後の最適な網膜細胞蛍光標識には、最低 4 週間の AAV 形質導入時間間隔が推奨されます。さらに、視神経クラッシュ (ONC) 実験では、網膜は感染後 4 週間、およびクラッシュ損傷後の 7 日目と 14 日目に画像化されました。これらの時点は、初期の AAV 発現と ONC 後の網膜変化の進行の両方を捉えるために選択されました。
    2. イメージングプラットフォームをクリーンパッドの一部で覆い、手術プロセス中に動物の排泄物が汚染される可能性を回避します。
      注:カスタムメイドのイメージングプラットフォームは、動物がうつ伏せになるのに十分なスペースを提供し、安定性を確保し、手動拘束中の動きを最小限に抑えて最適な画像取得を実現します。
    3. マウスをイメージングプラットフォームに慎重に移し、イメージング前に2〜5分の順応期間を設けて、ストレスを最小限に抑え、イメージング環境への適応を促進します。
    4. 2人目の技術者の助けを借りて、処置中ずっと意識状態を維持しながら動物を優しく拘束します。15 秒のイメージング後、10 秒の休息間隔を設けて、まばたきを可能にし、角膜の水分を維持します。
      注意: 頭皮の皮膚をやさしくこすって、まぶたが自然に持ち上げられるようにし、まぶたの強制的な拘束やクリップなどの追加のデバイスの使用を避けて、目の怪我のリスクを減らします。全身麻酔は、一時的なレンズの不透明度を悪化させる可能性があるため、長時間のイメージングセッション中に光学的透明度を維持するためには使用されません。高品質な画像取得と動物の快適性と安全性のバランスを取って、施術全体を通して行います。動物の健康を確保し、イメージング品質を維持するために、5分以内にすべての手順を完了してください。
    5. フォーカスノブ(図1B)とマイクロマニピュレータ(図1C)を微調整して、頭部の姿勢を調整し、カメラのレンズを位置合わせして、その後の in vivo イメージングの関心領域(ROI)を狙います。
  2. システム構成
    1. カメラに非接触の55°広角レンズを取り付けて、眼底領域の視野を広げます。
    2. フィルターホイールを位置 A (血管造影)に設定すると、赤外線(IR)および蛍光血管造影(FA)イメージングモードの取得が可能になります(図1A)。レーザーと電源をオンにして、CSLOイメージングシステムをアクティブにします。
    3. ソフトウェア Heidelberg Eye Explorer を開き、メニューバーの上部にある 新しい患者の アイコンをクリックして新しい検査を作成します。関連する動物情報を入力し、ポップアップウィンドウでデフォルトの角膜湾曲である7.7mmを受け入れます。
    4. コントロールパネル画面の黄色の [スタート ]ボタン(図1E)を選択して、ライブイメージングモードを開始します。
  3. In vivo CSLOイメージング
    1. コントロールパネルで、励起波長820nmで自家蛍光を発する IR モード(図1G)を選択します。高解像度のイメージングを実現するために、 高解像度。 (HR)モードは、ウィンドウインターフェースまたは手動コントロールパネル(図1F)を介してアクティブになります。
      注:赤外線反射率(IR)イメージングは、通常、フルオレセイン血管造影(FA)の前に取得されるCLSO眼科イメージングの最初のステップであり、ベースラインビューを提供します。均一な照明、最小限のアーチファクト、主要な網膜血管へのシャープなピントは、z平面フォーカシングの信頼性と高品質のIR画像の実現にとって重要です。
    2. XYZマイクロマニピュレーター付きのジョイスティックでレンズをマウスの目に向けて動かし、微調整を行います。光学的透明度を調べ、感度つまみ(図1D)を反時計回りに回して眼底画像の明るさを40%〜60%に下げ、眼底の露出過多を回避し、網膜の細部の視覚化を強化します。
