蚊の微生物群集は、ベクターバイオコントロール戦略に大きな期待を寄せています。ほとんどの共生生物は培養不可能であり、メタゲノム解析が必要です。雌の蚊を解剖し、卵巣、中腸、唾液腺を分離して交差汚染を防ぎ、臓器レベルでのマイクロバイオーム研究を促進し、蚊の生物学における微生物の役割の理解を深める方法について説明します。
この記事について
サマリー
要約
マラリア、デング熱、西ナイル熱、ジカ熱、ウストゥ熱、黄熱病など、蚊が媒介する病気の世界的な負担は増加し続けており、公衆衛生上の重大な脅威となっています。殺虫剤耐性の増加と効果的なワクチンの欠如により、蚊の微生物叢に焦点を当てた新しい戦略が出現しています。それにもかかわらず、共生生物の大部分は栽培に抵抗性のままです。したがって、蚊標本における細菌ゲノムの多様性と機能を特徴付けるには、メタゲノミクスとその後のアセンブルおよびビニング戦略に依存しています。分離した臓器からメタゲノム集合ゲノム(MAG)を取得し、解析することで、卵巣(生殖器官)、中腸(食物の消化と免疫の鍵)、または唾液腺(病原体が唾液に入り、血流に到達するためには病原体が媒介性疾患に定着する必要があるため、ベクター媒介性疾患の伝染に不可欠)における蚊に関連する微生物の特定の役割に関する重要な情報を特に提供できます。これらの新たに再構築されたゲノムは、新しいベクターバイオコントロール戦略の開発への道を開くことができる。この目的のためには、蚊の臓器間や他の蚊の臓器に存在する微生物との相互汚染を避けながら、蚊の臓器を隔離する必要があります。ここでは、臓器レベルで蚊のマイクロバイオームを研究するための最適化された汚染のない解剖プロトコルについて説明します。
概要
蚊は、病気の原因となるさまざまな病原体を拡散し、公衆衛生にとって深刻な脅威となっています。蚊の集団における殺虫剤耐性の有病率の増加と、これらの病原体に対する効果的なワクチンがないため、蚊のマイクロバイオームに焦点を当てた新しい生物防除方法が登場しています。特に、病原体の伝播を妨害し、宿主の繁殖を操作する可能性のある細胞内細菌ボルバキアは際立っています1,2,3。さらに、他の蚊の共生生物は、宿主の生存、発達、または免疫系、ならびに病原体の感染と伝染の中心であり、媒介生物が媒介する病気と戦うためのそれらの利用に大きな期待を示しています4,5,6,7,8。
蚊に関連する微生物は、微生物生命のすべての領域(細菌、真核生物、真菌を含む)にまたがり、宿主と密接に相互作用するだけでなく、異なる体区画内で互いに相互作用する9,10。したがって、微生物叢、その潜在的な季節変動11、およびそのメンバーが異なる蚊組織で直接相互作用するメカニズムをよりよく理解することは、新しい標的生物防除方法の開発や既存の方法の改善に役立ちます。しかし、共生生物の大部分は栽培に抵抗性があり、その特性評価は不可能です。
第2世代および第3世代のシーケンシング法の出現は、最先端のアセンブリおよびビニングアプローチとともに、微生物ゲノムの再構築と、培養不可能な微生物の多様性と機能的可能性へのアクセスを可能にしました。ここでは、雌の蚊の卵巣、中腸、および唾液腺を交差汚染を防ぎながら解剖する方法を紹介します。このプロトコルに続いて、ゲノムDNA抽出とそれに続くメタバーコーディングまたはショットガンメタゲノムシーケンシングを行い、臓器レベルでの蚊の微生物叢の多様性と機能を調査することができます。ここでは、 Culex spp.標本の蚊の解剖とマイクロバイオームデータの例を提供しますが、このプロトコルは ハマダラカ や ネッタイシマカなどの他の属のベクターに拡張できます。
プロトコル
注: 図1 は、プロトコルのさまざまなステップをまとめたメソッドの概略図を示しています。
1. 材料の準備
- 実験を開始する前に、0.5%の活性塩素を含む漂白剤溶液(世界保健機関が推奨)を準備して、機器と作業台を消毒します。
- 900 mLの水に、それぞれ1.5 gの活性塩素を含む3つの可溶性錠剤を溶解します。.錠剤が完全に溶解し、0.5%漂白剤溶液が得られるまで15分待ちます。.
