タンパク質関連新生DNA法の濃縮およびシーケンスによる複製DNA鎖におけるタンパク質の鎖特異的解析

サマリー

タンパク質関連新生DNAの濃縮およびシーケンス(eSPAN)は、2本の複製DNA鎖におけるクロマチン関連タンパク質の相対的な存在比を検出するために開発され、クロマチン複製およびその結合過程に関する分子的知見を明らかにしました。このプロトコルは、酵母およびマウスの胚性幹細胞(ES)細胞におけるeSPAN手技を記述しています。

要約

ゲノム複製は、ヘリカーゼを含むレプリソームタンパク質によって操られ、二本鎖DNAを独立した反平行の一本鎖に展開させ、それぞれに異なる複製モード(連続的(誘導型)と不連続型(遅延)が必要です。クロマチン関連タンパク質と複製DNA鎖の相互作用を理解することは、クロマチンの組み立てとDNA修復のメカニズムを解明し、DNA複製と関連しています。本プロトコルは、複製フォークにおける新生生DNA鎖の先導および遅れのDNA鎖における相対的なタンパク質レベルを定量するために設計された、タンパク質関連新生DNAの濃縮および配列決定(eSPAN)法を提示します。eSPAN手順は、対象タンパク質のクロマチン免疫沈降(ChIP、酵母において)または標的およびタグメント下での切断(CUT&Tag;哺乳類細胞では)から始まり、その後ブロモデオキシウリジン(BrdU)免疫沈殿によるタンパク質関連の新生DNAの濃縮が行われます。鎖特異的次世代シーケンシングは、分離されたssDNAに適用されます。この技術は、タンパク質がリーディングまたはラギング複製フォークで濃縮されているかどうかを判定するために用いられます。eSPANは、複製フォークにおけるヒストンを含むクロマチン関連タンパク質のゲノム全体鎖優先性を提供します。

概要

真核生物では、ゲノム複製は複製起源と呼ばれる複数の部位から開始され、起源認識複合体(ORC)が結合し、CMGヘリカーゼを含むリクルートメントタンパク質機構を起動してDNA複製を開始し^ます。各複製原点のリプリゾム機構は、双方^向に移動する2つの複製フォークを形成します^。双子複製フォークは、先導鎖の連続合成と遅れた鎖の不連続合成を通じて、DNAの2本の親鎖を複製します。各複製フォークの非対称性を考えると、先導鎖と遅延鎖のDNAポリメラーゼを含む複製成分は異なります。変異DNAポリメラーゼに基づく従来の遺伝解析では、DNAのPol εとDNAのPol δがそれぞれ先導鎖複製と遅れ鎖複製の主な役割を持つポリメラーゼであることが示されています。DNAポリメラーゼの鎖の好みを検出するために、Pu-seq ^6,7、HydEn-seq⁸、emRiboSeqまたはRiboSeq ^9,10など、いくつかの手法が開発されています。これらの鎖特異性を解析する遺伝学的手法はDNAポリメラーゼに限定され、各タンパク質4,5,11,12に変異を導入する必要があります。標的タンパク質とDNA複製フォークの先行鎖および遅れ鎖との関連を追跡することは、DNA複製に関する貴重な洞察を提供します。この取り組みの中で、まず酵母細胞におけるeSPAN技術(タンパク質関連新生DNAの濃縮およびシーケンス、図1)を開発しました。原理証明研究として、まずPol δとPol δがそれぞれ先導鎖と遅れた鎖に濃縮していることを示しました。また、複製DNAヘリカーゼ、単鎖DNA結合タンパク質(複製タンパク質A)、増殖細胞核抗原(PCNA)ランプとそのローダー複製因子C(RFC)を含む主要なDNA複製成分の鎖の好みも明らかにしました¹³。重要なのは、私たちや他の研究者がこの手法を用いて、40年以上にわたり解決困難だった親ヒストン移動のメカニズムを明らかにしたことです(14,15,16,17)。

eSPAN法は、ChIP¹⁸またはCUT&Tag¹⁹による標的タンパク質の濃縮と、BrdU免疫沈殿によるタンパク質関連の新生DNAの濃縮の2つの連続工程から成り立っています。標準的な酵母株(W303またはS288C)では、細胞外のBrdUやEdUは細胞内に侵入し染色体に取り込まれることができません。これらの株は、チミジンを取り込むための適切なヌクレオシドトランスポーターや、チミジンをTMPにリン酸化するために必要なチミジンキナーゼを欠いており、TMPはBrdU(またはEdU)をBrdUMP(EdUMP)に変換します。ヒト平衡ヌクレオシドトランスポーター1(hENT1)および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSV-TK)の発現は、チミジンの取り込みを促進し、BrdU(またはEdU)からBrdUMP(EdUMP)への変換を促進します²⁰。したがって、酵母でeSPAN実験を行うためには、株にBrdU-Incorporating (BrdU-Inc)構造(HSV-TKおよびhENT1)を挿入する必要がありました^13,21。

