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方法論記事

MultiBacシステムベースのヒトミオシン-7aの精製と生物物理学的特性評価

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DOI:

10.3791/67135

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2024年8月23日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Medicine, School of Medicine, West Virginia University, 2Microscope Imaging Facility, West Virginia University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、MultiBac Baculovirusシステムを使用してヒトミオシン-7aホロ酵素を組換えで生成する手順と、調整されたin vitroフィラメントグライディングアッセイを使用してその運動性を研究する手順について詳しく説明します。

要約

ミオシン-7aは、聴覚および視覚プロセスに不可欠なアクチンベースのモータータンパク質です。ミオシン-7aの変異は、ヒトの聴覚障害者失明の最も一般的で重篤な形態であるアッシャー症候群1型につながります。ミオシン-7aは、他のアッシャータンパク質と膜貫通接着複合体を形成し、視細胞および蝸牛有毛細胞の構造機能的完全性に不可欠であると仮定されています。しかし、純粋で無傷のタンパク質を得ることは困難であるため、ヒトミオシン-7aの正確な機能メカニズムは依然としてとらえどころがなく、利用可能な構造的および生体力学的研究は限られています。近年の研究により、哺乳類のミオシン-7aは、重鎖と3種類の軽鎖(調節性軽鎖(RLC)、カルモジュリン、カルモジュリン様タンパク質4(CALML4)からなる多量体モーター複合体であることが明らかになっています。カルモジュリンとは異なり、CALML4はカルシウムイオンに結合しません。カルシウム感受性カルモジュリンと非感受性カルモジュリンの両方が、哺乳類のミオシン-7aの機械的特性を適切に微調整するために重要です。ここでは、MultiBac Baculovirusタンパク質発現系を用いて組換えヒトミオシン-7aホロザイムを作製する詳細な方法について述べる。これにより、ミリグラム量の高純度完全長タンパク質が得られ、その生化学的および生物物理学的特性評価が可能になります。さらに、調整された in vitro 運動アッセイと蛍光顕微鏡を使用して、その機械的特性と運動特性を評価するためのプロトコルを提示します。無傷のヒトミオシン-7aタンパク質の利用可能性は、ここで説明した詳細な機能特性評価プロトコルとともに、視覚および聴覚におけるミオシン-7aの分子的側面のさらなる研究への道を開きます。

概要

ミオシンは、アクチンと相互作用して多数の細胞プロセスを推進する分子モータータンパク質です1,2,3,4。ヒトは12のクラスと39のミオシン遺伝子5を持っており、これらは筋収縮6や感覚過程7などの幅広い生理機能に関与しています。各ミオシン分子は、重鎖と軽鎖からなる多量体錯体です。重いチェーンは、頭、首、尾の領域に分かれています。頭部には、ATPの加水分解とアクチンフィラメント2への力の生成に関与するアクチン結合部位とヌクレオチド結合部位が含まれています。ネックは、特定の光鎖のセットが結合されたいくつかのαヘリカルIQモチーフによって形成されています。それらは一緒になって、モーターのコンフォメーション変化を大きな動きに増幅するレバーアームとして機能します8,9,10。テールにはクラス特異的なサブドメインが含まれており、ミオシンの運動活性の調節や細胞結合パートナーとの相互作用の媒介において調節的な役割を果たしています2,11。

クラス7ミオシンのメンバーであるヒトミオシン-7aは、聴覚および視覚プロセスに不可欠です12,13。ヒトミオシン-7aのIQモチーフは、調節軽鎖(RLC)、カルモジュリン、およびカルモジュリン様タンパク質4(CALML4)を含む軽鎖のユニークな組み合わせと関連している14,15,16。これらの軽鎖は、レバーアームを安定させるだけでなく、カルシウムシグナル伝達に応答してミオシン-7aの機械的特性を調節します。これは、哺乳類のアイソフォーム14に特有の特徴であると考えられています。

ミオシン-7a重鎖(MYO7A/USH1B)をコードする遺伝子の欠損は、ヒトにおける視覚と聴の複合損失の最も重篤な形態であるアッシャー症候群1型の原因である17。さらに、軽鎖遺伝子CALML4は、1型アッシャー症候群15,18の別の変異体であるUSH1Hの原因対立遺伝子を含むようにマッピングされた候補遺伝子の1つです。網膜では、ミオシン-7aは網膜色素上皮および視細胞13に発現している。これは、網膜色素上皮(RPE)19におけるメラノソームの局在化、およびRPE細胞20による視細胞外縁椎間板の食作用に関与している。内耳では、ミオシン-7aは主に立体繊毛に見られ、毛束の確立および機械電気伝達プロセス12,21,22のゲート化に重要な役割を果たしている。

感覚細胞におけるミオシン-7aの重要性は十分に確立されていますが、分子レベルでの機能メカニズムは十分に理解されていません。この知識のギャップは、インタクトなタンパク質、特に哺乳類のアイソフォームを精製する際の課題が一因です。最近、MultiBacシステムを使用して完全なヒトミオシン-7aホロ酵素14を組換えで発現する大きな進歩が見られました。この進歩により、このモータータンパク質の構造的および生物物理学的特性評価が可能になり、哺乳類の聴覚機能に特異的に適応したヒトミオシン-7aのいくつかのユニークな特性の発見につながった14,23。

