エクソソームのローディングとデリバリーのためのマイクロニードルパッチの作製と特性評価

サマリー

エクソソームは大きな臨床的可能性を秘めていますが、 in vivo でのクリアランスが容易で安定性が低いため、その実用化は限られています。マイクロニードルは、生理学的バリアに穴を開け、乾燥状態の保存を行うことで局所的な送達を可能にすることで解決策を提示し、それによってエキソソーム投与の限界に対処し、その臨床的有用性を拡大します。

要約

エクソソームは、新たな「次世代」バイオ医薬品および薬物送達ベクターとして、薬物送達や再生医療から疾患診断や腫瘍免疫療法に至るまで、さまざまな生物医学分野で大きな可能性を秘めています。しかし、従来のボーラス注射による迅速なクリアランスとエクソソームの安定性の低さは、それらの臨床応用を制限します。マイクロニードルは、投与部位におけるエクソソームの滞留時間を延長する溶液として働き、薬物濃度を維持し、持続的な治療効果を促進します。さらに、マイクロニードルは生理活性物質の安定性を維持する能力も持っています。そこで、エクソソームをロードおよび送達するためのマイクロニードルパッチを導入し、エクソソームの単離、作製、エクソソームロードマイクロニードルパッチの特性評価などの方法を共有します。マイクロニードルパッチは、先端材にトレハロースとヒアルロン酸、バッキング材にポリビニルピロリドンを用い、2段階のキャスティング法により作製しました。マイクロニードルは堅牢な機械的強度を示し、先端は2 N.ブタの皮膚に耐えることができ、人間の皮膚をシミュレートするために使用され、マイクロニードルの先端は皮膚穿刺後60秒以内に完全に溶けました。マイクロニードルから放出されたエクソソームは、新鮮なエクソソームと同等の形態、粒子サイズ、マーカータンパク質、および生物学的機能を示し、樹状細胞の取り込みを可能にし、その成熟を促進しました。

概要

エクソソームは、細胞によって細胞外マトリックスに放出される小さな小胞であり、いくつかの疾患やがんの治療のための潜在的なバイオ医薬品および薬物送達ベクターとして提案されています¹。その生合成過程において、エクソソームは、機能性タンパク質や核酸2など、細胞内からさまざまな生物学的に活性な分子をカプセル化^します。その結果、輸送過程でレシピエント細胞に取り込まれると、エクソソームは^{標的細胞の}遺伝子発現や細胞機能を調節する能力を持つ3。一種の天然の情報伝達者として、エキソソームは、組織再生、免疫調節、および送達キャリア⁴として十分に利用されてきた。工学的技術により、特定のリガンドをエクソソームの表面に濃縮し、レシピエント細胞におけるシグナル伝達イベントの誘導または阻害を可能にしたり、特定の細胞タイプを標的としたりすることができます⁵。化学療法剤は、がん治療のためにエクソソームに装填することもできる⁶。さらに、エクソソームは治療用貨物送達のために血液脳関門を通過する能力を有しており、脳疾患の治療に非常に有望である⁷。リポソームと比較して、エクソソームは細胞への取り込みが促進され、生体適合性が向上しています⁸。それらは、他の細胞に効率的に侵入すると同時に、より優れた耐性と低い毒性を示すことができる⁹。しかしながら、エクソソームの伝統的なボーラス注射は、血流中の肝臓、腎臓、および脾臓による隔離および迅速な除去を受けやすい¹⁰。さらに、エクソソームは in vitroでの 安定性が低く、保存条件の影響を受けやすいため、臨床応用が制限されます¹¹。