    3. 視神経乳頭と網膜血管が眼底上で明確に識別されるまで、フォーカスノブとマイクロマニピュレーターを調整します。
      注:最適な焦点面の基準:(1)暗いコーナーのない均一に照らされた眼底ビュー。(2)視神経乳頭を囲む均一な照明で、焦点の暗い斑点や歪みがありません。(3)大きな網膜血管の明確な内腔形状と目に見える血流の動き。
    4. 励起波長488nmの固体青色レーザーと500nmのバリアフィルターを使用して FA モード(図1H)に切り替えます。感度つまみ(図1D)を時計回りに回して、眼底画像の明るさを50%〜107%に増やし、対象の網膜領域を照らします。
    5. ART平均値(ソフトウェアインターフェースの左下にある青いバー)を15以上に設定して、信号対雑音比を向上させます。この機能は、同じ場所で取得した一連のBスキャンを平均化し、画質を向上させます。
      注:ARTの平均化値が高いほど、一般的に平均化によって画質が向上しますが、スキャン時間も長くなります。この長時間の延長は、角膜の脱水症や動物の疲労のリスクを高める可能性があり、特に覚醒状態の動物の画像撮影では、慎重に検討する必要がある要因です。
    6. 網膜の内面に再整列し、特にRGCを発現するGFPまたはミュラーグリア細胞を標的とします。RGC体細胞や軸索、またはミュラー細胞体などの目的の細胞集団を鮮明に照らすために、微調整が行われます。イメージング感度は、最適な視覚化を実現し、GFP陽性細胞の過飽和を防ぐためにバランスが取れています。
      注:GFP信号と同等の鮮明さと明るさで画像を取得するには、実験に参加したすべてのマウスで感度取得を一定にする必要があります。
    7. 感度ノブ(図1D)を押し下げてARTモードを開始し、ライブ平均画像をオンラインで生成します。ソフトウェアインターフェースの左下にある青いバー(ART Mean値を表す)が設定されたART値(≥ 20フレーム)に達するまで待ち、コントロールインターフェースのAcquireボタンをタップして眼底画像をキャプチャします。
      注:ARTモードの場合、 in vivo イメージング中の軽微な眼球運動を自動的に補正するためにアイトラッキングが組み込まれており、選択した網膜焦点面に一貫して焦点を合わせることができます。
    8. 目的の画像を取得したら、タッチパネルの 感度 つまみを押してARTモードを終了します。
      注:角膜の乾燥を防ぎ、自発的なまばたきを可能にするために、イメージングプロセス中に15秒ごとに10秒の休憩が実装されました。
    9. 鼻と側頭の網膜領域を移動するには、画面上のライブ画像を観察しながらカメラヘッドを水平に動かします。ターゲット領域に到達したら、ピントを微調整し、手順2.3.1-2.3.8の説明に従ってイメージングプロセスを開始します。
      注意: 眼底の一貫した明るい照明を確保しながら、ゆっくりと制御されたカメラの動きを維持します。暗い部分が現れた場合は、マイクロマニピュレーターを使用してカメラの位置を垂直に調整し、網膜を中央に再配置します。
    10. 上網膜を画像化するには、マウスの頭の姿勢をゆっくりと上向きの位置に調整します。カメラヘッドを適度に上に傾けて、上網膜領域に合わせます。必要に応じてピントを合わせ直し、撮影を進めてください。
    11. イメージングが完了すると、必要なすべての網膜領域が取得ウィンドウを終了し、画像が自動的に保存されます。角膜の水分補給を維持するために、画像化された目に局所潤滑剤を塗布します。
    12. 対側の目の検査を開始するには、動物をプラットフォームの反対側に再配置し、手順2.3.1-2.3.11を繰り返します。