以前は、酵母²²のDNA複製タンパク質向けにeSPANプロトコルを提供しました。最近では、架橋、クロマチン剪断など最適化が必要な技術的に難しいステップに対応するため、哺乳類細胞のeSPANプロトコルにCUT&Tag法を統合し、開始細胞^数17,23の最小化を図りました。ここでは、酵母細胞を用いた可視化のためのヒストンeSPAN(図2)を提供しました。この方法は主に、複製中のDNA鎖上における修飾されたヒストンの分布を解析するために用いられます。いくつかのヒストンマークをテストする際、例として親ヒストンH3のマークであるH3K4me3を例に挙げました。複製フォークでDNA修復に関与するレプリゾン成分や因子を解析するために、最初の論文²²で説明したように、クロマチンを超音波処理を用いて小さな断片にせん断することを推奨します。哺乳類細胞では、酵母²³で記述されたChIPステップを置き換える修正版Cut&Tag手順を採用しました。この修飾により、起始物質(細胞)の数が減り、最も重要なことに、単鎖DNA製剤キットを使わずにeSPANライブラリーのシーケンス生成が可能になります。酵母プロトコルでは、開始物質の量が十分だったため、Cut&Tag法は使用しませんでした。さらに重要なのは、Cut&Tagの手法が手の酵母細胞に対して一貫して効果的でないことが分かったことです。

プロトコル

注:バッファーおよび試薬調製ガイドラインについては、バッファーおよび試薬調製ガイドライン(補足ファイル1)を参照してください。

1. 出芽酵母におけるヒストンeSPAN現象

注:ほとんどの酵母株にはチミジンを取り込むための機能的なヌクレオシド輸送体がありません。eSPANに対してBrdUまたはEdUでDNAを効率的に標識するには、チミジンキナーゼ陽性(TK+)株²¹ が必要です。さらに、アルファファクターを用いた細胞周期停止には交配型A酵母株のみが使用可能です。