マイクロニードルは、マイクロメートルサイズの針先の配列であり、低分子薬物¹²、タンパク質¹³、核酸¹⁴、およびナノメディシン¹⁵の送達のための生理学的障壁を貫通する能力を有する。マイクロニードルは、皮膚表面の病変を標的とするように精密に設計されており、その分散した先端は標的部位での均一な薬物分布を確保し、したがってその治療効果を増幅します¹⁶。マイクロニードルの設計と材料組成は、タンパク質や核酸などの生理活性物質の乾燥保存を容易にし、それらの安定性を高めます¹⁷。従来の注射方法は、作用時間が比較的短く、痛みを引き起こし、患者に恐怖を引き起こす可能性があります¹⁸。マイクロメートルサイズの長さのマイクロニードルは、組織の外傷を最小限に抑え、神経刺激を防ぎ、それによって痛みを排除し、患者のコンプライアンスを向上させます¹⁹。さらに、マイクロニードルのユーザーフレンドリーな性質により、患者は専門の人員を必要とせずに治療を自己投与することができる¹⁶。マイクロニードルは、皮膚以外にも、眼部²⁰、口腔粘膜^部21、心臓^部22、血管^部23などの組織にも使用できる。エクソソームの臨床送達のためのマイクロニードルの適用は、有望で前向きな戦略を提供します。

そこで、エキソソームをロードしたマイクロニードル(exo@MN)パッチを導入し、その作製方法を開示する。マイクロニードルパッチは、遠心分離と真空乾燥の2段階のキャスティング法で作製し、マイクロニードル先端でのエクソソームの凝集を促進し、送達効率を高めました。針先と裏地はどちらも、優れた生体適合性と水溶性を示す材料を使用して構築されています。エクソソームを保護するためのチップ材料としてトレハロースとヒアルロン酸(HA)を組み込み、バッキング材料として無水エタノールに溶解したポリビニルピロリドン(PVP)を選択しました。マイクロニードルパッチの形態は、顕微鏡法および走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて特徴付けた。マイクロニードルの機械的試験は、皮膚に浸透する能力を確認するために引張計を使用して評価され、ブタの皮膚への放出率は60秒であると調査されました。さらに、新鮮エクソソームとexo@MN中のエクソソームの両方の形態、サイズ、およびタンパク質含有量を、透過型電子顕微鏡(TEM)、ナノ粒子追跡分析(NTA)、およびウェスタンブロッティング(WB)を使用して特徴付けました。樹状細胞(DC)によるエクソソームの内在化を共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を用いて特徴付け、DCの成熟度をフローサイトメトリーで評価しました。2種類のエクソソームの形態学的特徴と生物学的機能は基本的に一貫しています。

プロトコル

セクション3に記載されている実験に使用された豚の皮膚は、実験動物から供給されたものではなく、市場から食用豚の耳として購入されたため、この研究は倫理的なクリアランスを必要としません。

1. エクソソームの単離

1. 細胞培養
   1. 直径15cmのシャーレに10%のウシ胎児血清と100×のペニシリン-ストレプトマイシン溶液(100)を含むダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)培養培地で、マウス上皮性がん細胞ID8を培養します。
   2. CO2インキュベーター(材料表を参照)でID8細胞を37°C、5%_CO2で細胞密度が90%に達するまでインキュベートします。
2. エクソソームの単離
   1. ペトリ皿から培地を取り出し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で2回洗います。ウシ胎児血清( 材料の表を参照)とペニシリン-ストレプトマイシン溶液( 材料の表を参照)を含まないDMEM20 mLを追加します。.インキュベーションを37°Cおよび5%CO₂ で48時間続けます。
   2. 直径15cmのシャーレ20枚から細胞培養上清を採取します。300 x g で4°Cで10分間遠心分離し、遊離細胞を除去するための上清を回収します。
   3. 2000 x g で10分間4°Cで遠心分離し、細胞の破片を除去するための上清を回収します。
   4. 0.22 μmの使い捨て真空ろ過システム( 材料の表を参照)を循環水真空ポンプ( 材料の表を参照)に接続します。上清が0.22μmのポリエーテルスルホン膜を通過してろ過システムの下部チャンバーに入るように真空を作り、上清から0.22μmを超える小胞または不純物を効果的に除去します。
      1. 真空ポンプを接続するには、ポンプスイッチをオンにしてから、真空ろ過システムの吸気口に接続します。閉じるときは、最初にポンプとの接続を切断してから、真空ポンプをオフにしてください。この手順は、真空ポンプの逆流と培養液の汚染を防ぐのに役立ちます。
   5. 100 kDa限外ろ過チューブのインナーチューブに15 mLの上清を加えます( 材料の表を参照)。3500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、液体をアウターチューブから取り出します。
      注:100 kDaを超える粒子をインナーチューブメンブレンに保持し、100 kDa未満のタンパク質は溶液とともにアウターチューブに遠心分離されます。エクソソームは100 kDaより大きく、内管膜に凝集していました。
   6. 液体の総量が5 mL以内になるまで、上記の手順を繰り返します。インナーチューブから液体を採取し、1mLのDPBSを加えます。ピペットを使用してインナーチューブを繰り返しピペットで固定し、付着したエクソソームがDPBSに再懸濁されていることを確認してから、それらを収集します。
   7. 10000 x g で 4 °C で 60 分間遠心分離し、上清を 6 mL のクイックスナップ遠心チューブに移します( 材料の表を参照)。ヒートシーラーでチューブを密封します。
   8. 超遠心分離機を使用して、100,000 x g で2時間4°Cで遠心分離します( 材料の表を参照)。クイックスナップ遠心分離チューブを切り開き、上清を取り除き、ペレットを100 μLのDPBSに再懸濁します。これがエキソソームソリューションです。
      注:ペレットを再懸濁する過程では、ピペットを使用してチューブ壁を少なくとも200回ピペットで攪拌する必要があります。