MultiBacシステムは、真核生物の多量体複合体24,25の発現のために特別に設計された高度なバキュロウイルス/昆虫細胞プラットフォームです。このシステムの主な特徴は、単一のMultiBacバキュロウイルス内で、それぞれが複合体のサブユニットをコードする複数の遺伝子発現カセットをホストできることです。多重遺伝子発現カセットの組み立ては、いわゆる増殖モジュール、すなわちホーミングエンドヌクレアーゼ(HE)部位と、マルチクローニング部位(MCS)に隣接するマッチング設計のBstXI部位によって促進されます。このモジュールは、HEおよびBstXI制限部位がライゲーション時に排除されるという事実を利用して、制限/ライゲーションによる単一発現カセットの反復的なアセンブルを可能にします。この論文では、ヒトミオシン-7a重鎖、RLC、カルモジュリン、 およびCALML4をそれぞれpACEBac1ベクター内の増殖モジュールにクローニングし(図1A)、反復プロセスを通じて多重遺伝子発現カセットに組み立てます(図1B)。ミオシン-7a多重遺伝子カセットは、pACEBac1ベクターからゲノムのmini-attTn7標的部位へのmini-Tn7要素の転位を通じて、バキュロウイルスゲノム(バクミド)に組み込まれます(図1C)。バクミド精製、バキュロウイルス産生、および増幅の手順(図1D、E)に従って、組換えミオシン-7a MultiBacバキュロウイルスを調製し、大規模なタンパク質生産に使用できます(図1F)。さらに、ミオシン-7a軽鎖は、大腸菌で別々に産生し、切断可能なHis6-SUMOタグ26,27,28を用いて精製することができる。精製された軽鎖は、それらの結合動態とミオシン-7aの制御を研究するのに役立ちます。

精製されたミオシン-7aタンパク質は、構造的、生化学的、および生物物理学的研究にかけられ、このモータータンパク質の構造機能制御に関する洞察を得ることができます。さらに、アクチンネットワークおよび他の結合タンパク質29との相互作用は、種々のin vitro再構成アプローチを用いて調べることができる。これらの解析から得られた知見は、このミオシンの生物物理学的特性に情報を提供し、ミオシン-7aがどのように細胞骨格の変化を駆動し、最終的に感覚細胞のユニークな形態と機能を形作るかについてのメカニズムの理解につながります。この論文では、哺乳類のミオシン-7aに特化して適応したアクチンフィラメントグライディングアッセイのワークフローについて詳しく説明します。アクチンフィラメント滑走アッセイは、カバーガラス表面30,31,32に固定された多数のミオシンモーターによって推進される蛍光アクチンフィラメントの動きを定量的に研究する、頑健なin vitro運動性アッセイである。このアッセイの利点は、セットアップが簡単なこと、必要な機器が最小限であること(デジタルカメラを搭載した広視野蛍光顕微鏡)、および高い再現性です。さらに、アクチンフィラメントの運動は固定化されたミオシンモーターのクラスターによって駆動されるため、このアッセイは、ミオシン-7aなどの単量体ミオシンの運動性を研究するのに特に有用です14,33。プロトコールには、実験手順からイメージング解析まで、哺乳類のミオシン-7aのユニークな運動特性に合わせて特別に調整されたいくつかの変更が含まれています。無傷のミオシン-7aタンパク質の利用可能性と、ここで概説した機能特性評価プロトコルにより、この論文は、生理学的および病理学的プロセスの両方におけるミオシン-7aの分子的役割をさらに調査するための基礎を築きます。

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プロトコル

注:ここでは、インタクトなヒトミオシン-7aホロ酵素を合成し、その運動性をin vitroで特徴付けるためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは3つのセクションに分かれています:まず、MultiBacバキュロウイルスタンパク質発現システムを使用してヒトミオシン-7aを発現します。第二に、 大腸菌 His6-SUMOシステムを使用してミオシン-7a軽鎖を別々に精製します。そして最後に、アクチンフィラメントグライディングアッセイを使用してヒトミオシン-7aの運動性を研究します。