- 0.5%漂白剤溶液をスプレーボトルに入れます。次に、顕微鏡スライドやワークベンチを含むすべての解剖装置に溶液をスプレーします。
注意: 機器と作業台は、使用前に~10分間乾燥させる必要があります。
- サンプルが外部細菌に汚染されるのを防ぐために、各解剖前に蚊をすすぐために、新たに滅菌した1.5 mLチューブを4本準備します:2本は96%エタノールを含み、他の2本は1x PBSバッファー(リン酸緩衝生理食塩水)を含みます。
- 各蚊の解剖後にサンプルを保存するためのチューブを準備します:4本の1.5 mL滅菌チューブ、それぞれに100 μLの保存バッファーが含まれています。
注:唾液腺用に1本、卵巣用に1本、中腸用に1本、蚊の死骸用に1本を準備します。
2.蚊のコレクション
- 成人女性の個体を収集し、表面滅菌まで(野外または実験室から、4〜7日間)生きたままにします。
3.蚊の表面滅菌
注:鉗子と針を清掃し、各臓器と個々の間に新しい滅菌チューブを使用します。漂白剤が利用できない場合は、各個人の解剖と臓器の間の解剖鉗子と針を徹底的に火炎滅菌して、生物学的物質の相互汚染を防ぐようにしてください。解剖器具は、次の使用前に、漂白剤/エタノールの残留物がなく、乾燥している必要があります。
- 女性がアルコールにさらされたときに腸の内容物を空にしないように、氷の上または-20°Cの冷凍庫で冷え麻酔をかけます(組織や臓器が凍結しないように4分間)。
- 個々の蚊を、1 mLの96%エタノールを含む新しい滅菌済み1.5 mLチューブに移します。30秒間穏やかに(手動で)渦巻きます(チューブ内で蚊をよく振って、昆虫の表面の鱗屑と潜在的な細菌汚染物質を取り除きます)。エタノールを含むチューブを使用して2回すすいでください。
- 蚊を滅菌した新しい1.5 mLチューブに移し、1 mLの滅菌済み1x PBS溶液を入れ、30秒間穏やかに(手動で)ボルテックスします(エタノールによるDNA沈殿を避けるため)。滅菌された1x PBSを含むチューブを使用して2回すすいでください。
4.蚊の解剖
- 滅菌済みの1x PBSの小さな滴をスライドに数滴垂らして、蚊の配置と解剖された臓器のすすぎを容易にします。
注:滅菌PBSの滴は、蚊の臓器を収容するのに十分な大きさである必要があります。 - 洗浄した蚊を取り、顕微鏡スライド上の滅菌1x PBSの滴の上に置きます。
- 以下に説明するように、滅菌した鉗子と針で唾液腺を解剖します。.
