このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

ヒト赤血球生成の効率をin vitroおよびex vivoで評価するための包括的なパイプライン

1.3K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/67123

⸱

2025年1月10日

 ,  , 
1Centre de Lutte contre le cancer Eugène Marquis, INSERM U1242, University of Rennes, 2Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

この記事について

サマリー

赤血球生成のモデリングは、このプロセスにおけるアクターの生物学的意義を理解し、分化欠陥を緩和する可能性のある新しい治療アプローチを評価する貴重な機会を提供します。ここでは、ex vivoでCD34+造血幹細胞と前駆細胞を効率的に分化するためのシンプルで信頼性の高い方法について説明します。

要約

赤血球生成は、赤血球の1日あたりの割り当て(1日あたり約280±200億個の細胞)を生成する非常に動的で効率的なプロセスであり、個人の健康を維持するために重要です。この経路が途切れると、重大な結果をもたらし、健康問題につながる可能性があります。世界保健機関(WHO)によると、世界人口の推定25%が貧血の症状を示しています。このプロトコルでは、臍帯血 (UCB) や健康なドナーから採取した血液などの供給源から造血幹細胞および前駆細胞 (HSPC) を使用して in vitro でヒト赤血球を生成する方法と、患者の骨髄から分離された HSPC を使用して ex vivo でヒト赤血球を生成する方法について説明します。遺伝的アプローチを用いると、HSPCで目的の遺伝子を調節することができ、赤血球生成への影響を分化プロセスのさまざまな段階でモニターすることができます。この方法により、HSPCが成熟赤血球細胞に分化する能力を攪乱、増強、または救済する化合物のスクリーニングが可能になり、赤血球の分化過程における目的遺伝子の役割を調べることができます。

概要

毎日、骨髄では約2,800億個の赤血球(RBC)が生成され、全身の酸素輸送を確保しています1。赤血球生成は、造血幹細胞から成熟した機能的な赤血球を生成する、細かく調整された分化プロセスです。後天性および先天性の両方の多くの疾患が、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、サラセミア、先天性赤血球造血性貧血など、このプロセスに影響を与える可能性があります2。

赤血球生成の破壊の臨床症状は貧血であり、世界中の罹患率の主な原因です。貧血の症状は、倦怠感、息切れ、めまいから、心不全や心停止などの生命を脅かす状態までさまざまです3。貧血は世界中で18億人が罹患しており4、これらの状態とその根底にあるメカニズムを調査するために 、生体外で 赤血球生成をモデル化することは依然として世界的な優先事項です。ここで説明する方法は、健康な赤血球分化と病気の赤血球分化の両方を研究するためのシンプルで堅牢なモデルを提供することを目的としています。このモデルにより、このプロセスにおける特定の遺伝子の役割を解剖することができ、貧血患者に利益をもたらす可能性のある化合物の試験が可能になります。歴史的に、効果のない赤血球生成のモデル化には、一部の疾患骨髄の幹細胞の不足や骨髄ニッチの模倣の困難さなど、多くの課題がありました。