1. MultiBacシステムベースのミオシン-7a複合体の作製

  1. ヒトミオシン-7a複合体を発現するバキュロウイルス多重遺伝子カセットの作製(16日間)
    注:ミオシン-7aサブユニットのcDNAをpACEBac1ベクターに挿入するには1回のクローニングサイクル(4日)、ミオシン-7a複合体の発現に必要なすべての増殖モジュールの段階的なライゲーションを完了するには3回のクローニングサイクルが必要であり、合計16日かかります。
    1. 市販のキットを使用して、 ミオシン-7a重鎖(HC)、カルモジュリン、CALML4、 および RLC をコードするcDNAをpACEBac1ベクターにクローニングします( 材料表を参照)。 図 1A)。FLAGタグは、精製を助けるためにミオシン-7a HCのC末端に挿入されます。
      注:哺乳類のミオシン-7aは、N末端23の11アミノ酸のセグメントのみが異なる2つのスプライシングアイソフォームとして産生されます。この短いN末端伸長は、ミオシン-7aのATPase活性の調節に重要な役割を果たします14。N端子タグを追加すると、このN端子延長部による正常な調節が妨げられ、モーターの酵素活性と運動性が大幅に低下する可能性があることが示されています14。そのため、タンパク質の自然な調節を乱さないように、C末端のFLAGタグが採用されています。
    2. 以下に説明するように、ホーミングエンドヌクレアーゼ/BstXI増殖を使用して、ミオシン-7aホロザイムの多重遺伝子発現カセットを構築します(図1B)。
      注:ホーミングエンドヌクレアーゼI-CeuIは、BstXI消化物によって生成された末端と適合する凝集末端を生成します。ライゲーション時には、どちらの酵素でも切断できないホーミングエンドヌクレアーゼ/BstXIハイブリッド制限部位が作られます。同じ手順を繰り返して、より多くの乗算モジュールを統合できます。I-CeuIおよびBstXIの複数の制限部位がインサートまたはベクターコンストラクト上に存在する場合、これらの追加の部位は、I-CeuIおよびBstXI切断部位が一意であることを保証するために、部位特異的突然変異誘発によって排除する必要があります。
    3. インサート調製:インサートコンストラクト(pACEBac-M7a HCなど)をホーミングエンドヌクレアーゼI-CeuI( 材料表を参照)で消化し、PCR精製キット( 材料表を参照)を使用して直鎖状プラスミドを精製します。さらに、直鎖状プラスミドをBstXI( 材料表を参照)で消化し、ゲル電気泳動を使用して遺伝子発現カセットを含むフラグメントを分離し、ゲル抽出キットを使用して精製します( 材料表を参照)。
      注:I-CeuIとBstXIは、メーカーのプロトコルに従って、100%の活性を達成するために異なる緩衝条件を必要とします。さらに、I-CeuIによる完全切断には最低3時間が必要ですが、BstXIにはわずか15分のインキュベーション時間が必要です。したがって、消化は順番に実行する必要があります。
    4. ベクター調製:BstXI消化により、ベクターコンストラクト(pACEBac-CaMなど)を線状化します。アルカリホスファターゼは、ベクタープラスミドがそれ自体にライゲーションするのを防ぐために、ベクター調製に含まれています( 材料の表を参照)。電気泳動で消化産物を採取し、ゲル抽出キットで精製します。
    5. ライゲーション:I-CeuI/BstXI処理インサートとBstXI処理ベクターをT4 DNAリガーゼでライゲーションします( 材料表を参照)。室温(20°C-25°C)で10分間、インサートDNAとベクターDNAの質量比1:1でライゲーション反応を行い、各ライゲーション反応で総質量を100 ngに近づけます。
    6. 形質転換およびプラスミド分析:ライゲーション混合物をメーカーの推奨に従ってDH5α細胞( 材料表を参照)に形質転換し、陽性コロニーのゲンタマイシン耐性をスクリーニングします。市販のキット( 材料表を参照)を使用してプラスミドを精製し、特定の制限消化パターンとインサートのDNAシーケンシングに基づいて正しいクローン(M7a HCとCaMの両方を含むプラスミドなど)を確認します。
    7. 複数の遺伝子発現カセットの統合:手順1.1.2から1.1.6を繰り返して、他のミオシン-7aサブユニットを発現する追加の遺伝子カセットを統合します。
  2. 組換えバクミドDNAの産生と精製(4日間; 図1C)。
    注:1日目 - 細菌の形質転換と形質転換コロニーの成長。2-3日目 - コロニーの成長と形質転換成功のためのスクリーニング。3日目 - 陽性コロニーを選択してストリーキングし、一晩の接種を開始します。4日目 - バクミドDNAの精製。
    1. DH10Bacコンピテントセル( 材料表を参照)を、シーケンシングしたpACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaMプラスミド1 ngで、メーカーの推奨に従って形質転換します。
    2. 50 μg/mL カナマイシン、7 μg/mL ゲンタマイシン、10 μg/mL テトラサイクリン、100 μg/mL ハロゲン化インドリル-β-ガラクトシド、および 40 μg/mL IPTG ( 材料表を参照) を含む寒天プレートに 20-200 μL の細胞をプレートし、プレートを 37°C で 48 時間インキュベートして、ネガティブクローンで深い青色を発現させます。
      注:ハロゲン化インドリル-β-ガラクトシドは、LacZを発現し続けるコロニーを染色し(転位が失敗したことを示す)、転位が成功した白色コロニーの選択を可能にします。
    3. 単離された白色コロニーを慎重に選択し、50 μg/mL カナマイシン、7 μg/mL ゲンタマイシン、および 10 μg/mL テトラサイクリンを含む 5 mL LB 培地で、225 rpm のオービタルシェーカーで 37 °C で細胞を一晩増殖させます。
    4. 培養物を2,465 x g で10分間遠心分離し、 大腸菌をペレット化します。上清を捨て、ペレットをキットから300 μLのバッファーP1に再懸濁します。