1. 酵母細胞の同期とBrdU標識(8時間)
   1. 適切な酵母株(TK+)の単一コロニーを10mLのYPD培地に接種し、振動インキュベーターで220rpmで30°Cで一晩増殖させます。
   2. 分光光度計で光学密度OD600 nmを測定し、培養液をOD600 ~0.2-0.3で新鮮なYPD培地200mLに希釈します。
   3. 培養液をOD600~0.4-0.5(通常3〜4時間)まで、30°Cで振動インキュベーター(220rpm)で培養します。
   4. 300μLのα因子(5 mg/mL)を加え、25°C、220 rpmで1.5時間培養します。
   5. さらに300μLのαファクター(5 mg/mL)を加え、25°C、220 rpmでさらに1.5時間増殖させます。
   6. 37.5%パラホルムアルデヒド固定液を準備し、細胞同期中に培地(200 mL YPD +HU(ヒドロキシウレア)+ BrdU)を30°Cまで予温します。
      注意:BrdUは変異原や催奇形類の可能性があるため注意してください。有害な煙への曝露を避けるため、化学用煙フードで37.5%のパラホルムアルデヒド溶液を準備してください。パラホルムアルデヒドは発がん性の可能性があるためです。
   7. 細胞の形態(棒状)を光学顕微鏡で確認し、3時間のG1停止の15分前に少なくとも90%の酵母細胞がG1期にあることを確認してください。あるいは、蛍光活性化細胞選別(FACS)解析を行い、G1停止²⁴を確認しましょう。
      注意:このステップで細胞形態を確認し、G1停止(90%が棒状)であることを確認してください。
   8. 細胞(ペレット)は 1600g で遠心分離し、4°Cで5分間採取し、20mLの氷で冷たい二重蒸留水で2回洗浄します。
   9. 細胞を予温(30°C)の200 mLのYPD +HU+ BrdUに再懸濁させます。
      注:HU放出の目的は、ほとんどの酵母細胞が初期複製S期に位置し、一貫性を向上させ結果の再現性を確保することです。ログ位相セルを扱う必要がある場合はHUを省略しても問題ありません。
   10. 細胞を30°C、220rpmの振動インキュベーターで45分間培養します。
       注:FACS解析は初期S期を確認するために実施可能です。FACS解析では、G1細胞集団を正確に定義するために対数位相サンプルをコントロールとして含めることが重要です。効率的なBrdU組み込みのためには、成長の速い細胞から始めることが有利です。成長が遅い欠陥を持つ一部の変異体は、BrdU標識効率が低い傾向があります。BrdU組み込みの効率とBrdU-IPの性能は、ステップ1.6.7から分離された^DNAを用 いて複製領域と非複製領域を比較することで定量PCRで評価されます。
2. サンプル固定と採取(1時間)
   1. 新たに調製した37%パラホルマルデヒド6mLを最終濃度1%に加え、よく混ぜて25°Cで20分間、優しく振って90rpmで培養します。
   2. 固着を消し去るために2.5 Mグリシン12 mLを加え、よく混ぜて25°Cで5分間、優しく振って90 rpmで培養します。
   3. 細胞を1600gで室温(RT)で5分間ペレットします。その後、1600gで5分間回転させ、20mLの冷水で細胞を2回洗います。
   4. 細胞を2mLのスクリューキャップチューブ(細胞1管あたり50mL)に集め、-80°Cで保存します。
      注意:細胞は最大1年間保存可能です(一時停止)。
3. 酵母細胞溶解とクロマチン断片化(5時間)
   1. 細胞ペレットを解凍し、穏やかな渦流で再懸濁させ、プロテアーゼ阻害剤と抗生物質混合液を混ぜた0.4mLのChIP溶解バッファーで洗浄(汚染菌の増殖防止)。5,000gで1分間回転させます。
   2. プロテアーゼ阻害剤を含むChIP溶解バッファー0.1 mLと抗生物質混合物を加え、その後約100 μLのガラスビーズ(0.5 mm)を加えます。
   3. 溶菌は4°Cの冷室で3サイクル(オンオフ30秒、オフ1分)ビーズバッティングで行います。
   4. 16Gのホットニードルでチューブの底に穴を開けます。
      注意:熱い針を保つには、チューブを火の近くに保つようにしてください。
   5. 溶除液は、チューブを1.5mLの空のDNA低結合チューブに入れて1600gで遠心分離機で2分間RTして回収します。
   6. ペレットを乱さずに上清液を慎重に吸引してください(クロマチンは細胞ご片分画に含まれています)。
      注意:真空を使う際に誤って細胞ペレットを吸引しないように注意してください。
   7. 細胞ペレットを0.35 mLのMNase消化バッファーに0.5 mMのスパーミジンおよび0.1 mMの2-メルカプトエタノールを補足してピペットで再懸濁させます。
   8. 反応にMNaseを10単位加え、すぐに4〜6回逆さまに優しく混ぜ、37°Cの水浴で20分間培養します。
      注意:消化条件は、各MNase酵素バッチごとに最適化され、モノ、ジ、トリヌクレオソームの分画を濃縮させる必要があります。
   9. MNase消化を抑制するには、0.5 M EDTAを5 μL加えて最終濃度10 mM EDTAにします。逆転で優しく混ぜ、チューブをすぐに氷に30分入れておきます。
      注意:この段階ではサンプルを4°Cで一晩保存することができます。MNaseの消化条件は、モノ、ジ、またはトリヌクレオソームの大部分(140-450塩基)を得るよう最適化されるべきです
   10. 反応混合物をバイオラプターマイクロチューブ(1.5mL)で3分間(高出力、30秒オンオフ)ソニックケーティングします。10,000gで4°Cで5分間回します。
       注:この短い超音波処理はクロマチンをバッファーに放出するのに役立ちます。
   11. 上澄液を新しいチューブに移し、さらに10分間10分間、10,000g、4°Cで回します。
   12. 上澄液(約400μL)を採取し、サンプルの30μLを入力DNAとして保存し、-20°Cで凍結します。残りの細胞溶解液(~370μL)を次のクロマチン免疫沈殿に使用します(ステップ1.4.1)。
4. ヒストンクロマチン免疫沈降(夜間)
   1. 溶解液に0.5 μgのH3K4me3抗体を加え、ローター上で10回転、4°Cで一晩かけてナチューティングします。
      注:ここではH3K4me3を例として用いています。抗体の量は実験的に検査すべきです。
   2. 15,800 × g で4°Cで10分間回転させ、上澄液を新しい1.5 mLチューブに移します。
   3. 事前に洗浄されたタンパク質Gセファロースビーズ20μLを加え(ChIP溶解バッファーで3回洗浄し、ローター上で各3分間ナテージし、350 × g、4°Cで遠心分離でビーズを集め)、4°Cで2時間培養します。
   4. RTで350 g ×回転し、以下の順番でビーズを洗います。
