微生物学的サンプルのBergmeyerグルコース定量(英語)

Summary

Bergmeyerの血糖定量はブドウ糖の量を正確そして敏感に測定する臨床テストのために主に使用される分光光度法の酵素技術である。ここでは、この方法を微生物学的サンプルに使用するためのプロトコルを示します。

Abstract

グルコース濃度は細胞代謝の重要な指標であり、総代謝率、グルコース代謝の異常、場合によっては細胞がグルコース代謝をエネルギー代謝にどのように結合するかを示している可能性があります。さらに、細胞内および細胞外のグルコースレベルは、細胞の代謝状態を示しています。Bergmeyerグルコース定量法などの酵素技術は、ジニトロサリチル酸や蛍光法など、通常微生物学で利用される他の技術よりも正確で感度が高いです。Bergmeyerのグルコース定量は主に臨床領域で使用されますが、どの細胞にも適用できますが、細菌、真菌、酵母、またはその他の微生物については詳細に報告されていません。

ここでは、酵素的Bergmeyerグルコース定量法を使用して、細菌および酵母サンプルからのグルコースを定量する方法を紹介します。この手順では、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、 およびo-ジアニシジン二塩酸塩の酵素を37°Cで20分間インキュベートした後、硫酸を添加しました。次に、吸光度を545nmで測定します。この手法では高濃度のグルコース(60 g/L以上)の測定は困難ですが、希釈係数を使用して50 g/L未満の濃度を測定することが可能であることを強調することが重要です。この酵素的アプローチは、微生物学やその他の科学分野の研究や分析に有用です。この分析法の精度と感度は、微生物学的サンプル中の低濃度のグルコースの検出にも役立ちます。

Introduction

グルコースは、バクテリア、酵母、真菌など、多くの微生物の主要なエネルギー源および炭素源として機能します。これらの微生物は、細胞外膜上に位置するトランスポーターを介してグルコースを取り込み、解糖代謝経路内で一連の生化学反応を起こしてピルビン酸¹に変換します。グルコースなどの還元糖の定量化にはさまざまな手法があります。例えば、ベネディクト試薬²、3,5−ジニトロサリチル酸(DNS)^3,4、アントロナ法⁵、またはフェノール硫酸⁶法を用いることができる。ただし、これらの方法では、フルクトースやマルトースなど、サンプル中に存在する還元糖が検出されるため、シグナルに寄与し、特定の糖の正確な定量が複雑になる可能性があります。

さらに、厳格な温度管理と有害物質の取り扱いが必要であり、プロセスが複雑になり、精度に影響を与える可能性があります。これらの方法は、サンプル中に存在する他の化合物からの干渉を受ける可能性もあり、正確なグルコース定量が困難になります。逆に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、より正確な代替手段を提供し、グルコースと他の還元糖を区別することができますが、運用コストは高くなります。これらの対照的な方法は、正確で費用対効果の高いグルコース定量技術の開発に対する継続的な必要性を強調しています⁷。

グルコースオキシダーゼ-ペルオキシダーゼ-硫酸(GOX-H₂SO₄)法は、グルコースオキシダーゼ(GOD)とペルオキシダーゼ(POD)の2つの酵素を使用します。GODは、β-D-グルコース⁸の酸化に非常に選択的な酸化還元酵素です。この錯体は、グルコースが酸素の存在下にあるときに発生する反応中に触媒として作用し、グルコン酸と過酸化水素(H₂O₂)を生成します。H₂O₂ は、発色性酸素受容体である o-ジアニシジンによって検出され、PODとの相互作用により、その酸化とH₂O₂ の放出を引き起こし、グルコン酸がグルコースに戻るのを防ぎます( 図1を参照)。得られる色は、硫酸(H₂SO₄)の添加によって安定化され、これも酵素反応を停止し、したがって、反応が継続する場合に起こり得る干渉を回避する⁹。

図1:グルコースオキシダーゼ酵素を用いたグルコース定量法の概要 。グルコースと反応して過酸化水素(H₂O₂)とグルコン酸を生成する方法。続いて、ペルオキシダーゼ酵素は、O-ジアニシジン二塩酸塩の存在下でH₂O₂ と反応する。最終ステップでは、硫酸(H₂SO₄)を添加して酵素反応を停止し、529nmで測定されるピンク色になります。略語:POD =ペルオキシダーゼ;GOD = グルコースオキシダーゼ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