以前の研究では、同様のまたはより複雑なプロトコルが使用されていました。例えば、Bonduらは、エリスロポエチン(EPO)、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン-6(IL6)などのサイトカインのカクテルを4日間使用してから、赤血球分化のカクテルからIL6を除去しましたが、Yipらは、7日間の液体培養後にのみEPOをサイトカインカクテルに添加しました。Elvarsdóttirらは、リング鉄芽球などの現象を研究するために重要な赤芽球性島や除核赤血球の生成など、赤血球細胞の最高の増殖と成熟を促進するために、CD34+細胞の3次元(3D)培養モデルを開発しました5,6,7,8.このプロトコルでは、細胞を増殖させるときに3つのサイトカイン(すなわち、SCF、トロンボポエチン[TPO]、およびFMS様チロシンキナーゼ3[FLT3])と、分化の全過程を通じて維持される3つのサイトカイン(すなわち、EPO、IGF1、およびSCF)のみを使用します。これらの異なる研究で共有される重要な基準の1つは、CD34+細胞の使用です。これらの細胞の起源はさまざまですが、これらの異なるプロトコルで一貫して使用されています。ソースは、UCBの非侵襲的な収集から、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)の動員患者または骨髄穿刺のいずれかから採取できる成人の骨髄サンプルを取得するためのより侵襲的な手順まで多岐にわたります。一般に、液体培養モデルは14日間にわたって保持されますが、3Dモデルはより長い期間にわたって細胞を維持できます。これらのプロトコルは、遺伝病や赤血球生成の混乱をモデル化するために不可欠です。ショートヘアピンRNA(shRNA)ノックダウンなどの遺伝的アプローチを用いて、目的の遺伝子をサイレンシングし、赤血球生成におけるその役割を研究することができます。その後、遺伝子サイレンシングの影響を分化のさまざまな段階で監視でき、健康と疾患の両方における貧血を研究するための赤血球産生のex vivoヒトモデルを提供します。このプロトコールには、CD34+臍帯血細胞に、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)などのレポーター遺伝子を構成的に発現するshRNAを形質導入することが含まれており、蛍光活性化セルソーティング(FACS)によってサンプルを選別することができます。その後、細胞を分化培地で2週間インキュベートし、フローサイトメトリー分析および免疫化学染色によってモニターします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

一次サンプルの研究は、機関のガイドラインに準拠して実施されました(REC参照:21/EE/0133;IRASプロジェクトID:283103)。

1.レンチウイルスの生産

注:レンチウイルスは、無菌条件下でバイオセーフティレベルL2の実験室で製造する必要があります。このラボに必要なすべてのPPEを着用する必要があります(ダブルグローブを含む)。汚染された材料は、オートクレーブされたビンに廃棄される前に、殺ウイルス剤消毒剤で除染されます。ここでは、EGFPレポーター遺伝子を保有するshRNAスクランブル(コントロール)を用いて、その過程を例示しています。

1日目

  1. ゼラチンを水浴中で37°Cで完全に溶解するまで温めます。ゼラチンをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で0.1%に希釈します。
  2. 150 mmのディッシュに2 mLの0.1%ゼラチンをコーティングします。ウイルスごとに2つの皿を使用してください。皿を37°Cで30分間インキュベートします。
  3. ゼラチンコーティングディッシュあたり500万個のHEK293T細胞を20 mLの10% Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)に播種し、細胞を37°Cのインキュベーターに入れます。

2日目

  1. 細胞が約50%のコンフルエントに達していることを確認します。トランスフェクションの2時間前に、細胞層を乱さずに22 mLの10% DMEMで培地を交換してください。
  2. トランスフェクションミックスを調製します。
    注:トランスフェクションミックスは、より多くの量がリン酸カルシウム沈殿物の形成に影響を与える可能性があるため、1皿につき1つのトランスフェクションミックスを調製します。
    1. 32 μgのプラスミド、20 μgのPAX(pCMVdR8.74)プラスミド、9 μgのVSVG(pMD.G2)プラスミドを15 mLの遠心チューブで反応ミックスを調製し、H2Oを使用して容量を最大1125 μLにします。
    2. 125 μLのCaCl2 を反応液に加え、ローラー上で室温(RT)で5分間インキュベートします。
    3. 別の15 mL遠心チューブに1.25 mLの2x HEPESを調製します。
    4. 2x HEPESを反応混合物に一滴ずつ加え、穏やかにボルテックスしながら、混合物をローラーに10分間室温で置きます。
  3. 反応液を細胞上に一滴ずつらせん状に分注し、プレートを十字型に静かに動かした後、細胞を37°Cのインキュベーターに置き、培地を均質化します。