      1. 1mLの氷冷溶解バッファーで2回、毎回3分間、回転10rpmでRTで洗います。
      2. 1mLの氷冷溶解バッファーと0.5 M NaClバッファーで3分間、回転させて10回転でRTで洗浄します。
      3. 1mLの氷で冷えたTris/LiCl洗浄バッファーで1回、回転10rpmでRTで3分間洗います。
      4. 1mLのRT Tris/EDTA洗浄バッファー(TEバッファーではなく、レシピの 補足ファイル1) で洗ってください。16 G 1/2の針でペレットから可能な限りの液体を絞り出します。
5. DNA抽出(2時間)
   1. 洗浄ビーズ(ステップ1.4.4.4)に、DNA抽出用のよく混合された10%キレート樹脂0.1mLを加え、入力サンプル(ステップ1.3.12以降)、ボルテックスに加えます。
   2. 100°Cの熱ブロックで10分間沸騰させ、その後RTで冷やして逆架橋を形成します。
      注意:遠心分離機チューブ用のストップポップロッククリップは、閉鎖シールを維持するために強く推奨されます。
   3. ビーズに20 mg/mLのプロテアーゼKを5 μL加え、55°Cで30分間、400 rpmで振って培養します。
   4. ビーズを100°Cの熱ブロックでさらに10分間煮詰めてプロテアーゼK活性を不活性化させます。
      注意:遠心分離機チューブ用のストップポップロッククリップは、閉鎖シールを維持するために強く推奨されます。
   5. ビーズを 6000g で2分間RTで回し、上清液を保存します。
   6. ペレットに2XTEを100μL加えます。ボルテックスと 6000g で2分間RTでスピンダウンします。
   7. 上清液(ステップ1.5.5および1.5.6の約180μL)を混ぜて保存します。
   8. 30μLサンプルをDNA精製カラムを用いて18μLのエリューションバッファー(EB、PCR精製キット付属)に精製し、ssDNAライブラリーの調製を行います(ステップ1.3.12から入力、ステップ1.5.7からH3K4me3 ChIP-seqサンプル)。
      注意:DNAサンプルは-20°Cで最大1か月間(一時停止点)保存可能です。
6. BrdU免疫沈殿(5時間)
   1. サンプル(約150μLの入力量とステップ1.5.7のH3K4me3 ChIP)を100°Cの熱ブロックで5分間沸騰させ、すぐに氷で5分間冷やします。10xPBSを15 μL、BrdU IPバッファー+1.35 mL + 抗BrdU抗体0.5 μL + 大 腸菌 tRNA 1 μL(10 mg/mL)を加えます。
      注意:これは重要なステップです。非特異的なDNA結合を避けるために、低DNA結合の遠心分離機チューブを使いましょう。
   2. ローターで4°C、10rpmで2時間ナチューティングします。
   3. 混合物を1.5mLのチューブに移し、20μLのプロテインGセファロースビーズ(1mLのBrdU IPバッファーで3回洗浄し、RT洗浄ごとに10回転毎分3分間回転)をローター上で10回転で1時間回転させます。
   4. 800 × g で1分間RTでスピンし、次の方法で洗浄します:1 mLのコールドBrdU IPバッファーで3回、ローターで3分、1 mLのTEバッファーで3分。
   5. 800 × g で1分間RTで回し、上清液を吸引します。
   6. 残りのビーズにTE+1%のSDSバッファーを100 μL×加えます。65°Cで5分間インキュベーションします。RTで800 g ×1分間回転させてください。
   7. DNA精製カラム(BrdU IPおよびH3K4me3 eSPANサンプル)を用いて上清液を18μLのEBに精製します。
      注意:非特異的なDNA結合を避けるために、低結合の遠心分離機チューブを使用してください。DNAサンプルは-20°Cで最大1か月間(休止点)保存可能です。
7. SSDNAライブラリーの調製と配列決定(3時間)
   1. ssDNAおよび低入力DNAライブラリーキットのマニュアルに従い、15μLの精製入力、BrdU IP、H3K4me3 ChIP、eSPANサンプル(ステップ1.5.8および1.6.7)(アダプターゼ、拡張、ライゲーションを含む)(アダプターゼ、拡張、ライゲーションステップを含む)を用いた単鎖DNAライブラリーを準備し、得られた結合生成物を20μLの低EDTA洗脱バッファー(DNAライブラリー準備キット提供)に精製します。
      注意:このキットには2つの結紮精製工程があります。このプロトコルは200 bp、<1 ngの手順に従っています。
   2. 合計50μL反応混合物(ssDNAライブラリー製剤キットで提供)を用いてDNAライブラリーを増幅します:精製DNAライブラリー20 μL、試薬W2 4 μL、試薬W3 10 μL、酵素W4 1 μL、インデックスI7プライマー1.5 μL(10 μM、補助オリゴ配列参照)、インデックスI5プライマー1.5 μL(10 μM、 補充オリゴ配列を参照)、DNaseフリーddH₂Oを16 μL。PCR混合物を98°Cで30秒加熱し、その後98°Cで10秒ずつ18サイクル、60°Cで30秒、68°Cで1分、68°Cで10分のサイクルを1回行います。
      注意:各ライブラリはi7とi5のプライマーをユニークに組み合わせて使用すべきです。増幅サイクル数はライブラリの量に応じて調整し、過剰増幅を防ぐためにPCRアーティファクトの発生を防ぐべきです。eSPANサンプルのDNA量が通常少ないため、最大18サイクルを使用します。
   3. PCR産物は、30°Cに予温された60μL(1.0倍の体積)ビーズを混ぜて精製します(材料 表参照)。
   4. PCR産物とビーズをよく混ぜてください。
      1. RTで5分間そのまま置いてください。ビーズを磁気スタンドに3分間結合し、2回(毎回200μL)新たに調製した80%エタノールで2回洗います。
      2. ビーズを2分間自然乾燥させ、DNAライブラリープレップキットに付属の20μL低EDTAバッファーに溶出させます。
   5. 高分解能電気泳動システムを用いてライブラリーの濃度および断片サイズ分布を測定します(材料 表参照)。
   6. 入力、H3K4me3 ChIP、BrdU IP、eSPANサンプルを含む同数の個別ライブラリをプールし、Illuminaシーケンシングプラットフォームで並列ペアエンドシーケンスを実行します。データ分析のプロセスについては、第3節を参照してください。
      注:品質管理結果の評価基準は以下の通りです:(i) アダプター/プライマー-ダイマーピーク(180 bp未満)は検出されません。(ii) プールされるすべてのライブラリは、幅が約300 bpの類似かつ狭いサイズ分布を持つ。ビーズを過度に乾燥させると収量が低下することがあります。汚染を避けるためにDNAワークステーションを使いましょう。ライブラリは-20°C(一時停止点)で無期限に保存可能です。