5. 画像処理・解析

  1. 画像のエクスポートと準備
    1. Heidelberg Eye Explorerソフトウェアを開き、目的のCSLOイメージングセッションを高品質で選択します。同じ網膜位置の単一または連続した画像を選択し、時間の経過とともに一貫した感度設定を行います。
    2. ピントが合っていない画像や角膜の明瞭さがはっきりしないぼやけた画像を除外し、網膜構造が鮮明に視覚化された画像のみが分析に使用されるようにします。これらの画像をTIFF形式でエクスポートして、さらに処理します。
  2. 画像の配置とトリミング
    1. 同じ網膜領域に基づいてマウスの眼ごとに画像をグループ化します。
      注:CSLOシステムから取得した元の画像は、TIFF形式で保存され、寸法は1536 x 1536ピクセル、解像度は5.69 um /ピクセル、ART値は≥15です。
    2. フォローアップ検査のために、適切な画像処理ソフトウェアに画像をインポートします。ベースライン画像の向きに一致するように、必要に応じて画像を回転および整列します。処理された画像を保存またはエクスポートするときは、圧縮アーティファクトの可能性を最小限に抑えるために、可能な限り最高の画質を維持する設定を使用してください。
    3. 同じ眼の時系列からCSLO画像を回転させて、血管系と視神経乳頭をランドマークとして使用して、それぞれのベースライン画像と一致するように位置合わせします。
      注:各整列した画像を慎重に調べ、トリミングに進む前に、次の基準を満たしていることを確認してください:(1)完全な網膜領域のキャプチャ:画像は、視神経乳頭や主要な血管などの主要なランドマークを含む、目的の網膜領域を完全に網羅する必要があります。(2)モーションアーティファクトの欠如:画像は、イメージング中の眼球運動によって引き起こされる構造のぼやけ、縞模様、または重複があってはなりません。(3)歪みを最小限に抑える:画像は、イメージング角度やレンズ効果から生じる可能性のある反り、伸び、または圧縮アーティファクトなしに、網膜構造を正確に表現する必要があります。(4)画質指標のバランス:バックグラウンドノイズレベルの評価(構造物のないエリアのピクセル強度の標準偏差<5(0〜255スケール))。信号対雑音比(SNR>20)、照明の一貫性(6つの画像象限間の変動係数<10%)、および画像の均一性(均質領域の変動係数<15%)。
    4. 回転した画像を選択し、TIFF形式でエクスポートします。各時点について、トリミングツールを使用して、品質が承認された画像からGFP陽性セルを含む5〜10個の領域(各300 x 300ピクセル)をランダムに選択してトリミングします。トリミングされた各画像をTIFF形式で個別にエクスポートして、さらに分析します。
  3. 蛍光強度測定
    1. 切り抜いたCSLO画像(8ビットグレースケール、300 x 300ピクセル)をImageJ/Fijiで開きます。
    2. 蛍光シグナルの全体的な変化を調べるには、 Analyze > Measure (または Ctrl + M)を使用して、クロップされた画像あたりの総蛍光強度を測定します。トリミングされた画像全体の平均GFP蛍光強度を表す「平均」値を記録します。
  4. RGC定量化
    1. ImageJ/Fijiでは、 Image > Adjust > Brightness/Contrast を使用して、トリミングされたCSLO画像の強度しきい値を調整し、黒い背景に対して個々の白い体細胞の最適な視覚化を実現します。
      注:トリミングされた画像のバッチを確認した後、個別のしきい値を決定するか、一貫したしきい値アルゴリズム(ImageJ / FijiのHuangの方法5 など)を適用します。Huangの方法の場合:(1)画像を8ビットグレースケールに変換します(Image > Type > 8ビット)。(2)しきい値化ツールにアクセスします(画像>>しきい値の調整)。(3) しきい値処理方法として Huang を選択します。(4) セグメンテーションをプレビューし、「 適用」をクリックします。しきい値は自動的に計算され、画像のヒストグラムに表示されます。
    2. Cell Counterプラグインをアクティブにし、各GFP陽性RGC体をクリックしてカウントします。分析された領域でマークされたセルの総数を記録します。このプロセスを、各フォローアップ時点から切り抜いたすべての画像に対して繰り返します。
  5. データ分析
    1. 細胞数と蛍光強度のデータをスプレッドシートまたは統計ソフトウェア(GraphPad Prismなど)にエクスポートします。
    2. 対応する実験計画と仮説に基づいて適切な統計的検定を実行します。結果を解釈して結論を出します。

結果

提示されたプロトコルに従って、AAV媒介遺伝子送達とCSLOの組み合わせを使用して、さまざまな網膜細胞をin vivoで成功裏に視覚化および追跡しました。AAV2-hSyn-eGFPは、CSLOおよびRGC特異的マーカーであるRNA Binding Protein with Multiple Splicing(RBPMS)との共局在を確認したように、RGCを効果的に形質導入し、網膜全体に強力なeGFP発現をもたらしました。これは、神経節細胞層に特異的に見られます(図2および図3)。このプロトコルでは、AAV9-GfaABC1D-eGFPを使用してミュラーグリアを標的とする能力も確認されました。CSLOの可視化により、特に網膜内側層内でeGFPの広範な発現が明らかになり、ミュラーグリアの既知の主要な分布セグメントと一致していることが明らかになりました。GFPの陽性シグナルは、ミュラーグリアマーカーのグルタミンシンテターゼ(GS)と高度に共局在しており、このアプローチの特異性をさらに確認しています(図2E、F、および図3B)。これらの知見は、AAV支援遺伝子送達がさまざまな網膜細胞型を研究するための多様性を再確認した。ミュラーグリアを標的とする能力を確認するために、AAV9-GfaABC1D-eGFPを使用しました。CSLOイメージングでは、特に網膜内側層内で広範なeGFP発現が明らかになり、ミュラーグリアの既知の分布と一致しています(図2E、F)。この選択的発現パターンは、GFPシグナルとミュラーグリアマーカーであるグルタミンシンテターゼ(GS)との間に観察された高度な共局在によってさらに検証されました(図3B)。