3日目

  1. 16 mLの10% DMEMで培地を変化させず、細胞層を乱さずに交換します。

4日目

  1. 上清を採取し、4°Cで一晩保管します。細胞層を乱さずに各プレートに16 mLの新鮮なDMEMを加えます。

5日目

  1. 上澄み水を集め、4日目から上澄み水とプールします。0.45μMのフィルターでゴミを除去するフィルター。
  2. 各30 mL(4日目+ 5日目)の上清を円錐形チューブに移し、超遠心分離します。スイングバケットにチューブを追加し、必要に応じて円錐形の底にアダプターを追加します。
  3. チューブを向かい合わせに0.02 gの精度でバランスを取り、90,000 x g で4°Cで2時間超遠心分離します。
  4. 上清を捨て、チューブあたり200μLの幹細胞培地を加えます。パラフィルムでチューブを閉じ、チューブを低温室で2〜4時間攪拌しながらインキュベートします。
  5. 各ウイルスを20μLアリコートにし、バイアルを-80°Cで保存します。 各ウイルスを2 μL保持し、400 μLのDMEMを添加します。
    注:この希釈液は滴定に使用されます。

2.レンチウイルス滴定

注:レンチウイルスは、バイオセーフティレベルL2の実験室で無菌条件下で取り扱う必要があります。このラボに必要なすべてのPPEを着用する必要があります(ダブルグローブを含む)。汚染された材料は、オートクレーブされたビンに廃棄される前に、殺ウイルス剤消毒剤で除染されます。

  1. 24ウェルプレートにHEK293Tをシードします。500 μL の 10% DMEM に 50,000 細胞/ウェルを添加します。
    注:ウイルスごとに6つのウェルを使用し、形質導入されていない細胞用に1つのウェルを保持します。
  2. 形質導入を行います。ステップ 1.13 で希釈したウイルスの 2 μL、4 μL、8 μL、16 μL、32 μL、64 μL の異なるウェルを添加します。穏やかに均質化します。
  3. 24時間後に、10% DMEMを500μL加えて培地を交換します。
  4. 形質導入後4日目に、フローサイトメトリー用の細胞を調製します。
    1. PBS、2%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)、2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、および1/2,000 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)でFACS緩衝液を調製します。
    2. 上清を取り除き、500 μLのFACSバッファーをEDTAで直接各ウェルに加えます。
    3. ピペッティングで上下させて細胞を切り離します。
  5. 細胞を40μmのストレーナでろ過し、FACSチューブに移します。
  6. フローサイトメトリーによりEGFP細胞の割合を決定します。
  7. 次のゲートを設定します。
    1. DAPI対側方散乱光(SSC-A)を設定して、デッドセルを除外します。
    2. SSC 高さ (SSC-H) と SSC エリア (SSC-A) を設定して、セル集約を除外し、単一セルを選択します。
    3. 前方散乱領域(FSC-A)とSSC-A(対SSC-A)を設定して、セルをゲートし、サイズに基づいてデブリを除去します。
    4. 緑色蛍光タンパク質(GFP)とSSC-Aを比較して、GFP+ 細胞を選択します。
  8. ウイルスの力価を下げます。
    1. 各条件の粒子濃度(粒子数/mL)を計算します。
    2. EGFP細胞×希釈因子ウイルス(200)×播種細胞数×1000)÷ウイルス量
      注:例えば、細胞を1/200に希釈した64μLのウイルスで処理しました。フローサイトメトリー解析の結果、細胞の54%がEGFP+でした。これらの条件では、力価は(54% x 200 x 50 000 x 1000)/64 = 8.44 x 107 particles/mL になります。

3. 臍帯血から単離されたCD34+ 細胞の形質導入

注:この部分は無菌条件下で行われます。ここでは、CD34+ UCB細胞(純度>85%)に、eGFPレポーターを持つ1つのshRNA(コントロール)を形質導入します。実験は、3 回のテクニカルレプリケートで実行されます。比率はサンプル数に合わせて調整する必要があります。