2. exo@MNの製作

1. マスターモールドの準備
   1. 高さ1200μm、ベース径400μm、ピッチ(隣接するマイクロニードル間の距離)900μmをパラメータとする円錐形の先端を特徴とするマイクロニードルモデルをCADソフトウェアを使用して構築します。
   2. HTL樹脂を材料として使用し、マイクロニードルのマスターモールドを3Dプリンターでプリントします( 材料表を参照)。
   3. マスターモールドを無水エタノールに1時間浸漬し、表面に付着した樹脂を取り除きます。
   4. 金型を紫外線に5分間さらして硬化させます。
   5. 金型を再び無水エタノールに1時間浸漬し、続いて乾燥オーブンで60°Cで1時間乾燥させます。マスターモールドの準備ができました。
2. 生産金型の準備
   1. ポリジメチルシロキサン(PDMS、 材料表参照)のA成分とB成分を10:1の比率で混合します。よくかき混ぜて、混合物をマスターモールドに注ぎます。
   2. PDMSモールドを1psiの圧力で15分間置き、PDMS混合物から気泡を取り除きます。
   3. PDMS型を60°Cで2時間硬化させた後、型を抜いてマイクロニードルの作製型を得ます。
   4. 生産金型は超純水で洗浄してからご使用ください。
3. 溶液の調製
   1. BCAアッセイキットを使用して、エキソソーム溶液のタンパク質含有量を定量します( 材料表を参照)。エキソソーム溶液の濃度を10 μg/μLにするために、適切な量のDPBSを添加します。
   2. 溶媒としてDPBSを使用して、200 mg/mLトレハロースの溶液( 材料表を参照)を調製します。20分間攪拌して、完全に溶解します。
   3. 200 mg / mLのヒアルロン酸(HA、 材料表を参照)の溶液を調製し、DPBSを溶媒として使用します。一晩攪拌して完全に溶解させます。
   4. 溶媒として無水エタノールを使用して、150 mg / mLポリビニルピロリドン(PVP、 材料表を参照)の溶液を調製します。一晩攪拌して完全に溶解させます。
   5. エキソソーム溶液(10 μg/μL)とトレハロース溶液(200 mg/mL)を1:1の容量比で混合します。次に、等量のHA溶液(200 mg/mL)を加えます。よく混ぜて先端溶液を得ます。
4. exo@MNの製作
   1. PDMSモールドの表面をプラズマクリーナー( 材料表を参照)を使用して低グレードで30秒間処理し、親水性を高めます。
   2. 40 μLのチップ溶液をPDMSモールドに加えます。室温(RT)および3000 x g で3分間遠心分離し、液体が金型の針層に充填されるようにします。
   3. 金型内の余分な液体を取り除き、RTの真空乾燥オーブン( 材料表を参照)で1日間乾燥させます。
   4. 200 μLのPVP溶液をPDMSモールドに加えます。3000 x g をRTで3分間遠心分離し、液体が金型のバッキング層に充填されるようにします。
   5. RTの乾燥炉で1日間金型を乾燥させた後、型を抜いてexo@MNパッチを得ます。
      注意: exo@MNパッチは、使用する準備ができるまで乾燥オーブンに保管してください。