RGCとMüllerグリアの両方に対するウイルスターゲティングアプローチの特異性と効率を定量化するために、GFP蛍光を標準的な細胞型マーカーと比較するための共局在分析を実施しました(図3B、D)。合計6つのマウスの眼を解析した。AAV2-hSyn-GFPを標的とするRGCでは、形質導入効率は64%±3%、形質導入特異性は68%±3%でした。AAV9-GfaABC1D-GFPを標的としたミュラーグリアでは、形質導入効率は58%±2%、形質導入特異性は71%±2%でした。これらの結果は、このAAVを介した遺伝子導入アプローチにより、異なる網膜細胞タイプの選択的標識が可能になることを示しており、網膜の細胞および分子プロセスを研究するための汎用性が強調されています。

網膜細胞摂動の縦断的モニタリングに対するCSLOの適合性を評価するために、AAV2-hSyn-eGFP感染マウスで一過性ONCモデルを実行しました。eGFPシグナルとRGCの数が2週間にわたって徐々に減少していることが観察されました(図4)。RGCの生存率は、CSLO蛍光強度、CSLO画像の in vivo 細胞数、およびRBPMS陽性細胞の ex vivo RGC数の3つの指標で定量化されました。ステップ4で説明した画像処理後、各網膜から少なくとも10の関心領域(ROI)がトリミングされ(合計6眼)、各ROIが同じ網膜位置を含み、各時点で明瞭な細胞シグナルを示すことを確認しました。次に、各時点でクロップされた各ROI内の平均強度を測定することにより、CSLO蛍光強度を定量化しました。 In vivoでは、 細胞数は、各時点で同じクロップROI内の個々のGFP陽性RGCを手動でカウントすることによって取得されました。最後に、RBPMS免疫染色のために網膜を採取し、RBPMS陽性細胞を各網膜の網膜セクターごとに画像化された24の定義領域内でカウントしました。3つのRGC生存指標(CSLO蛍光強度、 in vivo 細胞数、 およびex vivo RBPMS陽性細胞数)とONC後の時間(すべてでp < 0.001、 図4C)との間に有意な負の相関が見られ、進行性のRGC損失と変性を示しました。重要なことに、初期RGC密度または減少率に関して、異なる実験グループ間で有意差は観察されず、ONCモデルとイメージングアプローチに全体的な一貫性があることを示しています。これらの知見は、ONC後のRGC損傷に関する以前の研究と一致しており、RGCの健康状態を監視するための非侵襲的で信頼性の高いツールとしてのこのCSLOベースのプロトコルの有効性を検証しています。

視覚経路内のRGC軸索突起をさらに調査するために、AAV媒介eGFP標識と前向性トレーサーコレラ毒素サブユニットB(CTB)24との組み合わせによる二重標識アプローチが使用されました。マウスはCTBの硝子体内注射を受け、2日後に組織学的分析のために犠牲にされました。視神経におけるeGFP信号とCTB信号の共局在により、RGC軸索の陽性トレースが確認されました(図5A)。軸索損傷後の信号の変化をさらに研究するために、マウスに急性RGC損傷のモデルである片側視神経潰傷(ONC)を投与した25。簡単に説明すると、マウスに麻酔をかけ、1つの視神経を露出させ、細い鉗子を使用して地球の約1mm後ろで5秒間押しつぶし、重大なRGC軸索切開術とその後の変性を誘発しました。ONC損傷後、eGFPとCTBの両方の強度の顕著な減少が観察され、神経線維の大幅な喪失と軸索輸送の混乱が示されました。脳切片をさらに解析したところ、感覚運動統合や眼球運動に関与する中脳構造である上丘(SC)と、視覚情報の主要な視覚野への中継センターである外側膝状核(LGN)へのRGC投射が明らかになった。ONC後、損傷の反対側でGFP強度の低下が明らかになりました(図5B-E)。これらの知見は、RGC軸索変性の研究とin vivoでの投影パターンのマッピングに対するこの方法の有用性を示しており、従来の侵襲的追跡法に代わる可能性のある方法を提供します。