- 蚊の胸部をピンセットで押さえて、蚊が動かないようにします。次に、首の頭の下に針を置き、蚊の頭をそっと引っ張って胸部から分離します。
注:唾液腺は胸部上部にあり、唾液管によって頭部に接続されています。解剖中は、胸部から唾液腺を引っ張ると唾液腺が頭に付いてくるため、この管を壊さないことが重要です。これが、凍った蚊ではなく、新鮮な蚊を飼うことが重要である理由です。 - 頭が胸部から離れると、それぞれが3つの葉で構成される2つの唾液腺が出現するのを観察します。唾液管の高さで唾液腺を切断し、針で回収し、滅菌済みの1x PBSの新しい滴に入れてすすぎ、臓器間の汚染を防ぎます。
- 針を使用して唾液腺を回収し、100 μLの保存バッファーを含む新しい滅菌チューブに入れます。
- 蚊の胸部をピンセットで押さえて、蚊が動かないようにします。次に、首の頭の下に針を置き、蚊の頭をそっと引っ張って胸部から分離します。
- 次のように、滅菌した鉗子と針で卵巣を解剖します。
- 蚊を背中に置きます。鉗子を使用して蚊を胸部に保持し、解剖中の動きを防ぎ、3番目の腹部セグメント(下から開始)を針で穿刺します。
注:必要に応じて、解剖を容易にするために蚊の脚と羽を取り除きます。 - 腹部の3つ目の部分にピアスを開けながら、腹部を引き下げて開いて内臓を露出させます。臓器の放出を促進するために、蚊の外骨格の残りの部分をすべて取り除きます。
注:腸、マルピーギ尿細管、卵巣などの腹部の臓器が見えます。 - 滅菌した鉗子で両方の卵巣を取り出し、顕微鏡スライド上の新しい滅菌1x PBSの滴に入れてすすぎます。卵巣をつかみ、100 μLの保存バッファーを入れた1.5 mLチューブに入れます。
- 蚊を背中に置きます。鉗子を使用して蚊を胸部に保持し、解剖中の動きを防ぎ、3番目の腹部セグメント(下から開始)を針で穿刺します。
- 腹部が開き、臓器が露出したので、新しい滅菌鉗子および/または針で中腸を回収します。
- 中腸を前腸と後腸から分離します。次に、マルピーギ尿細管を中腸から取り出します。滅菌針を使用して中腸をつかみ、新しい滅菌1x PBSドロップに置いてすすぎ、臓器間汚染を防ぎます。
- 新しい滅菌1x PBSドロップに移します。鉗子で中腸を開き、 補足ファイル1に記載されているように細菌を解放して濃縮します。鉗子で中腸をつかみ、バクテリアを含むすべてのPBSをピペットで動かして、100μLの保存バッファーを備えた新しい滅菌済み1.5mLチューブに全材料(液体と組織)を保存します。
- 顕微鏡スライドの以前に使用した場所に1x PBSを5 μL再度加え、PBSを同じ1.5 mLチューブに直接ピペットで戻して、顕微鏡スライドに付着した可能性のある細菌を回収します。
- 滅菌鉗子を使用して死体(残りの体)をつかみ、100μLの保存バッファーを含む新しい滅菌済み1.5mLチューブに保存します。
- さらなる処理までの材料の保管
- チューブに「種、臓器、日付、研究者の名前」のラベルを付けます。
- 解剖した卵巣、中腸、唾液腺、および死体は、処理が完了するまで-20°Cで保存してください。
- サンプルに関連するすべてのメタデータ(種(または属レベルのみ)、収集日、国、州、緯度、経度、解剖を行った人の名前、妊娠女性かどうか、血粉かどうかなど、サンプルに関連するすべてのメタデータをスプレッドシートで追跡します。
結果
x'Mosquitoの解剖
プロトコルに従って、実験室のコロニーから2つのCulex pipiens molestus標本(妊娠した女性を含む)から卵巣、中腸、唾液腺、および死体を収集して分離しました。双眼鏡の下には破片が残っていない全臓器(つまり、壊れていない臓器)と十分に隔離された臓器を観察した後、きれいな解剖を確認しました。図2に、Culex pipiens molestus標本の全身、頭部、胸部、解剖された唾液腺、卵巣、および中腸が示されています。予想通り、中腸腺と唾液腺は蚊の卵巣よりも桁違いに小さかった。妊娠したCulex標本の卵子は、その中腸とマルピーギの尿細管とともに、図3に示されています。注目すべきは、材料が新鮮でなく、組織が壊れる可能性が高い場合、解剖は失敗する傾向があることです(図4B、C)。したがって、組織はまだ弾力性があるため、可能な限り収集後すぐに(12時間以内)に材料を解剖することをお勧めします(図4A)。同様に、凍結した物質の解剖も行うことができますが、壊れやすい組織のために臓器間の故障や交差汚染のリスクがはるかに高くなります(図4)。