図1:exo@MNパッチの製造プロセス。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. exo@MNパッチの特性評価

1. 形態の観察
   1. パッチの裏地を45°傾斜面に貼り付け、実体顕微鏡の下に置きます( 材料の表を参照)。
   2. イルミネーターをオンにし、4倍の対物レンズを使用してパッチの形態をキャプチャします。
2. 走査型電子顕微鏡(SEM)
   1. 導電性接着剤を使用してパッチをサンプルステージに貼り付け、オートファインコーター( 材料表を参照)で30秒間処理します。
   2. SEM( 材料表を参照)を使用して、加速電圧1kVでexo@MNパッチの画像をキャプチャします。
3. 機械的試験
   1. パッチから3 x 3アレイを切り取り、先端を上に向けて引張計の剛性プラットフォームに置きます( 材料の表を参照)。プローブの高さを調整して、プローブに触れないように針先に近づけます。
   2. 圧力が20Nに達すると自動的に停止するようにパラメータを設定します。針先を0.5mm/minの速度で垂直に圧縮し、荷重と変位のプロファイルを記録します。
4. 解散
   1. 市場から新鮮な豚の耳を購入し、それらを細かく切ります(5 cm x 5 cm x 0.3 cm)。豚の皮をテーブルの上に広げ、紙で表面の水分を乾かします。
   2. 針先が豚の皮膚を下に向けて、各パッチの間隔を少し離して、4つの乾燥マイクロニードルパッチを準備します。親指と人差し指を使って、各マイクロニードルパッチを垂直に押し下げます。15 秒ごとに 1 つのパッチを削除します。
   3. 取り外したパッチをすぐに乾燥オーブンに入れ、5分間乾かします。マイクロニードルチップのカラムを切り取り、顕微鏡下で水平に置き( 材料の表を参照)、4倍の対物レンズを使用してチップの溶解を観察します。