2. マウスESセルを用いたHistone eSPAN(ヒストンeSPAN)

注:マウスES細胞を用いたヒストンeSPANは、基本的に既に発表されたプロトコル²³と同一です。

1. マウスES細胞のBrdU標識およびサンプル採取(3時間)
   1. マウスES細胞を37°CのES細胞培養培地で、加湿した5%_CO2 の雰囲気で培養し、70%〜80%のコンバール率に到達させます。一般的に、ヒストンeSPANには約100万個の細胞が必要でした。実験の1日前に細胞をまき、細胞が指数関数的に成長しているか確認します。
   2. 培地を交換し、最終濃度50μMのBrdUで37°Cで30分間、加湿された5%_CO2 の大気で培養します。
      注:BrdUの標識効率は定量的なPCR解析によってモニタリング可能です。あるいは、免疫蛍光やFACS解析を用いてBrdUの組み込み効率を監視することも可能です。標識されていない細胞は陰性対照として使用できます。これらはマウスES細胞の標準的な標識条件です。増殖率やS期期間が異なる細胞に対して、標識条件を適切に調整することが推奨されます。
   3. 細胞を氷のように冷たいPBSで優しく2回洗い流します。
   4. トリプシン化し、200 × g で5分間ペレット状にして細胞を採取します。
   5. 細胞を優しく培地にピペットで移して再懸濁させ、その後数えてください。500 × g で必要な細胞数を5分間RTで遠心分離します。
   6. ピペッティングで細胞ペレットを4mLの洗浄バッファーに再懸浮させ、上清液を廃棄します。遠心分離機で500 × g でRTで5分間加熱します。
   7. ペレットを再び4mLのウォッシュバッファーで再懸浮させ、遠心分離機で500×gのRTで5分間加熱します。
   8. 上清液を捨て、細胞を洗浄バッファーに再懸濁させます。
   9. ConAコーティングされた磁気ビーズを置き(25万細胞には10μLのビーズを使用、より多くの細胞を使う場合は拡大)、結合バッファー1mLに再懸濁します。複数回反転した後、チューブを磁気スタンドに置いてビーズが沈殿するのを待つ。
   10. ピペットや低速真空を使って、上澄液を捨てます。洗浄工程を2回繰り返し、ビーズを結合バッファーに再浮懸させます。
   11. サンプルにあらかじめ洗浄されたConAコーティングされた磁石ビーズを加えます。よく混ぜて、RTで10〜20分回転させてください。
   12. チューブをマグネットスタンドに置き、すべての上清液を排出します。
2. マウスES細胞のタグメンテーション¹⁹ (2日間)
   1. ビーズ(ConAコーティングされたマグネットビーズで、ステップ2.1.10の細胞と結合)を200μLの氷冷抗体バッファーに再懸浮させます。IgGを陰性対照として、または対象タンパク質に対する一次抗体の適切な濃度として加えます。
   2. よく混ぜて、4°Cで一晩中ナチュータリングします。
   3. 二次抗体2μgと適切なpA-Tn5を1:2モル比で混合します。総体積を50%(v/v)グリセロールでサンプルあたり8μLにします。ピペットで何度か混ぜてよく混ぜ、RTで1時間培養します。
   4. CUT&Tagサンプルをマグネットスタンドに30秒置き、すべての上清液を捨てます。ビーズペレットに1mLのDig-washバッファーを加え、数回逆さまにします。
      注意:これから次の洗浄ステップ(ステップ2.2.5-2.2.6)にかけて、反回転工程後3〜5分間バッファー内でビーズをキュベーションし、非特異的な結合を防ぐことが推奨されます。
   5. チューブをマグネットスタンドに置き、すべての上清液を取り除きます。ビーズを再懸浮させるためにDig-300バッファー200μLを加え、各サンプルに二次抗体とpA-Tn5の混合物8μLを加えます。ピペッティングとよく混ぜた後、RTで1時間キュベートします。
   6. チューブをマグネットスタンドに置き、すべての上清液を取り除きます。Dig-300バッファー1mLを加えてビーズを再懸浮させ、数回反転させます。
   7. チューブをマグネットスタンドに置き、すべての上清液を取り除きます。洗濯の手順をさらに3回繰り返します。
   8. 上清液を完全に除去し、250μLのタグメンテーションバッファーを加えてビーズを再懸浮させ、37°Cで1時間培養します。
      注意:サーモミキサーの反応段階では、ビーズがチューブの底に沈殿する可能性があるため、優しく振ることが推奨されます。
   9. チューブをマグネットスタンドに置き、すべての上清液を取り除きます。1mLのTAPSウォッシュバッファーを使ってビーズを再懸濁し、数回反転させます。
   10. チューブをマグネットスタンドに置き、すべての上清液を捨てます。
   11. 残りのビーズに15 mM EDTA、0.1%(w/v)SDS、0.1 mg/mLプロテインナーゼKを含むDig-300バッファー250 μLを加えます。ボルテックスをよく混ぜ、37°Cで一晩やさしく振って孵化させます。
3. マウスES細胞におけるゲノムDNA精製および in vitro タグメンテーション(一晩)
   注:eSPANと同じ細胞からゲノムDNAを抽出し、in vitro タグメンテーションのためにセットアップします。これはBrdU-IP-ssSeqに使用されます。ゲノムDNAタグメンテーションおよびそれに続くBrdU-IP-ssSeqはeSPAN正規化の目的で行われます。
   1. 細胞を300μLのゲノムDNA溶解バッファーに再懸浮させ、最大速度でボルテックスし、ペレットが見えなくなるまで続けます。
   2. すべてのサンプルに対して、100μg/mLのRNase Aを加えます。混合後、37°Cで10分間培養します。
   3. 各サンプルに100μLのタンパク質沈殿液を加えます。15,000gのRTで3分間、ボルテックスと遠心分離機でよく混ぜます。