マイクロバイオームデータ
さらに、ニューカレドニアのヌメアから3つの個々の Culex quinquefasciatus 標本から、同じ手順に従って中腸と卵巣を採取し、分離しました。各臓器からDNAを抽出し、全ゲノムシーケンシング用のサンプルを調製し、 補足ファイル1に詳述されているようにマイクロバイオームデータ解析を行いました。PhyloFlash12 を用いたアセンブルされていない品質フィルタリングされたショートリードの細菌分類学的多様性解析では、卵巣と比較して中腸の優性分類群が明確であることが示されました(図5A)。特に、卵巣細菌群集は ボルバキアによって優勢であり、個々の3の卵巣に Spirochaetaceae 系統型が追加で存在し、一方、中腸群集はGammaproteobacteria、 Spirochaetaceae、Firmicutesなど、より広い多様性を示しました。同じシーケンシングデータから、スピロケティア、アルファ、ガンマプロテオバクテリアのクラスに属する4つのメタゲノムアセンブルゲノム(MAG)を再構築しました(表1)>、完了率は80%、<冗長性は5%でした(表1)。
予想通り、本明細書で再構成されたMAGは、メタゲノムショートリードを用いたゲノム再構成の特定の欠点のために、PhyloFlashの結果によって予測された完全な分類学的多様性をカバーしていなかった。ボルバキアに割り当てられたMAG(表1のMAG 3を参照)は、すべての卵巣と2つの中腸で検出され、卵巣でより高いカバレッジを示しました(図5B)。また、腸内細菌科に属する2つのMAG、Pantoea属(表1のMAG 1および2を参照)を、対応する卵巣では検出されなかったCulex個体2および3から得られた中腸で再構築しました(図5B)。最後に、Graña-MiragliaらによってCulex pipiensの中腸から単離されたBR149属に割り当てられたSpirochaetaceae細菌ゲノムの1つであるRef.MAG 4(表1)も再構築しました13。興味深いことに、このMAGは、個体1と3の中腸、および個体3の卵巣で検出されました(図5B)。
図1:さまざまなステップをまとめた方法の概略図。 材料の準備、蚊の収集、蚊のクリーニング、蚊の解剖、および保管。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2: Culex pipiens molestus の女性。 (A)全身。(B)頭部および胸部。(C)解剖された唾液腺。 (D)解離した卵巣。 (E)マルピーギ尿細管で解剖された腸。スケールバー = 500 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:妊娠した Culex pipiens molestus の女性の解剖された腹部。 標本の前腸、中腸、後腸、マルピーギ尿細管、および卵が示されています。赤いダッシュは、中腸を前腸と後腸から分離するためにカットする場所を示しています。スケールバー = 500 μm. 略語: F = フォアガット;M =中腸;H =後腸;E =卵;MT = マルピーギ尿細管。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:新鮮および冷凍の Culex 蚊標本の解剖。 白い長方形は、(A)解剖したばかりの標本から無傷の臓器を持つ蚊の組織と、(B、C)解剖前に凍結された標本の壊れた生物学的物質を示しています。スケールバー = 720 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5: 3人のCulex quinquefasciatus 個体のマイクロバイオーム分析の例。 (A)3つの標本の中腸と卵巣におけるPhyloFlash12 によるSSU rRNAリードの抽出による細菌の多様性の可視化。(B)サンプル上の再構築されたMAGの平均カバレッジ。略語:MAG =メタゲノムアセンブルゲノム;ind = 個。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| マグ | リファレンスMAG 4 | 参照MAG 2 | 参照MAG 1 | リファレンスMAG 3 |
| 長さ(bp) | 1,287,790 | 4,910,866 | 4,751,276 | 1,298,266 |