4. exo@MNパッチにおけるエクソソームの特性評価

注:exo@MNのマイクロニードルチップを100μLのDPBS溶液に溶解して、放出されたエキソソームに対して以下の特性評価を行います。

1. 透過型電子顕微鏡(TEM)
   1. 銅メッシュ( 材料表を参照)をイオンクリーナー( 材料表を参照)を使用して親水性処理で5分間処理します。
   2. サンプル10μLを銅メッシュのカーボン側に分注します。1分間放置した後、端から濾紙で液体を吸い取ります。
   3. 3%酢酸ウラニル10μL( 材料表を参照)をサンプルに加えます。10秒間放置した後、端から濾紙で吸い取り、液体を取り除きます。
   4. 3%酢酸ウラニル10μLをサンプルに加えます。1分間放置した後、端から濾紙で液体を吸い取り、RTで風乾します。
   5. 加速電圧80kVのTEM( 材料表を参照)を使用してエクソソームの画像をキャプチャします。
2. ナノ粒子追跡分析(NTA)
   1. エキソソーム溶液をDPBSで希釈して、1 x 10⁷ 粒子/mLの粒子濃度を達成します。1 mLシリンジを使用して、1 mLのエキソソーム溶液をNTAのサンプルチャンバーにゆっくりと注入します( 材料の表を参照)。
   2. 装置の標準操作手順(SOP)タイプをEV-488に設定して、エキソソームのサイズ分布を検出します。
3. ウェスタンブロッティング(WB)
   1. 放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解バッファーであるフェニルメタンスルホニルフルッ化物( 材料表を参照)を100:1の比率で混合して、溶解バッファーを調製します。エクソソームを氷上で20分間溶解し、10分ごとにボルテックスします。
   2. 溶液を12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を採取してタンパク質濃度を測定します。
   3. 5x SDS-PAGEローディングバッファー( 材料表を参照)を上清に1:4の体積比で加え、よく混合します。100°Cで10分間加熱し、タンパク質を変性させます。
   4. 180 kDaの染色済みタンパク質マーカー5 μL( 材料表を参照)と変性サンプル10 μgを4%-20%プレキャストゲル( 材料表を参照)に加えます。電気泳動システム( 材料の表を参照)を60 Vで10分間運転し、次に140 Vで50分間運転します。
   5. タンパク質をゲルから、メタノールで事前に活性化したPVDFメンブレン( 材料表を参照)に移します。電気泳動システムを290mAで氷上で90分間実行します。
   6. PVDFメンブレンを5%スキムミルク溶液で1時間インキュベートします。トリス緩衝生理食塩水でトゥイーン(TBST、 材料表を参照)でそれぞれ5分間3回洗浄します。
   7. タンパク質の位置に基づいてターゲットバンドを切り取ります。バンドを、製造元の指示に従って適切な濃度に希釈した抗マウスCD63抗体および抗マウスAlix抗体( 材料表を参照)とインキュベートし、4°Cで一晩インキュベートします。
   8. TBSTでバンドを3回洗います。HRP標識抗ウサギIgG( 材料表参照)と室温で1時間インキュベートします。その後、再度TBSTで3回洗います。
   9. スーパーECL検出試薬( 材料表を参照)を塗布してバンドの表面を覆い、すぐにゲルイメージャー( 材料表を参照)を使用してバンドを露光して捕捉します。
4. 共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)
   1. 2 mLのRoswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640)培地を使用して、共焦点皿で5 x 10⁵ DCを培養します( 材料の表を参照)。エキソソームまたはexo@MNエキソソームを添加し、37°Cで24時間インキュベートします。
   2. Hoechst 33342を各共焦点ディッシュに一滴加え、37°Cの暗所で20分間インキュベートします。
   3. CLSM( 材料表を参照)で、60倍の対物レンズを使用してイメージングを行います。レンズにイマージョンオイルを一滴垂らし( 材料の表を参照)、共焦点皿をステージに置きます。x/y/z軸を調整して、セルの適切な焦点面を見つけます。
   4. DAPI/TRITC/TDチャンネルでイメージングを開始し、解像度を1024pxに選択し、高速モードを1/8秒に設定します。
5. フローサイトメトリー
   1. 各ウェルに5 x 10⁵ 細胞と2 mLの1640培地を含む6ウェルプレートでDCを培養します。DPBS、エキソソーム、エクソソームなしのマイクロニードル、およびexo@MNの溶液をそれぞれ等量加え、37°Cで24時間インキュベートします。
   2. 各ウェルから培地を遠心チューブに移します。300 x g で4°Cで3分間遠心分離し、上清を除去します。
   3. 0.5 μL の FITC-CD11c 抗体、2.5 μL の APC-CD80 抗体、0.5 μL の Pacific Blue I-A/I-E 抗体 ( 材料表を参照) を 100 μL の 5% BSA 溶液 ( 材料表 を参照) に加えます。よく混合し、細胞を再懸濁し、氷の中および暗闇でシェーカーで20分間インキュベートします。
   4. 1 mLのDPBSを加え、300 x g で4°Cで3分間遠心分離し、上清を除去します。洗浄を2回繰り返して未結合の抗体を除去し、フローサイトメトリーによる対応する蛍光チャネルの解析に進みます( 材料の表を参照)。
      1. まず、FSC-A/SSC-A 散布図で、メイン細胞集団を P1 としてゲートします。P1細胞集団のSSC-A/SSC-H散布図で、対角線に沿って正方形のP2領域をゲート化して、凝集した細胞を削除します。
      2. FITC、APC、およびPacific Blueチャンネルを使用して、P2細胞集団の蛍光分析を行います。P2ゲートに10,000個のセルを収集するように停止条件を設定します。