GOX-H₂SO₄ 酵素法は、生物学的サンプル中のグルコース濃度を測定するために広く使用されている技術であり、そのほとんどは臨床的に興味深いものです。しかし、成長培地中のグルコース量を定量化してその消費量を評価できる手法を調査した研究はほとんどありません。したがって、本プロトコルでは、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、 o-ジアニシジン二塩酸塩、および微生物液体サンプル中のH₂SO₄ の酵素反応によってグルコースを定量する方法論が提示され、これはBergmeyer⁹によって行われた作業の修正として生じます、50%(v / v)H₂SO₄ およびそれより少量の試薬を使用することによって。

Protocol

1. 溶液の調製

1. 100 mLの0.1 Mリン酸緩衝液を調製します。1.28gのリン酸二水素カリウム(KH₂PO₄)と0.1304gのリン酸二カリウム(K₂HPO₄)を秤量し、ガラスビーカーに加えます。次に、70 mLの脱イオン水(H₂Odi)を加え、1 M塩酸(HCl)または水酸化カリウム(KOH)を使用してpHを5.5に調整します。溶液をメスフラスコに移し、最終容量を100mLに調整します。次に、溶液を琥珀色の容器に移し、溶液を4〜8°Cで最大3か月間保存します。
   注意:o-ジアニシジン二塩酸塩は発がん性がある可能性があるため、皮膚への接触や潜在的な汚染を防ぐために、準備プロセス全体を通してニトリル手袋を着用してください。
2. o-ジアニシジン二塩酸塩の1%w / v溶液を調製します。0.01 gのo-ジアニシジン二塩酸塩を秤量し、2.0 mLの遠心チューブに入れます。.1,000mLのマイクロピペットでH₂Odiを1.0mL加えて化合物を溶解し、ピペッティングで上下させてゆっくりと混合します。容器をアルミホイルで包んで溶液を光から保護し、安定性を維持するために-20°Cで保管します。
   注:分析天びんの測定中にチューブのサポートを容易にするために、10 mLビーカーを追加のサポートとして使用できます。これにより、チューブが安定し、天びんの結果に影響を与える可能性のある変位や傾きのリスクを最小限に抑えることで、正確な測定が保証されます。
3. 100 mLメスフラスコに、10 mLのリン酸緩衝液を加え、続いて1 mLの1% v / v o-ジアニシジン二塩酸塩溶液を加えます。.次に、リン酸緩衝液を使用して最終容量を100 mLに調整し、最終濃度0.01% のo-ジアニシジン-緩衝液混合物を得ます。溶液を琥珀色のフラスコに移し、アルミホイルで包んで光から保護します。溶液を4〜8°Cで最大3〜4か月間保存します。
   注:分解を防ぐためには冷蔵が不可欠であり、実験測定の完全性が損なわれる可能性があります。 o-ジアニシジン-緩衝液混合物の劣化を避けるため、13 mLの少量(12サンプル分)を氷上の14 mLプラスチックチューブに入れて使用します。
4. 50%H₂SO₄ 溶液を調製します。100 mLのメスフラスコと30 mLのH₂Odiを氷浴に入れ、10分間冷まします。次に、51 mLのH₂SO₄ (98% v / v)をフラスコの壁にゆっくりと注ぎ、慎重に振とうして溶液を均質化します。反応は発熱性(熱を発生)するため、混合物が冷えるのを待ちます。H₂Odiで最終容量を100 mLに調整し、溶液をガラス製の琥珀色のフラスコに移します。
   注意: ドラフトを使用し、すべての安全プロトコルに従い、適切な保護具を着用してください。50 mLの40%炭酸カルシウム溶液を準備して、発生する可能性のあるこぼれを中和します。.
5. 0.04 gの酢酸ナトリウムを5 mLのH₂Odiビーカーに溶解して、50 mM酢酸ナトリウム溶液を調製します。氷酢酸を使用してpHを5.1に調整します。最後に、H₂Odiで容量を10 mLに調整します。

2. 酵素の調製

1. 2.0 mLの滅菌マイクロチューブで、0.01 gのグルコースオキシダーゼを秤量し、1 mLの50 mM酢酸ナトリウム(pH 5.0)と混合して、最終濃度10 mg/mLを得ます。チューブをアルミホイルで覆い、-20°Cで保管します。
   注:溶液は-20°Cで最大2か月間保存できます。
2. 式(1)を使用して、各プラスチックキュベット(総容量1.5 mL)で目的の酵素活性を達成するために必要な酵素溶液V₂の量を計算します:V₁C₁ = V₂C₂、ここで、V₁は1,500 μL、C₁は28.5 Uの酵素活性、C₂(酵素溶液の濃度)は12,970 U / mL(1 mL中の酵素[129,000ユニット/ g]の10 mg)ですH₂Odiの)。
   V₂ = (1,500 μL × 28.5 U)/12,970 U = 3.29 μL (1)
   注:より正確なピペッティングのために、値を3.3 μLに丸めることができます。
3. 新しい2 mLマイクロチューブに0.0031 gのペルオキシダーゼ酵素を秤量し、1 mLのリン酸緩衝液(pH 5.5)を添加して、最終濃度3.1 mg/mLにします。マイクロチューブをアルミホイルで覆い、-20°Cで保管します。
4. 式(1)を使用して、キュベットあたりの所望の酵素活性を達成するために必要なペルオキシダーゼ溶液の量を計算します。キュベットの総容量が1,500 μLで、標的酵素活性が1.25 Uであることから始めます。次に、酵素溶液の濃度が1,551 Uの場合、必要な容量を決定します。
   V₂ = (1,500 μL × 1.25 U)/1,551 U = 1.208 μL
   注:より正確なピペッティングのために、値を 1.20 μL に四捨五入しました。