| コンティグの数 | 9 | 162 | 149 | 123 |
| GCの% | 34.05 | 55.45 | 54.05 | 34.15 |
| 完了率 (%) | 84.5 | 97.18 | 98.59 | 91.55 |
| 冗長性 (%) | 0 | 2.82 | 4.22 | 0 |
| ドメイン | 細菌 | 細菌 | 細菌 | 細菌 |
| 門 | スピロケトータ | プロテオバクテリア | プロテオバクテリア | プロテオバクテリア |
| クラス | スピロケティア | ガンマプロテオバクテリア | ガンマプロテオバクテリア | アルファプロテオバクテリア |
| 命令 | WRBN01 | 腸内細菌 | 腸内細菌 | リケッチアレス |
| 家族 | WRBN01 | 腸内細菌科 | 腸内細菌科 | アナプラズマ科 |
| 属 | BR149 | パントエア | - | ボルバキア |
表1:3つの Culex quinquefasciatus 個体からの再構築MAG。 ゲノムサイズ、コンティグ数、GCの割合、完了の推定値、およびAnvi'o17 で利用可能なシングルコピーコア遺伝子コレクションとGTDB18を使用して得られた分類法に基づく冗長性。
補足ファイル1: サンプル収集、DNA抽出、全ゲノムシーケンシングから始まるマイクロバイオームデータ解析の詳細な手順例と、ゲノム再構築と原核生物と真核生物の読み取り比率の推定のためのバイオインフォマティクスワークフロー このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
唾液腺から始まる臓器解剖の順序に特に注意を払うことをお勧めします。実際、蚊の完全性が保たれていれば、 Culex 標本の胸部から蚊をより簡単に抽出できることを観察しました。腹部や胸部が損傷すると、蚊の体内の圧力が低下し、手順が妨げられる可能性があります。ただし、胸部と腹部の間を切断し、頭と胸部から唾液腺を引き抜くことも可能です(A.B.フェイル、私信)。さらに、熟練した解剖技術を習得するのは難しい場合があるため、実験前に十分な数の標本で練習することをお勧めします。
系統的な方法で交差汚染を回避しながら蚊の臓器を分離することは、下流の蚊の微生物叢の幅広い分析にとって重要です。南フランスのCulex pipiens標本から単一卵巣を解剖した後のゲノム分解メタゲノム研究により、Culex pipiens(pWCP14)におけるボルバキアの最初のプラスミドの発見が可能になりました。同様のアプローチを使用して、世界中の大陸地域と島嶼地域の両方から採取されたCulex pipiensおよびCulex quinquefasciatus標本におけるpWCPの分布と頻度を、さまざまな環境条件および実験室条件で調査しました。全体として、データはCulex蚊に著しく保存されたボルバキアプラスミド要素を明らかにし、この可動性要素が内部共生生物生物学15における重要な役割を果たしていることを示唆しており、さらなる分析が必要です。
ここでは、この体系的な手順を使用して得られた中腸および卵巣サンプルの蚊のマイクロバイオーム分析の追加例を提供します。組織間の微生物叢に明らかな違いが観察され(図5)、共通の細菌分類群と臓器特異的な細菌分類群の両方があることが観察されました。予想通り、 ボルバキア の存在は両方の臓器で検出され、蚊の卵巣のMAGの相対的な存在量(組み立てられていない短い読み取りに基づく)とMAGの平均被覆率は中腸と比較して高く、この内部共生生物が卵巣を介して伝染し、その後体細胞組織に広がるという観察と一致していました。この研究はニューカレドニアからのサンプルに限定されていましたが、このプロトコルは、 ボルバキアの全球規模でのゲノム多様性、およびそれ自体の密度調節やウイルス保護など、さまざまな表現型におけるその役割の研究を促進する可能性があります。さらに、この研究は、ここで紹介する解剖手順が、中腸サンプル内の蚊共生生物の分類学的多様性と潜在的な機能的能力の調査をどのように可能にするかを例示しています。