   4. 上澄液を新しい1.5mLチューブに移して保存してください。サンプルに1倍の量のイソプロパノールを加え、よく混ぜます。
   5. RTで最大速度で3分間回転させてゲノムDNAを完成させます。上澄液を慎重に注ぎます。
   6. 各サンプルに新たに調製した70%(v/v)エタノールを1mL加え、数回逆転させます。RTで最大速度で遠心分離機を3分間回します。
   7. 15,000gでRTで1分間遠心分離し、残りのエタノールをP20ピペットで除去します。5〜10分ほど自然乾燥させます。
   8. 50μLのddH_2Oを加え、短時間ボルテックスしてゲノムDNAを再懸濁させます。65°Cで30分間溶かします。
   9. 短時間遠心分離機で、上清液を新しい1.5 mLチューブに移します。分光光度計でDNA濃度を定量します。
   10. 表1に記載されたin vitro標識反応を設定します。
   11. よく混ぜて37°Cで30分間、優しく振って孵化させます。
   12. 各サンプルに10 mM EDTA、0.1%(w/v)SDS、0.1 mg/mLのプロテイナーゼKを加えます。渦巻きでよく混ざり、37°Cで一晩振って孵卵します。
4. DNA抽出とオリゴ置換(3時間)
   注:DNA抽出にはフェノールクロロホルムイソアミルアルコール(PCI)およびカラム精製の両方を適用可能です。ここでは、カラム精製を用いた詳細な手順が提供されています。
   1. 試料に1.25 mL(5×容量)の結合バッファー(PCR精製キット付属)を加え(ステップ2.2.11および2.3.12)、数回反逆してよく混合します。
   2. 混合物をDNA精製カラム(2mLの採集管)に積み込み、RTで10,000 × g で30秒遠心分離します。流れ液は廃棄します。
   3. 600μLの溶出バッファー(キットに付属)をカラムに加え、10,000 × g のRTで1分間遠心分離機で処理します。フロースルーは廃棄します。
   4. 最大速度で2分間遠心分離機で残ったバッファーを完全に除去します。カラムを新しい1.5mLチューブに蓋を開けて1分間自然乾燥させます。
   5. 膜の中央にDNaseフリーddH₂O(または10 mM Tris·HCl、pH = 8.0)32 μLを加え、1分間休ませます。最大速度で2分間遠心分離し、CUT&TagのDNAは溶液中に入っています。
   6. 新しいPCRチューブに32 μLのCUT&Tag DNAサンプルを加え、さらにdNTPミックス2 μL(各2.5 mM)、10倍アンプリガーゼバッファー4 μL、rep-B(10 μM)2 μLを加えます。軽く叩き、ピペットで混ぜます。
   7. オリゴ置換²³の次のプログラムを短くスピンダウンして実行します。
      50°C、1分
      45°C、10分
      37°Cまで上昇、0.1°C/s
      37°C、維持
   8. サーモサイクラー内で、各チューブ(最終体積、サンプルあたり40 μL)にT4 DNAポリメラーゼ1 μLとアンプリガーゼ1 μLを加えます。優しくピペッティングで混ぜます。
   9. 37°Cでサーモサイクラーで30〜60分間反応を続けます。
      注意:このステップの直後にBrdU IPに進まない場合(安全な一時停止点)、DNAは-20°Cで保存可能です。
5. BrdU免疫沈殿法(基本的に酵母プロトコルと同じ)(2時間)
   1. サンプルを1.5mLのDNA低結合チューブに移します。サンプルを100°Cの熱ブロックで5分間煮詰め、すぐに氷で5分間冷やします。10xPBSを15 μL、BrdU IPバッファー+1.35 mL + 抗BrdU抗体0.5 μL + 大 腸菌 tRNA 1 μL(10 mg/mL)を加えます。
   2. ローターで4°Cで2時間ナテートします。
   3. 混合物を20μLのプロテインGセファロースビーズ入りチューブに移します(1mLのBrdU IPバッファーで3回、各3分洗浄)。
   4. 4°Cで1時間孵卵します。
   5. 800 × g で1分間スピンし、次の方法で洗います:冷たいBrdU IPバッファー1 mLで3回、ローターで3分洗います。1回はTEバッファー1mLを3分間投与しました。
   6. 800×g で1分間回し、上清液を吸引します。
   7. 残りのビーズにTE+1%のSDSバッファを100μL加えます。65°Cで15分間培養します。800g×1分間スピンします。
   8. 上清液をDNA精製カラム(BrdU IPおよびH3K4me3 eSPANサンプル)を用いて、キット付属の18μLの洗脱バッファーに精製します。
6. PCR増幅およびシーケンス(1.5時間)
   1. 異なるインデックス組み合わせを用いて単鎖DNAライブラリサンプルを増幅・標識します。以下の成分を加えてPCR反応を準備します((精製DNA[ChIPまたはESPAN]、I5-インデックスプライマー[1 μL]、I7-インデックスプライマー[1 μL]、NEBNext High-Fidelity 2X PCRマスターミックス(2x)[10 μL]、ddH_2Oから最大20 μLまで)、ピペッティングによる混合、そして短時間のスピニング。
   2. PCRミックスを98°Cで30秒加熱し、その後12〜14サイクル(98°Cで10秒、63°Cで20秒)、さらに72°Cで2分のサイクルを1回加熱します。
   3. PCR産物を18μLの常磁性ビーズ(0.8倍体積)で精製し、20μLの低EDTAバッファーに移します。
   4. 高解像度電気泳動システムを用いてライブラリーの濃度および断片サイズ分布を測定します。
   5. 入力、H3K4me3 ChIP、BrdU IP、eSPANサンプルを含む同数の個別ライブラリをプールし、Illuminaシーケンシングプラットフォームで並列ペアエンドシーケンスを実行します。