3.グルコーススタンダード

1. 0.01 g の D-グルコースを 10 mL の H₂Odi にメスフラスコで加えて、1 g/L の D-グルコース標準試料を調製します。濃度を0.5 g/Lに希釈するには、500 μLのストック溶液を取り、500 μLのH₂Odiと混合して、最終容量1 mLにします。
   注:この希釈プロセスは、正確な標準溶液を作成するために不可欠です。

4. 標準曲線の準備

1. 新しい2 mLマイクロチューブを使用して、 表1に示す緩衝液とグルコース容量を添加します。
2. 乾式温浴を37°Cに設定します。 温度が安定したら、すべてのチューブに3.3μLのグルコースオキシダーゼを加え、次に各チューブに1.2μLのペルオキシダーゼを加えます。チューブを37°Cで20分間インキュベートします。
3. インキュベーション後、直ちに750 μLの50% H₂SO₄ (v/v)を各マイクロチューブに加え、氷浴で2分間冷却します。これにより、最終容量は1,500μLになります。最後に、溶液をプラスチックキュベットに移し、529nmでの吸光度を測定します。

表1:GOX-H₂SO₄ 法のグルコース検量線。 略語:GOD =グルコースオキシダーゼ;POD =ペルオキシダーゼ;H₂SO₄ =硫酸。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

5. 微生物学的サンプルの試験

1. サンプルは、液体培地で細菌または酵母を培養し、温度、撹拌速度、インキュベーション時間などの特定の条件下で増殖させることにより、サンプルを取得します。培養物が所望の光学濃度(OD)または細胞濃度に達したら、さらなる処理のために培養物を回収します。
   注:Pseudomonas reptilivoraは300rpmおよび28°Cの一定の攪拌速度で培養されましたが、 Debaryomyces hanseniiはオービタルシェーカーで30°Cで200rpmの攪拌速度で培養されました。 D. hanseniiの特定のケースでは、食用キャノーラ油もリパーゼ産生の誘導剤として使用されました。
2. バイオセーフティプロトコルに従って、70%アルコール溶液または適切な洗浄剤で作業エリアを清掃します。無菌を確保するためにバーナーを点灯します。
3. 滅菌チップを使用して、100 μLの培地を1.5 mLまたは2 mLのマイクロチューブに移します。
4. サンプルを7,500 × g 、4°Cで7分間、または10,000 × g で7分間、温度制御なしで遠心分離します。遠心分離後、溶液中にグルコースを含む上清を慎重に取り除き、ペレットを廃棄します。
5. 0.5 μLの上清を1〜20 g / Lの範囲のグルコース濃度に使用し、749.5 μLの o-ジアニシジン緩衝液、3.3 μLのGOD、1.2 μLのPODと混合します。.ステップ4.2で詳述したように、マイクロチューブを37°Cで20分間インキュベートし、すぐに750μLの50%H₂SO₄ を加え、氷浴で2分間冷まします。
   1. 濃度が20 g/Lを超える場合は、滅菌済みのH₂Odiで1:1に希釈してから行ってください。
   2. 上清サンプルが以前に-80°Cまたは-20°Cで凍結されていた場合は、室温で解凍し、使用前に30秒間渦巻きで解凍します。希釈が必要な場合は、滅菌済みのH₂Odiを使用してください。
   3. グルコース濃度が30 g/Lを超えるサンプルの場合は、滅菌済みのH₂Odiで1:1の希釈を行うと、希釈係数は2になります。
6. スプレッドシートプログラムの式(2)を使用して、各サンプルの総グルコース濃度を計算します。
   (2)
   どこ：
   x = グルコース濃度 (g/L) δ = 最終反応量 (0.0015 L)
   y = 吸光度 M.S. = 使用したサンプルの量*
   注: b 値と m 値は、分析法の検量線のトレンドラインをモデル化する式(y = mx + b)からのものです。*M.S.値は、対応する希釈で比率を得るために使用したサンプルの量に基づいている必要があります(つまり、上清を0.5μL摂取した場合、M.S. = 0.0000005 L = 0.5 × ^10-6 L)。希釈係数(DF)を使用する場合は、得られた吸光度にDFを掛けます。
   たとえば、吸光度 0.5 が得られ、自由度 2 を使用した場合、結果は 1.0 になります。したがって、y = 1.0 であり、この値は前述のように式 (2) に入力する必要があります。