      注:ここではMiniprepキットのバッファーを使用していますが、バクミド製品を精製するためのプロトコルは、キットに付属のプロトコルとは異なります。
    5. キットから300 μLのバッファーP2を加えます。チューブを数回反転させて混合し、室温で3分間インキュベートします。
    6. キットからN3バッファー300μLを添加し、反転して混合して溶解反応を停止させます。17,885 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
    7. 上清を清潔な滅菌チューブに移し、遠心分離をさらに10分間繰り返します。
    8. 上清800 μLを別の滅菌済み1.7 mL微量遠心チューブ( 材料表を参照)に移し、600 μLの冷イソプロパノール( 材料表を参照)を加え、厳密な反転で混合します。次に、17,885 x g で4°Cで20分間遠心分離します。
    9. 上清を捨てて、小さな白いペレットを見つけます。ペレットを800 μLの冷たくした70%エタノール( 材料表を参照)で洗浄し、17,885 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ペレットを乱さないように、チューブ壁に沿ってエタノールを慎重に追加します。
    10. 上清を捨て、エタノール洗浄を一度繰り返します。ペレットを室温で5分間風乾します。必要に応じて、余分な液体を慎重に吸引します。
    11. ペレットをキットのEBバッファー20μLで溶解します。チューブをフリックするか、ピペッティングで穏やかに混合して、ペレットが完全に溶解していることを確認します。分光光度計を使用して濃度を測定します( 材料の表を参照)。
    12. 必要に応じてバッファー量を調整し、バクミド濃度を約1 μg/μLにします。P0ウイルス産生の準備が整うまで、バクミドDNAを4°Cで保存します。
      注:精製されたバクミドは4°Cに保つことができ、数ヶ月間効果を保ちます。1歳までのバクミド製品によるトランスフェクションの成功例が見つかっています。あるいは、バクミドを分注して-20°Cで保存することもできます。複数回の凍結/融解サイクルは、トランスフェクション効率を低下させるため、避けるべきです。
  3. Sf9昆虫細胞をバクミドでトランスフェクションして、組換えバキュロウイルスを作製します(6日間;図1D)
    注:1日目 - バクミドDNAによる細胞のトランスフェクション。2-6日目 - 細胞の成長と発現を観察します。6日目 - P0ウイルスの収集。
    1. 培地中のSf9細胞( 材料表を参照)を6ウェルプレートに0.33 x 106 細胞/mLの濃度で、ウェルあたり3 mLで加えます。プレートを室温で30分間放置し、細胞をプレートの底に付着させます。
    2. 各ウェルについて、10 μL のカチオン性脂質トランスフェクション試薬 ( 「材料表」を参照) と 250 μL の改良型 Minimal Essential Medium (MEM) 培地 ( 「材料表」を参照) を滅菌マイクロ遠心チューブに組み合わせて、トランスフェクション混合物を調製します。反転して混合し、室温で5分間インキュベートします。
    3. トランスフェクション混合物に1 μg(ステップ1.2.12で決定した濃度に基づく)の原液ミオシン-7aバクミドを加えます。反転して混合し、室温で5分間インキュベートします。
    4. DNA-脂質混合物全体をウェルに均等に滴下します。トランスフェクションされていない細胞用のウェルをネガティブコントロールとして1つ残します。
    5. 6ウェルプレートをフィルムで密封し( 材料表を参照)、27°Cで6日間インキュベートします。この間、成長と分離を観察してください。コンストラクト上に蛍光タグが存在する場合は、蛍光発生を確認します(図2)。
    6. トランスフェクションした細胞が後期感染の兆候を示したら、ウイルスを含む培地を感染したウェルから15 mLのコニカルチューブに移し、805 x g で10分間遠心分離します。
    7. 上清をきれいな15mLの円錐管に移し、アルミホイルで包み、4°Cで保存します。 この製品は現在P0ウイルスであり、私たちの経験から最大4か月間保存および効果的に使用できます。
  4. バキュロウイルスストックを増幅します(3-5日; 図1E)
    1. 250 mLの三角フラスコで、Sf9細胞培養培地中の2 x 106 細胞/mLの濃度で100 mL(または所望の容量)のSf9細胞を調製します( 材料の表を参照)。
    2. P0ウイルスストックを1:100比(v/v)でSf9細胞懸濁培養液に加え、オービタルシェーカーで27°C、135rpmでインキュベートします。
    3. 細胞が~90%の細胞死を達成するまで、24時間ごとに増殖をモニターします。この範囲になったら、細胞懸濁液を500 x g で10分間遠心分離し、P1ウイルスを含む上清を回収します。
    4. 0.22 μmの真空ろ過を使用して上清をろ過します( 材料の表を参照)。ろ過した製品は暗所に保管し、4°Cで保管してください。 この製品は現在P1ウイルスです。
      注:ウイルス力価は、4°Cで長期保存すると減少します。4ヶ月以上保存されている場合は新しいウイルスストックを作成するか、発現34で使用する前にウイルスストックを力価で測定することを検討してください。
  5. タンパク質発現(発現開始から細胞ペレットの収集まで60〜72時間; 図1E)
    1. 2 x 106 細胞/mLの濃度で対数期増殖Sf9細胞を調製し、P1ウイルスを12 mLのウイルスと300 mLの細胞懸濁液の比率で添加します。
      注:タンパク質収量は約1 mg / Lです。このタンパク質発現には、最低1.5 Lの細胞懸濁液を使用することが推奨されます。
    2. 細胞を27°Cでオービタルシェーカーで135rpmで約60時間培養します。