1日目

  1. 次のメディアとバッファーを準備します。
    1. 霜取り培地を調製する:FBSに1% P/Sおよび10 μg/mL DNAseを添加
    2. FACSバッファーの調製:PBSに1% P/Sおよび2% FBS(± 10 μg/mL DNAse)を添加
    3. 150 ng/mL SCF、150 ng/mL FLT-3、10 ng/mL IL-6、25 ng/mL G-CSF、20 ng/mL TPO、および1% HEPESを添加して、刺激培地(幹細胞培地中)を調製します。
  2. 100,000個のCD34+ UCB細胞を37°Cのウォーターバスに30秒間浸漬して解凍します。 1 mLの解凍培地を各バイアルに滴下し、ピペッティングで上下させて穏やかに再懸濁します。
  3. 細胞懸濁液を合計5mLの解凍培地に一滴ずつ穏やかに移します。
    注:細胞の損失を避けるために、チップとバイアルを洗浄するために最後に使用する2mLの解凍培地のアリコートを脇に置いておきます。
  4. RTで320 x g で8分間遠心分離し、10 mLのFACSバッファー+ DNAseで細胞を洗浄します。
  5. 室温で320 x g で8分間遠心分離し、細胞ペレットを2 mLの刺激培地(刺激培地で洗浄チップとチューブ)に再懸濁します。
  6. 5 μL の細胞懸濁液と 5 μL のトリパンブルーを使用して細胞をカウントします。
    注:最小合計75,000セル(25,000セル/条件)を目指します。
  7. 2 mLの細胞懸濁液を24ウェルプレートに移し、37°Cで≥4〜6時間インキュベートします。
    注:このステップでは、すべての細胞(75,000〜100,000)が1つのウェルに播種されます。
  8. 細胞をFACSチューブに集め、幹細胞培地1mLを補充します。RTで320 x g で8分間遠心分離します。
  9. ウイルスを解凍し、必要な量の刺激媒体を30の感染多重度(MOI)で追加します。
  10. ウイルス含有培地中のペレット化した細胞を、ウイルス100μLあたり100,000細胞で96ウェルプレートの1ウェルに再懸濁します。空のウェルにPBSを添加し、37°Cで一晩インキュベートします。

2日目

  1. 150 ng/mL SCF、150 ng/mL FLT3-L、および20 ng/mL TPOを添加して、増殖培地(幹細胞培地中)を調製します。
  2. 96ウェルプレートウェルの全量の細胞懸濁液を、1 mLの幹細胞培地と共にFACSチューブに加えます。ウェルとチップを幹細胞培地で洗浄し、FACSチューブ内の細胞懸濁液に2mLの幹細胞培地を添加します。
  3. RTで320 x g で8分間遠心分離します。
  4. 上清を捨て、細胞を2 mLの増殖培地に再懸濁します。細胞懸濁液を24ウェルプレートウェルに加えます(ウェルとチップをプロセスで洗浄して、合計2 mLを得ます)。細胞を37°Cで4日間インキュベートします。
    注:その後、細胞の選別は7日目に行われます。