5. 統計分析

1. 定量的データを平均±標準偏差 (SD) として表します。適切なデータ分析ソフトウェアアプリケーションを使用して、t検定分析を使用して統計的有意性を評価します。p値が0.05未満であれば、統計的有意性を示すと考えてください。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

結果

ここでは、エキソソームの単離、exo@MNパッチの作製および特性評価のためのプロトコルを紹介します。 図1 は、パッチの製造exo@MNプロセスフローチャートを示しています。エクソソームをトレハロースおよびHAと混合し、次いで、混合物をマイクロニードル型に添加し、遠心分離した。このプロセスにより、針先でのエキソソームの凝集が促進され、迅速な放出が促進されました。乾燥後、PVP溶液を添加し、遠心分離して金型を完全に充填しました。完全に乾燥させた後、型を取り外してexo@MNパッチを得ました。マイクロニードルの形態は、 図2に示すように、顕微鏡とSEMを使用して特徴付けました。exo@MNパッチの先端は、10 x 10の配列に配置された円錐形を示し、針の先端は鋭く無傷でした。マイクロニードルの先端は2Nの力に耐えることができ、皮膚バリアを貫通することができます。さらに、ブタの皮膚は、exo@MNパッチの適用をシミュレートするために、ヒトの皮膚の代理として採用されました。パッチをブタの皮膚に押し付けて放出時間を観察すると、マイクロニードルの先端は60秒以内に完全に溶けました。exo@MNパッチをDPBSに溶解し、 図3に示すように特性評価しました。TEM画像は、エクソソームの形態と一致する典型的なカップ形状の構造を持つ小胞を捉えました。NTAによるexo@MN溶液の粒度分布から、粒子は主に50-250nmの範囲に集中していることが明らかになりました。しかし、より大きな粒子もいくつか存在し、これはHA材料の接着特性に起因する可能性があり、エキソソームの凝集を引き起こしました。exo@MN溶液中のCD63/Alixタンパク質のWB分析により、exo@MNがエクソソームのタンパク質を部分的に保持できることが示されました。exo@MNから放出されるエクソソームの生物学的機能性は、 図4で検証され、細胞によるエキソソームの取り込みと樹状細胞の活性化に焦点が当てられています。CLSM画像は、DCによるexo@MN中の新鮮なエキソソームとエクソソームの両方の効率的な取り込みを確認しました。フローサイトメトリーからの代表的な画像と比例統計は、exo@MNのエキソソームが新鮮なエクソソームと同様にDCの活性化を促進する生物学的機能を持っていることを示しています。

図2:exo@MNパッチの特性評価 (A)exo@MNパッチの実体顕微鏡画像。スケールバー = 400 μm. (B) exo@MNパッチのSEM画像。スケールバー = 200 μm. (C) パッチの荷重対変位プロファイルexo@MN。(D)異なる時間に豚の皮膚に挿入されたexo@MNパッチの顕微鏡画像。スケールバー = 400 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:exo@MNにおける新鮮エクソソームとエクソソームの特性評価 (A)TEMによるエクソソームの形態。スケールバー = 100 nm。(B)NTAによるエクソソームの粒度分布。(C)WBによるエキソソームのCD63およびAlix。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:exo@MNにおける新鮮エキソソームおよびエクソソームの生物学的試験 (A) DCによって撮影されたエキソソームのCLSM画像 スケールバー = 10 μm. (B) フローサイトメトリーによるDCの活性化の代表的なプロット。(C)CD11c ⁺ CD80 ⁺ MHCII ⁺ DCのパーセンテージの定量化データは、SD±平均(n = 3)として示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