      注:小さなサンプルを異なる時点で収集し、SDSゲルを使用して分析してタンパク質発現レベルを評価できます。さらに、タンパク質を蛍光タグと融合させれば、蛍光顕微鏡を用いて発現レベルを評価することができます。細胞は、細胞死の開始までに回収する必要があります。
    3. 細胞懸濁液を3,735 x g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。ペレットは、さらに使用するまで-80°Cで保存することも、長期保存のために保存することもできます。通常、細胞ペレットは数週間以内に使用しますが、凍結後数か月で活性タンパク質を回収しています。
  6. タンパク質精製(2日間; 図1F)
    注:1日目 - FLAGアフィニティークロマトグラフィーを使用したタンパク質の抽出と精製。2日目 - 一晩の透析後にサンプルを分注して凍結します。以下に述べるプロトコールは、1.5L細胞ペレットからミオシン-7aを精製するためのものです。
    1. 10 mM MOPS(pH 7.2)、500 mM NaCl、10 mM MgCl2、1 mM EGTA、1 μg/mLロイペプチン、および100 μg/mLのフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)を含むマスターバッファーを調製します。0.22 μmのポアサイズフィルターでろ過し、バッファーを4°Cで保存します( 材料の表を参照)。
      注:PMSFは水溶液中で不安定です。PMSFストック溶液を100%エタノール中1 Mとして調製し、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。
    2. マスターバッファーに3錠のEDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤、2 mM ATP、および0.1 mMのジチオスレイトール(DTT; 材料の表を参照)を添加して、75 mLの抽出バッファーを調製します。
    3. ペレットがまだ凍結している間に、75 mLの抽出バッファーをペレットに加えます。ペレットを氷上の抽出バッファーに入れ、解凍するまで放置します。血清学的ピペットを使用してペレットを分解し、解凍プロセスを加速します。
    4. 1/2インチ(13 mm)の先端を使用して、氷上で再懸濁液を50%の振幅で10分間超音波処理します。5秒オン、5秒オフです。
    5. 全ライセートを33,746 x g で4°Cで30分間遠心分離します。 遠心分離中に、Anti-FLAGアフィニティー樹脂の50%スラリー3 mL( 材料表を参照)を40 mLのPBSで洗浄し、1.5 mLのFLAG樹脂を調製します。樹脂を800 x g で4°Cで2分間遠心分離してペレット化します。 PBSはレジンを乱さないように慎重に取り除きます。
    6. ライセート遠心分離による上清を洗浄したレジンに加え、4°Cで1時間連続回転させてインキュベートします。
    7. レジンを800 x g で4°Cで2分間遠心分離してペレット化します。 レジンを乱さないように、上澄み液を取り除いてください。
    8. レジンを40 mLのMaster Bufferに再懸濁し、800 x g で4°Cで2分間遠心分離します。 上澄み液はレジンを乱さないように慎重に取り除きます。洗濯を1回繰り返します。
    9. 洗浄したレジンを2本のポリプロピレン製スピンカラムに移します( 「材料の表」を参照)。各カラムを2 mLのMaster Bufferで1回洗浄します。マスターバッファーを1,400 x g で2分間、4°Cで遠心分離して、マスターバッファーを取り出します。 底面に樹脂を詰めていきます。
    10. 100 μg/mLのFLAGペプチド( 材料表を参照)をマスターバッファーに添加して、溶出バッファーを調製します。
    11. 各カラムに充填したレジンに300 μLのElution Bufferを加え、ピペッティングで穏やかに混合して、レジンがElution Bufferによって完全に水和していることを確認します。レジンをElution Bufferと氷上で10分間インキュベートします。
    12. カラムを 1,400 x g で 2 分間、4 °C で遠心分離します。 フロースルーを清潔な微量遠心チューブに移し、氷上に保ちます。これが最初の分数です。
    13. 手順1.6.11〜1.6.12を繰り返して、各列から4つの分数が収集されるようにします。
    14. 溶出画分を用いてSDS-PAGEゲル電気泳動35 を行い、その相対濃度を決定します。ゲルが泳動している間に、500 mM NaCl、10 mM MOPS、2 mM MgCl2、0.1 mM EGTA、および1 mM DTTを含む透析バッファーを調製します。
    15. 最も濃縮されたフラクションを組み合わせます。サンプルを10K MWCO透析カセット( 材料表を参照)に移し、4°Cで一晩透析します。 約500 μLのタンパク質に対して1 Lの透析バッファーを使用してください。透析バッファーの少なくとも3回の交換を行います。
      注:スピンカラムと遠心分離溶出法により、タンパク質を高濃度(0.5-1 mg / mL)で溶出できます。通常、それ以上の集中手順は必要ありません。ただし、より濃縮されたタンパク質が必要な場合は、サンプルを100,000 MWCO濃縮チューブ( 材料表を参照)にロードし、1,400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。必要なタンパク質溶液の量が得られるまで、このプロセスを繰り返します。
    16. 翌日、透析カセットからサンプルを慎重にアンロードします。PCR チューブあたり 15 μL を分量し、チューブを液体窒素の容器に滴下して瞬間凍結します。凍結したタンパク質は、将来の使用のために-80°Cで保存できます(図3A)。
      注:この方法を使用したミオシン-7aの収率は、通常0.5〜1 mg / Lです。