4. CD34+ EGFP+ 細胞選別と赤血球分化

注:この部分は無菌条件下で行われます。

  1. 次のメディアとバッファを準備します。
    注:サイトカインを含む培地は、新たに調製する必要があります。
    1. PBSに1%P/Sおよび2%FBSを添加して、FACSバッファーを調製します。
    2. 150 ng/mL SCF、150 ng/mL FLT3-L、および20 ng/mL TPOを添加して、増殖培地(幹細胞培地中)を調製します。
    3. 25 ng/mL SCF、3 U/mL EPO、および50 ng/mL IGF1を添加して、赤血球分化培地(幹細胞培地中)を調製します。
    4. 50 ng/mL SCF、6 U/mL EPO、および100 ng/mL IGF1を添加して、2倍赤血球分化培地(幹細胞培地中)を調製します。
  2. 全量の細胞を別のFACSチューブに加えます(その過程でウェルとチップを幹細胞培地で洗浄します)。RTで320 x g で8分間遠心分離し、ペレット化した細胞を100 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
  3. 5 μLのCD34 Ab/tubeを添加し、暗所4°Cで20分間インキュベートします。
  4. DAPIを含む1 mLのFACS緩衝液(FACS緩衝液で1/2000希釈)に細胞を再懸濁し、室温で320 x g で8分間遠心分離します。
  5. DAPIを含む200 μLのFACSバッファーに細胞を再懸濁し(FACSバッファーで1/2000希釈)、ソーティング前に40 μMストレーナで細胞をろ過します。
  6. 制御のためにビーズを準備します。
    1. PBS100 μL中のビーズ1滴にCD34抗体(Ab)0.5 μLを添加し、4°Cの暗所で20分間インキュベートしてください。
    2. PBSを1mL加えます。室温で320 x g で8分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を500 μLのPBSに再懸濁します。
  7. GFPコントロール用の白血病細胞株を調製します。
    注:利用可能なGFP + 細胞株をコントロールとして使用します。代わりにビーズを使用できます。
    1. GFPチューブにGFP- 細胞(100,000細胞のFACSチューブ2本)とGFP+(100,000細胞のFACSチューブ1本)を添加します。
      注:合計3本のチューブ。
    2. 細胞を1 mLのFACSバッファーで洗浄します。RTで320 x g で8分間遠心分離します。
    3. 100,000 GFP- 細胞を500 μLのFACSバッファー(未染色)に再懸濁し、100,000 GFP- 細胞を500 μLのFACSバッファーにDAPIで再懸濁(FACSバッファーで1/2000希釈)(DAPI染色)、100,000個のGFP+ 細胞を500 μLのFACSバッファー(GFP+ 細胞)に再懸濁します。
      注:コントロールチューブは、フローサイトメーターでのゲーティングおよびコンペンセーション設定に使用されます。使用する細胞が100%GFPの場合、GFP-細胞(50,000個のGFP-細胞と50,000個のGFP+細胞)をチューブに追加することができます。
    4. ソーティングする前に、40 μmストレーナで細胞をろ過します。
  8. 次のゲートを設定します。
    1. DAPI対側方散乱光(SSC-A)を設定して、デッドセルを除外します。
    2. SSC 高さと SSC 領域 (SSC-A) を設定して、セル集約を除外し、単一セルを選択します。
    3. 前方散乱領域(FSC-A)とSSC-Aを設定して、サイズに基づいて破片を除去します。
    4. GFPとSSC-Aを設定して、GFP+ 細胞を選択します。
    5. CD34 (PerCP-Cy5.5) と SSC-A を比較して、CD34+ 細胞を選択します。
  9. セルコレクションの前にコレクションFACSチューブを裏返して、チューブの壁をFBSでコーティングします。
  10. 幹細胞培地に細胞を採取します。
    注:75,000-80,000セル(25,000セル×3)を目安にしてください。
  11. 室温で320 x g で8分間遠心分離し、細胞を3 mLの赤血球分化培地に再懸濁します。
  12. 再懸濁してから、24ウェルプレートの3ウェルにウェルあたり1 mLを分注します。すべての外側のウェルをPBSで満たします。
  13. 1日おきに培地を半減させ、2倍の赤血球分化培地と交換します。
    1. 培地をリフレッシュするには、細胞がプレートの底に落ち着いていることを確認してください。プレートをそっと傾け、500μLのメディアを取り出します。
    2. 500 μLを2倍サイトカイン赤血球分化培地で追加してリフレッシュします。
    3. 6日目に細胞を12ウェルプレートに移し、1 mLの培地を加えて最終容量を2 mLにします。

5. フローサイトメトリーによる赤血球分化の解析(6日目から14日目まで週2回)