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図1:共焦点走査型レーザー検眼鏡(CSLO)イメージングシステムとライブ網膜イメージング用のコントロールパネルインターフェース (A-D)イメージングシステムコンポーネント:これらの画像は、HRA CSLOデバイスの主要コンポーネントを示しています。(A)フィルターレバーは、赤外線反射率(IR)とフルオレセイン血管造影(FA)の複合イメージングのために「A」の位置に設定されています。(B)フォーカスノブは、対物レンズのファインフォーカスを調整します。(C)マイクロマニピュレータは、複数の自由度(X、Y、Z軸など)と回転を通じて、光ビームの網膜への正確な位置決め、位置合わせ、および照明を可能にします。(D)感度つまみは、検出した光信号の増幅を調整することにより、IR画像とFA画像の両方の明るさを制御します。ノブを押すと、画像の平均化が開始され、複数のフレームが組み合わされてノイズが低減され、信号対雑音比が向上します。(E-H)コントロールパネルインターフェース:スクリーンショットには、ライブ画像の取得と視覚化に使用される設定を含むCSLOコントロールパネルが表示されます。(E) 取得コントロールパネルが開始されます。(F)最適な画質を得るには、高解像度モードをお勧めします。(G)IRイメージング設定が強調表示され、網膜構造と血管を視覚化できます。(H) FAイメージング設定では、シングルポイント蛍光イメージングとマルチポイント蛍光イメージングの両方のオプションが表示され、網膜細胞内の蛍光シグナルを検出することができます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:C57マウスのAAVトランスフェクション後の蛍光標識網膜細胞のin vivo CSLOイメージング。 (A)マウスの眼におけるAAVトランスフェクション後のCSLO支援縦断的イメージングの実験タイムライン。(B)AAV2-hSyn-eGFP発現の4週間後のC57マウス網膜の上領域および中央領域の代表的なCSLO画像。スケールバー:500μm.(C)(B)からの手動でステッチされた網膜モンタージュは、eGFP発現網膜細胞の分布を示しています。スケールバー:500μm.(D)のボックス領域の拡大CSLO画像と、対応する網膜フラットマウントの共焦点顕微鏡画像。eGFP(緑)とRGCマーカーRBPMS(赤)の共局在は、網膜神経節細胞におけるAAVを介した発現を確認します(丸で囲んだ部分の例)。スケールバー:50 μm. (E) AAV9-GfaABC1D-eGFPを注入したC57マウス網膜の4週間後に手動でステッチしたモンタージュで、ミュラーグリア特異的なeGFP発現を示しています。スケールバー:500 μm. (F) (E) のボックス領域の拡大 CSLO 画像と、対応する網膜フラットマウントの共焦点顕微鏡画像。eGFP(緑)とミュラーグリアマーカーのグルタミンシンテターゼ(GS、赤)の共局在は、ミュラーグリア細胞におけるAAVを介した発現を確認します(丸で囲んだ部分の例)。スケールバー:50μmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:マウス網膜におけるAAV媒介遺伝子導入の細胞型特異性。 (A)AAV2-hSyn-eGFP感染の4週間後のC57マウスの網膜切片およびフラットマウントの免疫組織化学。GFP(緑)とRBPMS(赤)の共局在は、RGC特異的な発現を確認しています。スケールバー:50μm.(B)RGCにおけるAAV2-hSyn-GFP形質導入効率と特異性の定量化効率は、網膜フラットマウントでGFPを発現するRBPMS陽性RGCの割合として表されます。特異性は、網膜切片におけるRBPMSに対しても陽性であるGFP陽性細胞の割合として表される(n = 4匹のマウスから6眼)。(C)AAV9-GfaABC1D-eGFP感染の4週間後のC57マウスの網膜切片およびフラットマウントの免疫蛍光染色。GFP(緑)とGS(赤)の共局在は、ミュラーグリア特異的な発現を裏付けています。スケールバー:50 μm. (D) ミュラーグリアにおけるAAV9-GfaABC1D-GFP形質導入効率と特異性の定量。効率は、網膜フラットマウントでGFPも発現するGS陽性ミュラーグリアの割合として表されます。特異性は、網膜切片におけるGSに対しても陽性であるGFP陽性細胞の割合として表される(n = 3匹のマウスから6眼)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:AAV2-hSyn-eGFPマウスにおける急性視神経挫傷(ONC)後のRGC生存率の縦断的CSLOモニタリング (A)AAV感染後の急性視神経損傷の実験タイムラインの概略図。(B)ベースライン時、ONC後7日、および14日後のAAV2-hSyn-eGFPマウスの同じ網膜の縦断的CSLOイメージング、GFPシグナルを発現するRGCの視覚化。右側には、四角形領域の拡大画像と、RGCの形態と分布を示す網膜フラットマウントの代表的な共焦点顕微鏡画像が示されています。スケールバー:100μm.(C)ONC後2週間にわたるRGC生存率の定量化は、ベースライン(平均±SEM)に対する細胞数とCSLO蛍光強度の両方の変化率を測定することによって評価されました。各時点でグループ間で有意差は観察されませんでした(一元配置分散分析)。線形回帰分析により、GFP蛍光(r² = 0.945、 p < 0.001)、RBPMS染色(r² = 0.888、 p < 0.001)、CSLO細胞数(r² = 0.511、 p < 0.001)、およびCSLO蛍光強度(r² = 0.7486、 p < 0.001)に基づいて、損傷後の時間とRGC生存指標との間に有意な負の相関があることが明らかになりました。n = 6マウス/グループ/時点。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:視覚経路に沿ったRGC軸索投影のAAV支援マッピング。 (A)AAV2-hSyn-eGFPマウスからの視神経のペアの代表的な蛍光顕微鏡画像、GFP標識RGC軸索(緑)と前向性軸索トレーサーコレラ毒素B(CTB、マゼンタ)との共局在を示しています。上段のパネルには視神経全体(スケールバー:1000μm)、下段には四角い領域(スケールバー:100μm)を拡大してご覧いただけます。ONC損傷の2週間後、GFP信号とCTB信号の両方が視神経全体(左側)に顕著な減少を示し、RGC軸索の喪失と視覚経路の混乱を示しています。(B)上丘(SC)へのRGC軸索突起。ONCの2週間後にAAV2-hSyn-eGFPマウスの冠状脳切片は、SC内のGFP標識RGC軸索(緑)とCTB染色(マゼンタ)を強調しています。右(右):同側SC(ONC負傷側)。スケールバー:1000 μm. (C) (B) のボックス領域の拡大図は、GFP シグナルと CTB シグナルの共局在を示し (マージされた画像)、SC 内の RGC 軸索束とその投影パターンを強調しています。スケールバー: 100 μm. (D) ONC に続く外側膝状核 (LGN) への RGC 軸索の投影により、LGN 内の GFP 標識 RGC 軸索 (緑) と CTB 染色 (マゼンタ) が明らかになりました。左(L):対側LGN;右(R):同側LGN(ONC損傷側)。スケールバー:1000μm.(E)のボックス領域の拡大図は、LGN内のRGC軸索束とその投影パターンを強調しています。スケールバー:100μmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