2. 大腸菌 His6-SUMOシステムを用いた軽鎖RLCおよびCALML4の精製(7日間)

注:1〜4日目 - プラスミドのクローニングと精製。5日目 - 細菌の形質転換。6-7日目 - 最終タンパク質の精製、分注、凍結。

  1. RLCおよびCALML4をコードするcDNAをpET-SUMOベクターにクローニングし、このベクターにはSUMOの前にHis6配列が含まれており、精製を支援します。必要に応じて、His6-SUMOドメインは、SENP2プロテアーゼ26,36を用いて融合タンパク質から切断することができる。
  2. 各軽鎖タンパク質について、BL21 E. coli コンピテントセル( 材料表を参照)をプラスミドで形質転換し、形質転換細胞で5 mLの一晩液体培養を開始します。
  3. 翌日、5 mLの一晩培養液を、50 μg/mLのカナマイシンを含む1 LのLuria-Bertani(LB)ブロスに接種します。光学密度(O.D.)が0.6〜1.0に達するまで、270rpmで連続的に振とうしながら、培養物を37°Cで増殖させます。
    注: O.D. 値は、0.2 に達すると約 20 分ごとに 2 倍になります。O.D.を頻繁に監視します。
  4. 250 μMのイソプロピルb-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を培養物に添加して、タンパク質発現を開始します。270 rpmで連続振とうしながら、37 °Cまたは16 °Cで一晩3〜5時間インキュベートします。
  5. 細胞懸濁液を4,347 x gで4°Cで15分間遠心分離することにより、大腸菌をペレット化します。 上清を捨てます。
  6. 50 mM Tris-HCl、1 M NaCl、5 mM イミダゾール、および10%グリセロール(pH 7.4)を含む再懸濁バッファーを調製します( 材料の表を参照)。氷の上を保ってください。
  7. ペレットを15〜25mLの再懸濁バッファーに再懸濁し、懸濁液を清潔なビーカーに移し、総量を35mLに調整します。DNaseとRNaseを懸濁液に1:1000(v/v)比で添加すると、最終濃度がそれぞれ1 μg/mLと2 μg/mLになります。EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤1錠、4 mM 2-メルカプトエタノール、および1% Triton Xを懸濁液に加えます( 材料の表を参照)。氷の上を20分間保ちます。
  8. ペレット懸濁液を氷水中で1秒オン、1秒オフで合計1分間、100%の振幅で超音波処理します。均質化されたライセートを4°Cに放置し、2時間連続回転させます。
    注:Triton Xの添加は、超音波処理の準備における細胞の溶解に役立ちます。
  9. ライセートを26,900 x g で45分間、4°Cで遠心分離します。これが起こっている間に、コバルト樹脂の準備を開始します( 材料の表を参照)。 大腸菌 培養物1Lに対して500μLのコバルト樹脂を使用してください。レジンを超純水で2回洗浄し、懸濁液バッファーで1回、4,347 x g で4°Cで2分間遠心分離します。
  10. ライセートを遠心分離した後、上清を洗浄したレジンと混合し、4°Cで30分間穏やかに振盪します。
  11. ライセート樹脂懸濁液を4,347 x g で4°C、2分間遠心分離します。 樹脂はチューブの底に詰められます。レジンを乱さないように、上澄み液を取り除いてください。
  12. レジンをReresponse Bufferで洗浄し、4,347 x g で4°C、2分間遠心分離します。 上清を取り除きます。上清が無色になるまで洗浄を繰り返します。
  13. 50 mM Tris HCl、300 mM NaCl、5 mM イミダゾール、10% グリセロール、4 mM 2-メルカプトエタノール、および 0.25 μM SENP2 プロテアーゼを含む溶出バッファーを調製します( 材料表を参照)。氷の上に置いてください。
  14. レジンを1 mLの再懸濁バッファーに再懸濁し、連続回転しながら4°Cで一晩インキュベートします。
  15. 翌日、4,347 x g で2分間遠心分離し、樹脂をペレット化します。切断された軽鎖タンパク質とプロテアーゼを含む上清を収集します。
  16. 1 mLのElution Bufferをレジンに加えます。遠心分離を繰り返し、上清を回収します。
  17. 高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)によりプロテアーゼを除去します。簡単に説明すると、50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、10% グリセロール、および 5 mM DTT(pH 7.4)を含むバッファーでサイズ排除カラム( 材料表を参照)を調製します。10,000 MWCOの濃縮チューブを使用して、上清を500 μLに濃縮します。濃縮サンプルをシリンジを使用して自動クロマトグラフィーシステムに接続されたカラムにロードし、50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、10% グリセロール、および 5 mM DTT(pH 7.4)を含むバッファーで流します。紫外分光光度法を使用して、収集した画分をモニターします。軽鎖に対応する分子量のタンパク質画分を収集します。
    注:精製タグ(GSTタグなど)がプロテアーゼに組み込まれている場合、プロテアーゼはアフィニティークロマトグラフィーによっても除去できます。
  18. 溶出画分を含ませたSDS-PAGEゲルを泳動し、各画分中の軽鎖タンパク質の純度と相対濃度を測定します。所望の画分は、目に見えるプロテアーゼバンドを伴わない濃縮された軽鎖タンパク質を含む画分です。目的のタンパク質画分を組み合わせ、10,000 MWCO濃縮チューブ35を使用して濃縮します。
  19. タンパク質のアリコートを液体窒素で急速凍結し、すぐに-80°Cに移して長期保存します(図3B)。
    注: 大腸菌 His6-SUMOシステムを使用したRLCおよびCALML4の収量は約1〜2 mg / Lです。