6. 解析的検証

1. GOX-H₂SO₄ メソッドの分析的検証パラメーターを、National Metrology Center と Mexican Accreditation^{Entity 10} (CENAM-ema) によって確立されたものに従って計算します。
   1. 精度は、変動係数のパーセンテージ、つまり %CV = (S/x) × 100 で計算します。ここで、 x はサンプルグループの平均、 S は標準偏差で、許容値は ≤10% です。
   2. 0.995 を超える線形モデル R² に標準曲線を近似して、線形性を決定します。
   3. LOQ = yB + 10sB の式を使用して定量限界(LOQ)を計算します。ここで、yB はターゲットシグナルと同等のシグナルを生成する分析種の濃度を表し、10sB はブランクの標準偏差の 10 倍を示します
   4. 次の式を使用して系統誤差を計算します:傾斜= x - m、ここでx =実験濃度の平均、mは理論濃度です。
   5. 実際の値と理論値の間の一致度として精度を決定します。
      回復率 = (CR/CV) × 100
      ここで、CRは実験濃度の平均であり、CVは理論濃度の変動係数です。

7. 他の還元性糖による干渉

1. 0.5 g/L ストック溶液から得られたグルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロースの 4 つの還元糖を別々に評価します。さらに、ネガティブコントロールとしてトレハロースを使用します。すべてのサンプルのプロトコルに従い、545nmと529nmの吸光度を測定します。

Results

GOX-H₂SO₄の分光光度分析では、529 nm(λmax)で単一の最大吸光度(λmax)が明らかになり(図2A)、545 nmで追加の吸光度値が観察されました。異なるグルコース濃度での吸光度値を分析することにより、λ529 nmで0.9977、λ545 nmで0.9967の線形性(R²)が得られました(図2B)。特定の範囲内での直線性とは、サンプル中のグルコース濃度に正比例した結果を提供する能力を指します。これは、0 から 1.0 の吸光度範囲内の回帰モデル (図 2A) の精度を反映する決定係数を使用して評価されました。

Discussion

グルコースは多くの微生物の主要なエネルギー源として機能するため、微生物の増殖と代謝活性を理解するためには、培地中のグルコースの定量化が不可欠です。本研究では、GOX-H₂SO₄法を用いて培地中のグルコースレベルを正確に測定し、細菌や酵母の発酵における微生物プロセスの最適化を目指しました。私たちの調査結果は、YuenとMcNeillの調査結果と一致しています¹¹。ただし、それらとは異なり、私たちの調査結果は、より高いグルコースレベルで測定値が正確であることを示しています。実験の重要なステップは、POD溶液をチューブに追加した後のタイミングです。追加は正確である必要があります。H₂SO₄を添加せずに反応時間が37°Cで25分を超えると、Bergmeyer⁹が指摘しているように、読み取りが不正確になる可能性があります。したがって、GOX-H₂SO₄法に...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mLマイクロチューブ	エッペンドルフ	-	-
2.0 mL マイクロチューブ	エッペンドルフ	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	炭酸カルシウム
D-グルコース	Meyer	50-99-7	D-グルコース
ドライバス	フィッシャーサイエンティフィック	11-718-4	シリアル911NO251。ブロック幅×奥行×高さ mm/インチ: 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5
グルコースオキシダーゼ	シグマ アルドリッチ	G6125-50KU	酵素粉末
H2O	-		脱イオン水
H2SO4	>Meyer	7664-93-9	硫酸
HCl	Meyer	7647-01-0	塩酸
K2HPO4	>Meyer	7758-11-4	リン酸二カリウム
KH2PO4	>Meyer	7778-77-0	リン酸一カリウム
KOH	Meyer	1310-58-3	水酸化カリウム
Lambda 35	PerkinElmer	-	分光光度計
マイクロチューブ遠心分離機	-		-
-o-ジアニシジン二塩酸塩	シグマアルドリッチ	D3252	発色ペル
オキシダーゼ	シグマアルドリッチ	P8125-50KU	酵素粉末
pHメーター	ハンナ	1131	ハンナ1170
酢酸ナトリウム	マ	イヤー127-09-3	マイヤー
計量ヘラ	-	-