提示されたプロトコルは、AAV媒介遺伝子送達とCSLOイメージングの両方の力を利用して、特定の網膜細胞集団の in vivo 監視のための堅牢でアクセス可能な方法を詳述しています。このアプローチは、従来の方法に比べていくつかの利点を提供し、生理学的または病理学的条件下での網膜細胞の動態と損傷や疾患に対するそれらの応答の縦断的研究を容易にします。

この方法の成功は、いくつかの重要なステップにかかっています。まず、最適なAAV形質導入効率を達成することは、標的細胞集団における蛍光レポーターの堅牢かつ特異的な発現にとって極めて重要です。これは、AAV血清型の選択、ウイルス力価、注射技術などの要因によって影響を受ける可能性があります13,15,16。次に、CSLOイメージング中の適切な動物の取り扱いと拘束は、モーションアーチファクトを最小限に抑え、画質を維持するために不可欠です。カスタムメイドのイメージングプラットフォームを採用し、全身麻酔を避けることで、網膜構造の明確で一貫した視覚化を達成することに貢献します。第三に、フォーカス、感度、および平均化設定を含むCSLOイメージングパラメータの慎重な最適化は、ノイズを最小限に抑え、最適な信号対雑音比26で高解像度の画像を得るために必要である。最後に、潜在的な制限に対処し、データの信頼性を確保するために、厳格な画像品質管理対策を実施し、研究デザインで動物数を増やしました。