3. ミオシン-7aテーラードアクチンフィラメントグライディングアッセイ(3時間)

注:このセクションで使用される方法は、他のミオシン31 について説明した方法と似ていますが、主な変更は、高イオン強度バッファーでのミオシンのインキュベーションと適用、およびフレーム間の変位の正確な測定を達成するために必要な長い間隔です。

  1. 重合バッファー(50 mM KCl、25 mM MOPS、2 mM MgCl2、1 mM DTT(pH 7.0))で球状アクチン(G-アクチン)を重合することにより、20 μMの糸状アクチン(F-アクチン)を調製し、4°Cで一晩調製します。1.2倍モルの過剰なロダミン-ファロイジンを添加してF-アクチンを標識します( 材料の表を参照)。アルミホイルで覆い、氷上で少なくとも2時間インキュベートします。
    注:G-アクチンは、市販の業者から購入するか(材料の表を参照)、またはウサギの筋肉アセトン粉末31,37から精製することができます。標識F-アクチンは、この濃度で4°Cで最大2ヶ月間保存できます。
  2. 前述したようにフローチャンバーを調製する31。簡単に言うと、洗浄してニトロセルロース処理した顕微鏡スライドに、2〜3 mm間隔で両面テープを2本ずつ貼ります( 材料の表を参照)。カバーガラスのニトロセルロース面を下にしてストリップに置き、約10 μLの容量のフローチャンバーを作成します(図4)。
  3. アクチンフィラメントグライディングアッセイの実施
    1. フローチャンバーに、500 mM NaCl Motility Buffer (500 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA (pH 7.4)) 中の精製ヒトミオシン-7aタンパク質のチャンバー容量1つを添加します。室温で5分間インキュベートします。
      注:高塩分バッファーにミオシン-7aを添加すると、自己阻害状態が緩和され、ミオシン-7aが活性化されたコンフォメーションで表面に付着できるようになるため、非常に重要です。
    2. 150 mM NaCl Motility Buffer (150 mM NaCl, 20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7.4)) に 1 mg/mL BSA (材料表を参照) の 3 チャンバー容量でフローチャンバーを洗浄し、出口の清潔なワイプを使用して液体を引き出し、余分な液体を吸収します。3回目の洗浄後、1分間インキュベートします。
    3. 150 mM NaCl Motility Buffer 中の 10 nM ローダミンファロイジン標識 F-アクチンの 1 チャンバー容量をフローチャンバーに流します。アクチンフィラメントの表面への結合を100倍対物レンズの蛍光顕微鏡で観察します。アクチンフィラメントの密度は最適で(図5A)、トラッキングのために視野内に十分なフィラメントを確保しながら、トラッキングを複雑にする複数のフィラメントのオーバーラップを防ぐのに十分なスパースを確保する必要があります。
    4. フローチャンバーを3チャンバー容量の150 mM NaCl Motility Bufferで洗浄し、未結合のアクチンフィラメントと過剰なロダミン-ファロイジンを除去します。
    5. 最終バッファー(200 mM NaCl、20 mM MOPS、5 mM MgCl2、0.1 mM EGTA、50 mM DTT、2 mM ATP、2.5 mg/mL グルコース、100 μg/mL グルコースオキシダーゼ、2 μM RLC、2 μM CaM、2 μM CALML4)を 1 チャンバー容量追加して運動性を開始します。
    6. 561 nmの励起を使用して蛍光顕微鏡で画像を記録し、ローダミンファロイジン標識アクチンを視覚化します。スライド上で目的のアクチン密度の領域を見つけ(図5A)、30秒ごとに30分間画像をキャプチャします。
      注:哺乳類ミオシン-7aの速度は約5 nm / sです。取得フレームレートを設定するときは、フレーム間のフィラメントの変位が正確なトラッキングを可能にするのに十分な長さ(1ピクセル以上)であることを確認することが重要です。フレーム間のサブピクセルの移動により、速度が過大評価される可能性があります。30秒のフレームレートにより、アクチンフィラメントはフレーム間で約150nm移動でき、これは顕微鏡上の2ピクセル以上に相当します。ただし、使用する顕微鏡では大きな変位が観察される可能性があるので注意が必要です。利用可能な場合、マルチポジション記録を使用して、分析のために複数の視野を同時に収集できます。
  4. FASTプログラム(Macにインストール)を使用してアクチンフィラメントの動きを解析する38。
    注:ここで使用するFASTプログラムは、フィラメントの動きを定量化するための多くのオプションの1つにすぎません。FASTを使用することを選んだのは、自動化されており、高速で、有料のソフトウェアを必要としないためです。その他のオプションには、FIESTAなどのMATLABベースのアルゴリズム、MTrack2やManual TrackingなどのImageJ/FIJIベースの方法、Philament39などのPythonベースの方法などがあります。
    1. FASTプログラム(github.com/NeilBillington/FASTrack3 をダウンロードしてインストールします - python3互換バージョンとnd2ファイル変換のための追加モジュール。注意:オリジナルのpython2バージョンは github.com/turalaksel/FASTrack)にあります。
    2. 38で説明されているように、許容値33を使用してFASTプログラムを実行し、滑らかに動くフィラメントのみを保持します。
      注:画像にステージの機械的な問題へのドリフトが含まれている場合、または複数のシリーズを同時に収集することによるドリフトが含まれている場合は、最初にムービーを安定させる必要があります。これには、次のアドレスからダウンロードできるFIJIプラグインImageStabilizerをお勧めします-(https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html)。
    3. FASTプログラムを使用して、最初に-xmaxおよび-ymax値を設定することにより、新しく作成された.tifイメージを分析します。これらは、プログラムによって出力される散布図のパラメータを設定し、最長のフィラメント長(nm)と最大フィラメント速度(nm/s)を表します。この例では、-xmax に 20,000 nm、-ymax に 20 nm/s を使用して、すべてのデータがキャプチャされるようにしました (図 5D)。
    4. -px を使用して、取得した画像のピクセル サイズ (ここでは 65 nm) を設定し、-minv を使用して、分析に含めるためにフィラメントに必要な最小速度 (nm/s) を設定します。この例では、ミオシン-7aの低速には、0.1 nm/sを使用します。
    5. -maxd を使用して、フィラメントをリンクするフレーム間の最大距離を設定します。これは、フレーム間で別々のフィラメントをリンクしないように設定されており、この例ではデフォルトの2000nmを使用しています。
    6. フィラメント速度の変動に対する許容範囲を設定し、滑らかな動きのフィラメントのみを含めるには、-pt を使用します。この例では、許容しきい値 33% を使用しています。これは、速度標準偏差が速度平均の33%より大きいフィラメントは、さらなる分析から除外されることを意味します。
    7. 最後に、-d を使用して、分析用の.tifスタックを含むフォルダーを示します。指定されたパラメーターと値を含むコマンド文字列全体は、fast -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [ムービーを含むフォルダー名]になります。
      注:FASTプログラムは、散布図(図5D)とそれに関連する生データを出力し、他のプログラムで分析および視覚化するために抽出できます(図5C)。また、トラッキングされたフィラメントのパスのプロットも出力されます(図5B)ので、トラッキングが期待どおりに機能していることを確認するために使用する必要があります。プロットとその他の可能なデータの視覚化の例を以下に示します。

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結果

精製されたミオシン-7a複合体および軽鎖タンパク質は、 図3に示すように、SDS-PAGEゲル電気泳動によって評価できます。200 kDaマーカーの上のバンドは、ミオシン-7a重鎖(255 kDa)に対応します。22 kDaマーカーと14 kDaマーカーの間を上から下に移動する3つのバンドは、それぞれRLC(20 kDa)、カルモジュリン、およびCALML4です。カルモジュリンとCALML4の分子量は約17 kDaと同程度ですが、2つのタンパク質は16%トリス-グリシンゲルを使用して分離できます。

ビデオ1 および 図5 は、哺乳類のミオシン-7aを用いた特徴的なアクチンフィラメント滑走アッセイを示しています。このアッセイによって明らかになった直接的な特徴は、ミオシン-7aの運動性が遅いことです。このビデオは、このミオシンによって駆動されるアクチンフィラメントの動きをより視覚化するために、通常の500倍の速度で再生されます。このア...

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ディスカッション

ここでは、昆虫細胞から組換えヒトミオシン-7aタンパク質を産生するための詳細なプロトコールを示します。Sf9/バキュロウイルス系は、種々のミオシン40,41,42,43を産生するために使用されてきたが、哺乳類のミオシン-7aがMultiBacバキュロウイルス系を用いて精製されたのはごく最近のことである14。哺乳類のミオシン-7aは、タンパク質の構造的および機能的完全性に必須である3種類の軽鎖と会合することがわかっています14。これは、その無脊椎動物の相同体や他のほとんどのミオシンとは対照的であり、通常は1つまたは2つの軽鎖タイプにしか結合しません44,45