  1. 次のメディアとバッファを準備します。
    1. PBSに1% P/Sおよび2% FBSを添加することにより、FACSバッファーを調製します
    2. 25 ng/mL SCF、3 U/mL EPO、および50 ng/mL IGF1を添加して、赤血球分化培地(幹細胞培地中)を調製します。
  2. 12ウェルプレートの各ウェルから200 μLの細胞を採取し、250 μLの2x赤血球分化培地と交換します。各チューブに1 mLのFACSバッファーを加えます。
  3. RTで320 x g で8分間遠心分離し、ペレット化した細胞を100 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
  4. CD71 Ab 1 μL (1/100)、CD34 Ab 1 μL (1/100)、CD235a Ab 1 μL (1/100) を加え、4°C の暗所で 20 分間インキュベートします。
  5. DAPIを含む1 mLのFACSバッファーに細胞を再懸濁します(FACSバッファーで1/2000希釈)。RTで320 x g で8分間遠心分離します。
  6. DAPIを含む200 μLのFACSバッファーに細胞を再懸濁します(FACSバッファーで1/2000希釈)。
  7. 制御のためにビーズを準備します。
    1. 100 μL の PBS 溶液中の 2 本のチューブに 1 滴のコンペンセーションビーズを 1 滴加え、次に各チューブに 0.55 μL の 1 個の抗体を添加して、シングルステインコントロール(CD34 用に 1 つ、CD71 用に 1 つ、CD235a 用に 1 つ)を作成します。
      注意: 両方のコントロールで1滴で十分です。
    2. 暗所4°Cで20分間インキュベートします。PBSを1mL加えます。
    3. 室温で320 x g で8分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を500 μLのPBSに再懸濁します。
  8. 制御用の白血病細胞株を調製します。
    注:K562細胞はCD71マーカーを発現し、FACSを設定するためのポジティブコントロールとして使用できます。
    1. GFP- 細胞(100,000個の細胞を持つ2つのFACSチューブ)およびGFP+ (100,000個の細胞を持つ1つのFACSチューブ)細胞をFACSチューブに加えます。
    2. 細胞を1 mLのFACSバッファーで洗浄します。RTで320 x g で8分間遠心分離します。
    3. 100,000個のGFP- 細胞をFACSバッファー(未染色)、100,000個のGFP- 細胞をDAPI付きFACSバッファー(FACSバッファーで1/2000希釈)(DAPI染色)、および100,000個のGFP+ 細胞をFACSバッファー(GFP+ 細胞)に再懸濁します。
  9. 次のゲートを設定します。
    1. DAPI対側方散乱光(SSC-A)を設定して、デッドセルを除外します。
    2. SSC 高さと SSC 領域 (SSC-A) を設定して、セル集約を除外し、単一セルを選択します。
    3. 前方散乱領域(FSC-A)とSSC-Aを設定して、サイズに基づいて破片を除去します。
    4. CD235a (APC-Cy7) と CD71 (PE) を設定します。
    5. CD34 (PerCP-Cy5.5) と SSC-A を設定します。
  10. 未染色のGFP細胞 と完全染色した細胞のサンプルを分析して、細胞が正しい位置に座るように電圧を調整します。
  11. ビーズ、GFP+ 細胞、およびDAPI染色細胞を泳動します。補正し、サイトメーターの設定に補正を適用します。
  12. サンプルを実行し、イベントを記録します。

6. ギムザ染色による赤血球分化の解析

  1. スライド染色ジャーを5個調製します。
    1. May-Grünwaldのエオシン-メチレンブルー溶液1:1ストックとPBSでスライド染色ジャーを調製します。
    2. 2.5 mLのGimsaストック+50 mLのPBSでスライド染色ジャーを調製します。
    3. 蒸留水でスライド染色ジャーを準備します。
    4. PBSでスライド染色ジャーを調製します。
    5. 氷冷メタノールでスライド染色ジャーを調製します。
  2. 最適な染色のために100,000個の細胞を採取し、PBS1 mLを添加し、300 x g を5分間遠心分離します。
  3. 培地を廃棄し、150 μLのPBSに再懸濁します。
  4. スライド、濾紙、コニカルアダプターを細胞遠心分離機に調製し、細胞調製物をコニカルアダプターにゆっくりと滴下します。
  5. 800 x g で3分間遠心します。スライドを取り外し、氷の中でメタノールスライドジャーに15分間入れます。
  6. スライドをMay-Grünwald溶液に5分間浸し、時々攪拌して適切な染色を確保します。
  7. 次に、汚れが落ちなくなるまでスライドをPBSジャーに浸します。
  8. スライドをGemsa溶液に20分間浸し、時々攪拌して適切な染色を確保します。
  9. 汚れが落ちなくなるまで、スライドをPBSで慎重に浸します。
  10. スライドをさらに3分間PBSに留まらせます。
  11. スライドを蒸留水にすばやく浸し、RTで風乾します。
  12. 細胞の各スポットに合成樹脂を一滴加え、その上にカバースリップをそっと加えます。
  13. スライドをRTで1時間乾燥させ、カバースリップをマニキュアで密封して、滑りが乾燥しないようにします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