私たちは、2つの中腸サンプルにのみ存在する2つの腸内細菌ドラフトゲノムを取得し、これら2つの標本の臓器間の汚染がないことを確認しました。スピロヘータに関して、個々の3人の中腸と卵巣の両方で検出された、Jumaと同僚、2020年は、卵いかだの表面にこれらの細菌の存在を観察しました。著者たちは、卵いかだが脱イオン化された細菌を含まない水に保管されていたことを考えると、卵いかだで見つかった細菌群集は主に卵巣から母性遺伝している可能性があるという考えを示している。しかし、彼らは産卵直後に細菌のコロニー形成が起こる可能性を排除することができず、卵巣マイクロバイオーム16に関するさらなる研究を推奨しました。
当初は Culex pipiens 種複合体の標本用に設計されましたが、このプロトコルは 、ハマダラカ や ネッタイシマカなどの他のベクターを研究する医学昆虫学者のより広範なコミュニティに適用できると予測しています。この手法は、個々の臓器レベルでの運用により、個体内および個体間のゲノム比較が可能となり、共生生物のゲノム変動性を微細なスケールで把握することができ、ベクター制御戦略を前進させる可能性を秘めています。唾液腺、卵巣、および中腸を解剖および分離し、微生物の交差汚染を防ぐこの方法は、これら3つの臓器内のウイルス感染動態研究にも有用なプロトコルになる可能性があります。
開示事項
著者は、利益相反がないことを宣言します。
謝辞
蚊の唾液腺の解剖方法をジョーダン・ツタガタに教えてくれたギルバート・レゴフと、蚊の臓器の写真を手伝ってくれたジュリアーノ・ムッチに感謝します。私たちは、プロトコールに関する有益な議論をしてくれたAnna-Bella FaeluxとNonito Pagesに感謝します。この作業は、ERC RosaLind Starting Grant "948135" to JR の支援を受けました。Vectopoleプラットフォーム(IRD、モンペリエ)が技術サポートを提供し、蚊の個体群の飼育と維持に役立ててくれたことに感謝します。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アルコール度数 96°C; | フィッシャーサイエンティフィック | 10332562 | |
| 双眼拡大鏡 | |||
| 漂白剤 | RAJA | 145517 | 1.5 g |
| DNA 準備キット | Illumina | MGX シーケンシング プラットフォーム提供 | 以前は Nextera DNA Flex |
| DNA-RNA Shield (50 mL) | Zymo 研究 | ZR1100-50 | 保存バッファー |
| DNeasy 血液および組織キット | Qiagen | 69504 | DNA抽出キット |
| フィルターチップ20µL | Starlab | S1120-3810 | |
| チップ200µL | Starlab | S1120-8710 | |
| フィルターチップ 1000 & マイクロ;L | Starlab | S1122-1730-C | |
| 鉗子 | FST (ファインサイエンスツール) | 11252-20 | デュモン鉗子 #5 |
| ライブラリ定量キット | ロシュ | MGXシーケンシングプラットフォーム | KAPA提供 ライブラリ定量キット |
| マイクロピペット 2-20 µL | Eppendorf | 6.291704 | |
| マイクロピペット 20-200 & マイクロ;L | Eppendorf | 6.291703 | |
| マイクロピペット 100-1000 µL | Eppendorf | 7.648488顕微鏡 | |
| スライド | エプレディア | J1800BMNZ | 寸法:75mm×50mm |
| ニードル | テルモ | AN*2719R1 | |
| NGSキット | MGX | シーケンシングプラットフォームによって提供される | AgilentフラグメントアナライザーシステムHSゲノムDNA 50kbキット |
| NovaSeq 6000 | ミナ | MGXシーケンシングプラットフォームによって提供される | シーケン |
| サーPBSリン酸緩衝生理食塩水(滅菌) | フィッシャー科学 | 10212990 | |
| 永久黒マーカー | |||
| エッペンドルフ | ダッ | チャー33871 | 1.5 mL |
| 針用サポート | FST(ファインサイエンスツール) | 26016-12 | Moria MC1ピンホルダー12 cm |
参考文献
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