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

画像解析に関するディスカッションと支援を提供してくださったウェストバージニア大学のMicroscopy Imaging FacilityおよびVisual Function and Morphology Coreに感謝します。この取り組みは、ウェストバージニア大学医学部からR.L.へのテニュアトラックスタートアップ資金によってサポートされています。この研究は、国立総合医科学研究所(NIGMS)のVisual Sciences Center of Biomedical Research Excellence(Vs-CoBRE)(P20GM144230)、およびNIGMSウェストバージニア州生物医学研究優秀ネットワーク(WV-INBRE)(P20GM103434)によってもサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.7 mL 微量遠心チューブVWR87003-294
1X FLAG PeptideGenScriptN/Aカスタムペプチド合成
22x22mm No. 1.5 カバースリップVWR48366-227
250 mL 円錐形遠心チューブNunc376814
250 mL ベント付き三角三角シェーカーフラスコIntelixBioDBJ-SF250VP
2-メルカプトエタノールVWRM131
75x25x1 mm Vistavision 顕微鏡スライドVWR16004-42
アクチンタンパク質 (純度 >99%)細胞骨格AKL99
アミコン ウルトラ 0.5 遠心フィルターユニットミリポアシグマUFC510024
アミコンウルトラ 4 遠心フィルターユニットミリポアシグマUFC801024
アンチフラッグ M2 アフィニティーゲルミリポアシグマA2220
ATPミリポアシグマA7699
ATPミリポアシグマA7699
バイオスピンディスポーザブルクロマトグラフィーカラムバイオ・ラッド732-6008
BL21 コンピテント大腸菌ニューイングランド バイオラボC2530H
ブルーガルサーモフィッシャー
ウシ血清アルブミンミリポアシグマ5470
BstXI 酵素ニューイングランド バイオラボR0113S
カルモジュリンミリポアシグマ208694
カタラーゼミリポアシグマC40
チャンピオン pET-SUMO 発現システムサーモフィッシャーK30001
cOmplete、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルロシュ診断5056489001
Cutsmart BufferNew England BiolabsB6004S
DL-DithiothreitolMilliporeSigma DO632
DL-DithiothreitolMillipore SigmaDO632
DNase I, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-610-304
909955両面テープオフィスデポ
分子生物学グレードミリポアシグマ324626-25GM
EGTA、分子生物学グレードミリポアシグマ324626-25GM
エタノールサーモフィッシャーBP2818
ExpiFectamine SFトランスフェクション試薬GibcoA38915
FASTプログラムhttp://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements; 
フィッシャーブランド モデル 505 ソニック ディスメンブレーターフィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィFB505110
ゲンタマイシン試薬溶液Gibco15710-06410 mg/mL 蒸留水
グルコースミリポア SigmaG5767
グルコース オキシダーゼミリポア ΣG2133
グリセロールInvitrogen15514-011
HisPur コバルト樹脂サーモフィッシャー89966
I-CeuI酵素ニューイングランドバイオラボR0699S
画像安定化剤プラグインhttps://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
イミダゾールミリポアシグマI2399
インフュージョンスナップアセンブリマスターミックスTaKaRa638948
IPTGサーモフィッシャー15529019
イソプロパノールフィッシャー・サイエンティフィックA451SK
カナマイシンフィッシャー・サイエンティフィAAJ67354AD
大型オリフィス ピペットチップフィッシャー・サイエンティフィ02-707-1341-200uL
LB 寒天、既製粉末サーモフィッシャーJ75851-A1
ロイペプチンプロテアーゼ阻害剤サーモフィッシャー78435
塩化マグネシウムサーモフィッシャーJ61014.=E1M
塩化マグネシウムサーモフィッシャーJ61014.=E
1M 最大効率 DH10Bac コンピテントセルGibco10361012
微量遠心チューブ、1.7mLVWR87003-294
マイクロ遠心チューブ、1.7mLVWR87003-294
マイクロ遠心チューブ、1.7mLVWR87003-294
顕微鏡ニコンモデル: 100X TIRF 対物
顕微鏡カメラORCA-Fusion BT
顕微鏡レーザー ユニットAndor iXon Ultra
Miller' を備えた H-TIRF システム付き Eclipse Tis LB BrothCorning46-050-CM
MOPSミリポアシグマM3183
MOPSミリポアシグマM3183
NanoDrop One/OneC マイクロボリューム UV-Vis 分光光度計サーモフィッシャーND-ONE-W
NanoDrop One/OneC マイクロボリューム UV-Vis 分光光度計サーモフィッシャーND-ONE-W
NEB 5-α有能な大腸菌(高効率)ニューイングランドバイオラボC2987H
NEBuffer r3.1イングランドバイオラボB6003S
NISエレメントニコン
NISエレメントニコン
ニトロセルロースLADD研究産業53152
Opti-MEM I還元血清培地ギブコ31985070
pACEBac1 ベクターGeneva Biotech
ParafilmMillipore SigmaP7793
PMSFMillipore Sigma78830
PureLink RNase A (20 mg/mL)Invitrogen12091021
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAquick Gel Extraction Kit (50)QIAGEN28704
QIAquick PCR Purification Kit (50)QIAGEN28104
Quick CIPNew England BiolabsM0525S
Rhodamine phalloidinInvitrogenR415
S.O.C. MediumInvitrogen15544034
SENP2 proteasePMID:17591783ラボ
で精製Sf9 細胞Thermo Fisher11496015
Sf-900 III SFM (1X) - Serum Free Media CompleteGibco12658-027
Slide-A-Lyzer G3 Dialysis Cassettes, 10K MWCO, 3 mLThermo FisherA52971
塩化ナトリウムMillipore SigmaS7653
塩化ナトリウムMillipore SigmaS7653
Stericup クイックリリース 真空駆動ディスポーザブルろ過システムミリポアシグマS2GPU01RE
Superdex 75 増加 10/300 GLCytiva29148721
T4 DNA リガーゼニューイングランド バイオラボM0202S
T4 DNA リガーゼバッファー - 10倍 10mM ATPニューイングランド バイオラボB0202A
テトラサイクリン塩酸塩ポアシグマT7660-5G
トリスミリポア シグマ10708976001
トリトン Xアメリカン バイオアナリティカル9002-93-1
15519028EGTA 、ック ック ック ニューミリ

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