現在、エクソソームを単離するための主な方法には、超遠心分離、密度勾配遠心分離、限外ろ過、沈殿、免疫親和性磁気ビーズ、およびマイクロ流体工学^{が含まれる24}。マイクロニードルは針先のスペースが小さいため、ローディングキャパシティが限られているため、より多くのロードを行うためにはエクソソームの濃度を上げる必要があります。したがって、細胞培養上清を濃縮するために限外ろ過を選択し、次に超遠心分離を使用してエクソソームを分離しました。エクソソームの濃度は、微小針に数十から数百マイクログラムのエクソソームを充填できるように、少量の液体再懸濁によって増加させた。しかしながら、この方法では、単離されたエキソソーム溶液中にタンパク質が有意に存在する。さらに、遠心分離プロセス中にエキソソームの大幅な損失が発生します。今日、エクソソームの治療的応用の限界の1つは、高純度かつ大量にエキソソームを単離する効果的な方法の欠如である。エクソソームの臨床的可能性がますます探求されるにつれて、将来的には、その抽出に関連する課題に対処するために、より高度な技術を開発する必要があります。

この研究の鍵となる技術は、エクソソームベースのマイクロニードルの設計です。エクソソームの無駄を省き、より強力な治療効果を得るために、2段階のキャスティング法を採用してexo@MNパッチを作製しました。トレハロースは、エクソソームの凍結乾燥保存に適した材料として以前に報告されており²⁵、一方、HAは優れた生体適合性、親水性、および炎症抑制および皮膚修復促進における機能を示す²⁶。これら2つの材料を使用してエキソソームを充填した針先を作製すると、エクソソームの生物学的活性を維持し、皮膚内での迅速な溶解と放出が可能になります。さらに、このアプローチは感染のリスクを最小限に抑え、皮膚の迅速な回復に貢献します。遠心分離と真空乾燥により、エクソソームはマイクロニードルの先端に集中しました。エタノールとトレハロースの非相溶性を考慮し、無水エタノールに溶解したPVPをバッキング材として選択しました。この層状作製法は、エクソソームの送達効率を効果的に向上させた。

in vitroでのエキソソームの安定性が低いと、4°C、37°C、または-80°Cで保存されているかどうかにかかわらず、エキソソームの構造の変化または分解につながる可能性があります¹¹。この問題を解決するために、凍結乾燥などのエクソソームの保存方法がいくつかの研究で検討されています。マイクロニードル技術は、別の新しい戦略を提供します。マイクロニードル技術は、RTで乾燥させることにより、エクソソームの安定性を向上させることができ、他の治療なしでエキソソームの送達に直接使用することができます。さらに、エクソソームの抽出プロセスは複雑で劣化しやすいため、大規模なアプリケーション化が困難です。マイクロニードル技術を使用して抽出されたエクソソームを保存しても、抽出ステップは単純化されませんが、必要な抽出回数は減少します。1回の抽出で大量のexo@MNパッチが生成され、長期間保存することができます。各治療について同じバッチからのエキソソームマイクロニードルを利用することで、異なるバッチ間の変動が治療結果に対する潜在的な影響を最小限に抑え、それによりエキソソームナノプラットフォームの再現性および信頼性を向上させる²⁷。これにより、エクソソームの臨床応用の可能性が広がります。