Spectralis HRA CSLOシステムは、臨床縦断イメージングを強化する自動アイトラッキングを特長としています。その自動リアルタイム(ART)追跡機能は、イメージング中に特定の網膜領域にロックオンし、モーションアーティファクトを減らすことができます。ヒトの臨床イメージングのために、このシステムは、同じ解剖学的網膜位置27の長期追跡のためのアルゴリズムも含んでいる。ただし、これらの技術は、ヒトとげっ歯類の目との間には解剖学的に大きな違いがあるため、げっ歯類の研究には最適化されていません。げっ歯類の目ははるかに小さく(人間の直径24mmに対して直径3〜4mm)、黄斑のような特定のランドマークがないため、自動追跡28に固有の課題があります。その結果、げっ歯類モデルを研究している研究者は、血管パターンや視神経乳頭などの解剖学的ランドマークを使用して特定の網膜領域を特定し、セッション13,22全体で一貫したイメージング面を維持する手動の方法に主に依存しています。このアプローチは、げっ歯類の目のランドマークが限られているだけでなく、実験的操作によって誘発される可能性のある網膜の大幅な変化のためにも必要です。これにより、これらの特定の課題に対して設計されていない自動化システムが混乱する可能性があります。したがって、げっ歯類の網膜イメージングに特化したアイトラッキングおよびアライメントアルゴリズムの開発は、将来の重要な方向性を表しています。特に、長期追跡アルゴリズムを小動物の使用に適応させることで、縦断的研究の精度と再現性を大幅に向上させることができます。

従来の組織学的手法では動物を犠牲にする必要があり、縦断的研究が不可能でしたが、このAAV支援CSLOイメージング法は、in vivoで網膜細胞の動態をモニタリングするための非侵襲的アプローチを提供します。このアプローチは、特にトランスジェニック蛍光タンパク質標識19,21,22,29を利用する動物モデルにおいて、損傷後の特定の網膜細胞の縦方向の変化を追跡するためのcSLOイメージングの有用性を実証した以前の研究に基づいています。これらの研究は、細胞死、生存、さらには移動やプロセス伸長の可能性など、in vivoでさまざまな網膜細胞イベントを視覚化するCSLOの能力を強調しています。このプロトコルは、この技術の適用を特定の網膜細胞集団のAAV媒介形質導入を研究するための拡張であり、網膜内でのAAV送達および導入遺伝子発現の長期的な影響を監視することを可能にし、網膜疾患の進行と治療的介入の有効性に関する重要な洞察を提供します。OCTを使用した現在の臨床評価は、主に網膜神経線維層の厚さ9を測定することによりRGC軸索の喪失に焦点を当てていますが、個々のRGCの形態やグリア細胞の関与を評価するための解像度が不足しています。AO-SLOは、生きているヒト網膜10の細胞レベルのイメージングを可能にしますが、その複雑さと利用可能性が限られているため、主に研究環境での使用が制限されています。さらに、AO-SLO内でグリア細胞型を分化させるには、しばしば追加の標識方法が必要になる30。この方法は、個々のRGCやその他の蛍光標識された網膜細胞集団を経時的に視覚化および追跡するためのより包括的でアクセス可能なアプローチを提供することにより、これらの制限を克服します。これにより、さまざまな条件下での細胞応答を調査する道が開かれ、標的療法の開発に役立ちます。さらに、AAV支援CSLOイメージングとオプトジェネティクス31またはカルシウムイメージング32を組み合わせることで、網膜細胞の機能とその視覚処理、回路発達、および再生における役割についての理解をさらに深めることができます。