臍帯血または骨髄由来のCD34+細胞をまず解凍し、刺激し、GFP発現shRNAで形質導入します(図1A)。CD34+GFP+細胞は、図1Bに示すゲーティング戦略に従って、形質導入の4日後に選別されます。代表的な結果は、形質導入およびFACSソーティング後のCD34+細胞の成熟を示した。細胞は、(1)CD71/CD235a 9,10,11染色を用いて、成熟のさまざまな段階でフローサイトメトリーによって分析されます(図1A)。(2)顕微鏡で可視化したGemsa染色後の免疫化学による。

赤血球の分化は、CD71とCD235aの連続的な獲得に...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ここでは、成人の骨髄(BM)または臍帯血(UCB)から単離されたCD34+造血幹細胞(HSPC)の赤血球分化を誘導するための効率的で信頼性の高い方法について説明しました。このパイプラインには、赤血球分化プロセス中の任意の目的遺伝子の機能を調べるための初代細胞の編集/改変が含まれます。この方法は、健康なCD34 + HSPCおよび急性骨髄性白血病や骨髄異形成症候群などの造血悪性腫瘍における赤血球分化12,13,14,15にこれまで関連していなかった遺伝子の機能的関連性を調査するために成功裏に使用されています。赤血球分化のモデリングは、このプロセスにおける遺伝子の生物学的関連性を理解し、分化の欠陥を緩和する可能性のある新しい治療戦略をテストするための資産です。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

C.P.、S.B.、および K.RP.HARPプログラム、バーツチャリティー(G-002167)、ケイケンドール白血病基金(KKL1149)、および医学アカデミー(SBF004\1099)によって支援されました。MGG染色と顕微鏡検査の取得について、Pantelitsa Protopapa博士に感謝します。また、ロンドンのクイーンメアリー大学バーツがん研究所のフローサイトメトリーおよび顕微鏡施設も認めています。この原稿で使用された臍帯血ユニットを提供してくださった英国の慈善団体Anthony Nolanに感謝します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2x HEPESMerck51558
ビーズThermo Scientific01-2222-42
CD235a APC Cy7Biolegend349115
CD34 PerCP Cy5.5 抗体BD Biosciences347222
CD71 PE 抗体Biolegend334106
DAPI MerckD9542
DMEMThermo Scientific41966-029
DNAseMerckD4527-200KU
DPX封入剤 VWR1.00579.0500
FACSAria フュージョン BD BiosciencesNA
FBSMerckF9665
ゼラチンメルクG1393
ギムサ溶液Abcamab150670
HEPESメルクH0887-100mL
ヒト EPOPeproTech100-64
ヒト Flt-3 リガンドPeproTech300-19
ヒト G-CSFPeproTech300-23
ヒト IGF1PeproTech100-11
ヒト IL-6PeproTech200-06
ヒト SCFPeproTech300-07
ヒト TPOPeproTechAF-300-18
LSRFortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesNA
May-Grunwaldソリューション Generon26250-01
Pannoramic 250 ハイスループットスキャナー 3DHISTECHNA
ペニシリン/ストレプトマイシンThermo Scientific15140-122
Shandon Cytospin 3 Thermo ScientificNA
幹細胞培地 培地幹細胞技術9655

参考文献

  1. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).
  2. Cazzola, M. Ineffective erythropoiesis and its treatment. Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).
  3. Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. The pathological consequences of anaemia. Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).
  4. Safiri, S., et al. Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019. J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).
  5. Bondu, S., et al. A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome. Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).
  6. Elvarsdottir, E. M., et al. A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes. Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).
  7. Yip, B. H., et al. Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts. Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).
  8. Clough, C. A., et al. Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome. Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).
  9. Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).
  10. Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development. Blood. 69 (1), 255-263 (1987).
  11. Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens. Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).
  12. Berastegui, N., et al. The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes. Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).
  13. Mian, S. A., et al. Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia. Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).
  14. Armes, H., et al. Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment. Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).
  15. Hug, N., et al. A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation. RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

CD34V
ヒト赤血球生成の効率をin vitroおよびex vivoで評価するための包括的なパイプライン
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。