今後の研究では、ペイロードの正確な制御を可能にし、針先間の薬物変動を最小限に抑える方法を探求する価値があります。これは、プロセスの最適化、品質管理対策の実施、および高度な技術の利用によって達成できます。これらの側面に対処することは、信頼性と一貫性のある薬物送達システムの開発に大きく貢献します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100x ペニシリン-ストレプトマイシン溶液	Jrunbio Scientific	MA0110	細胞培養
180 kDa、染色済みタンパク質マーカー	Thermo	26616	ウェスタンブロッティング
3% 酢酸ウラニル	河南瑞新 実験用品	GZ02625	エクソソームの形態学的特性評価
3Dプリンター	BMF技術	nanoArch S130	モールド準備
4%–20% プレキャストゲル	Genscript	ExpressPlus PAGE GEL	ウェスタンブロッティング
5×SDS-PAGE ローディングバッファー	Titan	04048254	ウェスタンブロッティング
抗マウス アリックス抗体	バイオレジェンド	12422-1-AP	ウェスタンブロッティング
抗マウスCD63抗体	バイオレジェンド	ab217345	ウェスタンブロッティング
APC 抗マウス CD80抗体	バイオレジェンド	104713	抗体
オートファインコーター	ZIZHU	JBA5-100	マイクロニードル
BCAアッセイキット	Beyotime	P0012	タンパク質濃度アッセイ
遠心分離機	サーモフィッシャー	Muitifuge X1R pro	細胞遠心分離
循環水真空ポンプ	Yuhua Instrument	SHZ-D(III)	ろ過
CO2インキュベーター	Eppendorf	CellXpert C170	細胞培養
共焦点レーザー走査型顕微鏡	ニコン	A1HD25	蛍光イメージング
銅メッシュ	北京中京恵技術	JF-ZJKY/300	エクソソーム
D-(+)-トレハロース二水和物	アラジン	5138-23-4	マイクロニードルの作製
ダルベッコ修正されたイーグル」	Meilunbio	MA0212	細胞培養
Dulbecco'	Meilunbio	MA0010	細胞培養
電気泳動システム	Bio-rad	PowerPac-basic	Western blotting
ウシ胎児血清	Jrunbio Scientific	JR100	細胞培養
FITC 抗マウスCD11c抗体	Biolegend	117305	抗体
フローサイトメトリー	BD	LSR Fortessa	蛍光検出
ゲルイメージャー	Cytiva	Amersham ImageQuant 800	ウェスタンブロッティング
HRP標識抗ウサギ IgG	CST	7074S	ウェスタンブロッティング
HTL 樹脂	BMF 技術		金型調製
ヒアルロン酸 (MW = 300 kDa)	Bloomage Biotechnology	9004-61-9	マイクロニードルの作製
液浸油	ニコン	MXA22168	蛍光イメージング
イオンクリーナー	JEOL	EC-52000IC	エクソソームの形態学的特性
顕微鏡	オリンパス	CKX53	マイクロニードル先端の溶解過程を観察
マウス卵巣上皮がん細胞 ID8	MeisenCTCC	CC90105	細胞培養
ナノ粒子追跡分析	粒子メトリックス	ゼータビュー	エクソソームのサイズ分析
パシフィックブルー 抗マウス I-A/I-E 抗体	バイオレジェンド	107619	抗体
フェニルメタンスルホニルフッ化物	Beyotime	ST507	プロテアーゼ阻害剤
プラズマクリーナー	合肥 Kejing 材料技術	PDC-36G	マイクロニードルの製作
ポリジメチルシロキサン	ダウコーニング	9016-00-6	金型の準備
ポリビニルピロリドン(MW = 40 kDa)	アラジン	9003-39-8	マイクロニードルの製作
プリズム	GraphPad	バージョン9	統計解析
PVDF膜	ミリポア	IPVH00010	ウェスタンブロッティング
クイックスナップ遠心分離機	ベックマン	344619	エクソソーム抽出
RIPA 溶解バッファー	Applygen	C1053	溶解膜
ロズウェル公園記念研究所 1640	Meilunbio	MA0548	細胞培養
走査型電子顕微鏡	日本電子	JSM-IT800	マイクロニードルの形態学的評価
実体顕微鏡	オリンパス	SZX16	形態評価
スーパーECL検出試薬	Applygen	P1030	ウェスタンブロッティング
引張計	インストロン	68SC-05	メカニカルテスト
透過型電子顕微鏡	JEOL	JEM-2100plus	エクソソームの形態学的特性
トリス緩衝生理食塩水	サンゴンバイオテック	JF-A500027-0004	ウェスタンブロッティング
Tween-20	Beyotime	ST825	ウェスタンブロッティング
超遠心分離機	ベックマン	オプティマ XPN-100	エクソソーム抽出
限外ろ過チューブ	ミリポア	UFC910096	エクソソーム濃度
真空乾燥オーブン	上海Yiheng	テクノロジーDZF-6024	マイクロニードルの製造
真空ろ過システム	バイオシャープ	BS-500-XT	ろ過