このアプローチの強みにもかかわらず、いくつかの制限と潜在的なトラブルシューティングに関する考慮事項を認識する必要があります。AAV形質導入効率にはばらつきが生じる可能性があるため、特定の細胞タイプや実験条件に対して注入パラメータやウイルス力価を最適化する必要があります。CSLOイメージングは、角膜混濁、涙液膜の不安定性、眼球運動などの要因によって影響を受ける可能性があるため、画像取得時には慎重なモニタリングと調整が必要です。さらに、CSLOの浸透深さが限られているため、可視化は内側の網膜層に限定され、光受容体33のようなより深い構造が除外される可能性があります。Spectralis cSLOシステムは、網膜34内の明確な細胞の特徴とパターンを明確に視覚化することを可能にします。このイメージングモダリティは、特定の条件下でのシングルセル観察を容易にすることができますが、まばらに標識されたThy1-YFPマウスの個々のRGCを視覚化した以前の研究で示されたように、高密度に標識されたシナリオで個々の細胞を定量化するための課題を提起する可能性があります。例えば、この研究では、AAV媒介性網膜感染後のRGCのeGFPによる大量標識が、特に発現レベルや細胞の重複にばらつきのある領域では、個々の細胞の明確な可視化を妨げることがあります。この課題は、ミュラーグリアをイメージングする際には、網膜の厚さ35全体に及ぶ細長い形態が、cSLOを使用して単一の焦点面内で単一の細胞を捕捉することを困難にしているため、さらに悪化します。したがって、AAV9を介したミュラーグリア感染効率の評価は、主にCSLOイメージングを使用した全体的な形質導入パターンと分布の評価に依存しています。

さらに、HRAシステムでのART平均化は画質を向上させますが、スキャン時間の増加は、特に覚醒している動物のイメージングでは実用的な制限をもたらします。選択されたART平均値15は、画像品質とスキャン時間のバランスを取り、妥当なスキャン時間を維持しながら十分なノイズリダクションを提供するためです。動物の不快感やストレスを最小限に抑えるためには、イメージング手順を効率を最適化し、覚醒した動物の取り扱いとイメージングに熟練した訓練を受けたスタッフを雇用し、イメージングセッション全体で不快感や角膜の乾燥の兆候がないか動物を熱心に監視する必要があります。これらの対策は、データ品質と動物福祉の両方を確保するために重要であり、覚醒状態の動物モデルで in vivo 網膜イメージングにART平均化を採用する際に、両方の要素を考慮することの重要性を強調しています。

これらの制限と潜在的なばらつきの原因を認識することで、研究者はイメージングプロトコルを最適化し、アーティファクトを最小限に抑え、データの信頼性と再現性を確保するための適切な措置を講じることができます。

全体として、このアクセスしやすく、容易に実装できる方法は、特に損傷や病気に応答して、RGCとミュラーグリアの間の複雑な相互作用を調査するための強力な手段を提供します。このアプローチは、研究者がこれらの動的な相互作用を視覚化および定量化できるようにすることで、網膜の病状の根底にある新しい細胞および分子メカニズムの発見を促進します。これにより、標的を絞った治療戦略の開発と疾患対策の改善に光が当てられます。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(82130029)からの助成金によって支援されました。 図 2A と 図 4A は BioRender.com を使用して作成されました 。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
33ゲージニードルハミルトンコーポレーション、リノ、ネバダ州、米国7803-05硝子体内注射用
0.5%プロパラカイン 参天製薬株式会社局所麻酔薬
AAV2-hSyn-eGFP OBiO Technology Corp., Chinaウイルス力価: 2.7 x 1012 ウイルスゲノム (vg)/mL 
AAV9-GfaABC1D-eGFPWZ Biosciences Inc., Chinaウイルス力価: 4.5 x 1012 ウイルスゲノム (vg)/mL 
ベタジン健康医療会社001651局所消毒薬
角膜鉗子(歯付き)Mingren Eye Instruments、中国MR-F301A硝子体内注射中にまぶたを固定します
Dumont 05#鉗子FST51-AGT5385視神経潰し用
GraphpadプリズムGraphPadプリズム、米国グラフ描画と統計分析
HRA SpectralisHeidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, GermanyCSLOイメージングの「IR」および「FA」モード
Image J/FijiNational Institutes of Health, USA画像処理
Maxitrol antibiotic ointmentAlcon Laboratories, INC. USA0065-0631局所抗生物質
Microliter SyringeHamilton Corp., Reno, NV, USA7633-01硝子体内注射用
Mydrin-P点眼液参天製薬(株)日本瞳孔拡張
眼科用手術用顕微鏡 Leica AG, Heerbrugg, SwitzerlandM220For surgical operations
Pentorbarbitol SodiumSigma Aldrich, USA57-33-0Genereal Aneasthetics
PowerpointMicrosoft Corporation, USAImage alignment and cropping
VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm.Fabrik, ドイツ局所用潤滑剤 

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