3. eSPAN:酵母細胞のデータ解析(1日)

注:このデータ解析プロセスは酵母データにのみ適用されます。ESセルのeSPANデータ解析は、最近の出版物²³で示されているように追跡できます。

1. 生のシーケンスファイルを抽出し、Trim Galoreツールでアダプターシーケンスをトリムし、出力ファイルのサイズを小さくしアラインメントプログラムのクラッシュを防ぐために10bp未満のリードを削除します。ペアリードの場合はファイルがfile1_1.fq、file1_2.fqの形式であることを確認しましょう:
   /TrimGalore-0.6.10/trim_galore file.fq-o trim --length 10 - ペアリング
2. リファレンスゲノムの蝶ネクタイインデックスファイルを生成する:
   bowtie2-build genome.fa
3. リードを対応する参照ゲノム(酵母の場合はSaccharomyces genome(sacCer3))にBowtie 2を用いてマッピングします。
   ボウタイ2 -x ゲノム -1 trim_1.FQ -2 trim_2.FQ --局所 --no-dovetail --no-discordant --maxins 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50
4. SAMtoolsでマルチマップリードを削除し、Sambamba ツールで重複リードを除去します:
   Samtools View -BHS - Q 40 input.bam -o output.bam
   sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-static markdup output.bam filtered.bam -r
5. Deeptoolsを使って、クリーンなBAMファイルから各サンプルごとにWatsonとCrickのストランドのリードカバレッジの大きなファイルを個別に生成します。
   bamCoverage -b filtered.bam -o watson.bw --filterRNAstrand reverse -bs 1 - extendReads
   bamCoverage -b filter.bam -o crick.bw --filterRNAstrand forward -bs 1 - extendReads
6. 各サンプルの各ヌクレオソーム位置²⁵ での平均バイアスを、log2の式に基づいて計算します。参照ヌクレオソーム位置の順位(ワトソン鎖)/逆方向(クリック鎖)読み取り値は²⁵分離されました。これらの計算のためのRスクリプトは https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias で入手可能です。標準的な計算には以下のコマンドを使用します。
   注:このステップは酵母データにのみ適用されます。ESセルのバイアス計算は、最近の論文²³で示されているように従うことができます。
   脚本cal_bias。R -w watson.bw -c crick.bw -r replication_origins.bed
7. 必要に応じて、BrdUバイアスでストランドバイアスを調整します。
   脚本normalize_bias。R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --ターゲット target_list --コントロールcontrol_list
   注:「matrix_files」はcal_biasによって生成されたファイルの一覧です。R文字はコンマで区切られています。例えば「file1」「file2」「file3」などです。「classes_list」は、各ファイルに対応するサンプルクラスの一覧で、コンマで区切られています(例:『brdu』『H3K4me3_eSPAN』『H3K56ac_eSPAN』)。「condition_list」は各ファイルに対応するサンプル条件のリストで、コンマで区切られています。各ファイルはクラスと条件ごとにペアリングされ、バイアス調整が行われます。「target_list」はclasses_listから取られたクラスのリストです。コントロールによって調整されるデータとなるクラス(例:「H3K4me3_eSPAN」や「H3K56ac_eSPAN」)を定義します。「control_list」はクラスリストから選ばれたクラスのリストです。コントロールによって調整されるデータとして機能するクラスを定義します。リストの長さが target_list と同じであることを確認しましょう(例:「brdu」など)
8. 計算と調整の後、サンプルをグループ化し、データの可視化を作成します。
   脚本draw_bias。R -s' bias_matrix/file1.txt, bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g 群 1,群 2 --区間=T
   -sは上記のスクリプトによって生成されたバイアスファイルのリストを必要とします
   -o は出力ファイルです
   -g は計算する実験群、すなわち生物学的複製を定義して平均バイアスをプロットします。
   --区間TまたはFで、実験群内のプロットに標準誤差を表示します。
   注:レプリケーションの起源に関する情報はBrdUのIPデータによって定義されました。単一塩点体の位置情報は、以前に発表された論文²⁵から得られました。マウスES細胞データの解析では、起源情報はOK-seqデータセット²⁶から得られ、平均バイアス計算は前述の研究²³で示したプロトコルに従うべきです。

結果

eSPANは、ヒストンやヒストン修飾など、標的タンパク質に関する鎖特異的情報を取得するために利用できます。この代表的な結果では、図2の示された図式に従って出芽酵母システムを用いてサンプル採取およびeSPANプロセスが実施されました。サンプル処理および採取は、このプロトコルと同様にヒドロキシウレア処理された初期S期の状態に従っています。2つの酵母株、野生型(WT)とmcm2-3A変異株が用いられました。DNAヘリカーゼサブユニットMCM2は親ヒストンのH3-H4シャペロンとして働きますが、3つのアミノ酸変異を含むmcm2-3A変異体は親ヒストンのH3-H4に結合する能力を持ち^ません。図3Aは一定の長さの倍数のDNA断片を示し、バイオアナライザーで解析したクロマチンヌクレオソームラダーパターンを示し、準備されたシーケンスライブラリーを用いています。通常、eSPANライブラ...

ディスカッション

先行および遅れ複製鎖に関連するタンパク質の検出は、クロマチン複製のメカニズムおよびそれに伴うプロセスを理解する上で重要であり、これらはヒトがん研究や薬剤耐性のメカニズムに直接関係しています。2Dゲル、ネイティブクロマチン免疫沈殿(nChIP)、iPOND、新生クロマチンキャプチャ^29,30,31など、DNA複製やDNA修復などの関連プロセスの研究に用いられています。さらに、MINCE-Seq(EdUおよびシーケンスによる生体内新生クロマチンマッピング)³²やCHOR-seq(複製後のクロマチン占有)³³などの生前クロマチンマッピング手法も開発されており、DNA複製過程におけるヒストンやその他のクロマチン結合タンパク質の動態を研究しています。これらの手法はクロマチン複製の理解を大きく進めましたが、いずれも複製フォークの異なる...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5 M EDTA、pH 8.0	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15575020
1.5 mL DNA低結合チューブおよびnbsp;	エッペンドルフ	22431021
10倍アンプリガーゼバッファ	ルシゲン	A1905B
10倍PBS	コーニング	21-040-CV
10倍TBS	バイオラッド	1706435
16 G x 1と1/2インチ。BD プレシジョングライドニードル	BDバイオサイエンス	305198
ACCEL-NGS 1SプラスDNAライブラリキット	統合DNA技術	10009817	ssDNAおよび低入力DNAライブラリー準備キット
Agilent 2100バイオアナライザー	アジレント	2100バイオアナリシス
Agilent DNA 1000キット	アジレント	5607-1504
アンプリガーゼ	ルシゲン	A0110K	パラホルマルデヒドは可燃性で危険なので注意してください。
AMPure XP	ベックマン	A63881
AMPureXP SPRI試薬	ベックマン・カウルター	A63882
抗BrdU抗体およびnbsp;	BDバイオサイエンス	555627
抗H3K4me3抗体	アブカム	AB8580
自動セルカウンター 、モデルTC10	バイオラッド	145-0001
バシトラシン	シグマ	11702
バクト・ペプトネ	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	211830
ベンザミジン塩酸塩など;	シグマ	B2417	可燃性固形物
BrdU	シグマ	B5002	BrdUは潜在的な変異原や催奇形体となるため、慎重に扱ってください。
BSA	ニューイングランド・バイオラボ	B9000S
CaCl2	シグマ	C4901
細胞培養インキュベーター	サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック モデル Forma シリーズII ウォータージャケット式CO2インキュベーター	3140
細胞培養培地および
細胞株 ES-E14
Chelex-100	バイオラッド	1422842	200–400のドライメッシュサイズ
クロロホルム	シグマ	366919
コンカナバリンA(ConA)被覆磁性ビーズ	ポリサイエンス	86057-10
デジトニン	ミリポール	300410-5MG
DMSO	シグマ	D8418
大腸菌とnbsp;tRNA	シグマ	10109541001
エタノール	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	BP2818100	エタノールは可燃性なので注意してください
グルコース	シグマ	G7021
グリセロール	シグマ	G5516
HCl	シグマ	H1758
HEPES	シグマ	H3375
イソプロパノール	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	BP26324	イソプロポノールは慎重に扱ってください。可燃性です
KAPA HiFi HotStart Ready Mix	ロッシュ	7958889001
KCl	シグマ	P9541
コー	シグマ	221473	KOHは腐食性なので注意してください
低速真空
マグネットスタンド	ミリポール	LSKMAGS08
マスターサイクラー勾配PCRサーマルサイクラー	エッペンドルフ	5331
MgCl2	シグマ	M8266
微小球菌ヌクレアーゼ (MNase)	ウォージントン	LS004798
MinElute PCR精製キット	キアゲン	28006
ミニビーズビーダー	ミニビードビーター24ディスラプター	607
ミニ遠心分離機など;	エッペンドルフ	5424R
MnCl2	シグマ	244589
マルチプラットフォームシェーカー	フィッシャーブランド	02-217-765
マルチプラットフォームシェーカーインキュベーター	ベンチマーク	インキュシェイカー10L
マルチサーマルヒートブロック	エッペンドルフ	サーモミキサーC
N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-3-アミノプロパンスルホン酸 (タック)	シグマ	T5130	200–400のドライメッシュサイズ
NaCl	シグマ	S9888
NaOH	シグマ	S8045	NaOHは腐食性なので注意してください
NEBNext HiFi 2×PCRマスターミックス	ニューイングランド・バイオラボ	M0541
NP-40 イゲパル CA-630	サーモ・サイエンティフィック	J61055。AP
パラフォーマルドハイド	シグマ	158127	パラホルマルデヒドは可燃性で危険なので注意してください。
pA-Tn5酵素	アッドジーネ	121137
ペファブロック	シグマ	11429868001
フェノールクロロホルムイソアミルアルコールおよびnbsp;	インビトロジェン	15593049
ピペット P1000、P200、P20、P2	エッペンドルフ	2231300004
PMSF	シグマ	10837091001
プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤	シグマ	S8830
プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤	シグマ	S8830
タンパク質G-セファロースビーズ	GEヘルスケア	17-0618-02
タンパク質沈殿溶液	キアゲン	848023
タンパク質沈殿溶液	キアゲン	848023	KOHは腐食性なので注意してください
タンパク質沈殿溶液およびnbsp;	キアゲン	848023
プロテイナーゼK	シグマ	311584401
QIAquickのPCR精製キット	キアゲン	28106
RNase A	シグマ	10109169001
SDS	シグマ	L3771
分光光度計および	サーモ・サイエンティフィック。	2000/2000c
スペルミジン	シグマ	S2626
T4 DNA Pol	ニューイングランド・バイオラボ、nbsp;	M0203
卓上遠心分離機	ベックマン・カウルター	アレグラX-5
Tris	シグマ	11814273001
トリトン X-100	シグマ	T8787
酵母エキス	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	212730