サーマルシフトアッセイによるセレノプロテインOへの基質結合のプローブ

サマリー

ここでは、低分子の目的のタンパク質への結合を調査するために使用されるハイスループットの蛍光ベースの手法であるサーマルシフトアッセイを紹介します。

要約

未知の機能を持つタンパク質の生物学的重要性を定義することは、細胞プロセスの理解において大きな障害となります。バイオインフォマティクスや構造予測は未知のタンパク質の研究に貢献してきましたが、 in vitro での実験的検証は、生化学的活性に必要な最適な条件や補因子によって妨げられることがよくあります。補因子の結合は、一部の酵素の活性に不可欠であるだけでなく、タンパク質の熱安定性を高める可能性もあります。この現象の実用化の1つは、タンパク質の融解温度の変化によって測定される熱安定性の変化を利用して、リガンドの結合を調べることです。

サーマルシフトアッセイ(TSA)は、目的のタンパク質へのさまざまなリガンドの結合を分析したり、X線結晶構造解析などの実験を実行するための安定化条件を見つけたりするために使用できます。ここでは、金属とヌクレオチドの結合を試験するためのシンプルでハイスループットな方法として、シュードキナーゼであるSelenoprotein O(SelO)を利用したTSAのプロトコールについて説明します。標準的なキナーゼとは対照的に、SelOは逆向きにATPに結合し、タンパク質AMPylationとして知られる翻訳後修飾でAMPのタンパク質のヒドロキシル側鎖への移動を触媒します。融解温度の変化を活用することで、SelO機能の根底にある分子相互作用に関する重要な洞察を提供します。

概要

ヒトプロテオームの多くは、まだ十分に特徴付けられていません。Dunham氏とKustatscher氏らが提唱した「街灯効果」とは、広く研究されたタンパク質が注目され、研究が進んでいないタンパク質が見落とされる現象を指します^1,2。この影響に寄与する要因には、特定のタンパク質の生物学的重要性と疾患関連性が含まれます。さらに、基礎知識を提供する先行研究や、機能解析のためのツールの利用可能性は、高度に研究されているタンパク質の研究をさらに刺激します^1,2。Understudy Proteins Initiative、Structural Genomics Consortium、Enzyme Function Initiativeなどのプロジェクトは、構造的および機能的プロテオミクス^2,3,4を使用して、研究が進んでいないタンパク質の特性評価を目指しています。研究が進んでいないタンパク質の分子機能を特定するための補完的なアプローチは、これらのタンパク質と低分子との相互作用を調べて、調節と基質特異性に関する貴重な洞察を得ることです。

低分子の結合は、タンパク質の熱安定性を高めることができます⁵。この現象は、リガンド誘起立立安定化として知られており、しばしばタンパク質の融解温度の上昇をもたらし、リガンド結合の測定可能な指標を提供します⁶。タンパク質の熱安定性は、Thermometerfluorとも呼ばれる示差走査型蛍光法(DSF)またはThermal Shift Assay(TSA)7,8,9,10を使用して測定できます。TSAでは、タンパク質サンプルは、環境に敏感な色素の存在下で温度上昇にさらされます⁶。タンパク質が展開して変性すると、色素はタンパク質の露出した疎水性領域に結合し、蛍光を発します。外因性蛍光色素、または環境感受性色素は、内因性蛍光を欠いており、代わりに標的分子と相互作用すると蛍光を発します^9,11,12。最も一般的に使用される色素であるSYPRO Orangeは、安定性の向上やバックグラウンド蛍光の少なさなど、いくつかの利点を提供します^8,9,12。特に、SYPRO Orangeは、励起波長が約470 nm、発光波長が約570 nmであることから、Real-Time Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)システムに適合しています。この独自の機能により、RT-PCR^{システムで一般的に使用される}蛍光検出システム8と互換性のある、ハイスループット、正確、高感度の測定が可能になります。

TSAは、タンパク質と潜在的な補因子または薬物との相互作用を調査し、結晶構造解析の安定化条件を特定するための汎用性の高いツールです。他のスクリーニング法と比較した場合の利点は、セットアップが比較的簡単であることと、96ウェルまたは384ウェルプレート13,14,15による高いスループットです。この技術の開発は、創薬研究に変革をもたらし、利便性を提供し、イオン、リガンド、薬物などの多様な添加剤の研究を可能にしました^6,16。さらに、TSAの適応性は、科学者がその有用性を拡大することを奨励し、スクリーニングアッセイ^17,18と並行して結合親和性の測定を容易にする。TSAは、結晶化¹⁹のために目的のタンパク質の安定化を促進する条件を特定するための構造生物学研究における効果的なツールです。したがって、その柔軟性と比較的容易さにより、TSAはタンパク質の特性評価の基礎技術として位置付けられています。ここでは、TSAを使用して、研究が進んでいないシュードキナーゼであるセレノプロテインO(SelO)への金属とヌクレオチドの結合を解析します。

キナーゼは、創薬において最も標的とされるタンパク質ファミリーの1つです²⁰。ヒトキナーゼの約10%は、触媒作用に必要な主要な触媒残基を欠いているため、不活性であり、偽キナーゼと名付けられると予測されている^21,22。セレノプロテインO(SelO)は、進化的に保存された偽キナーゼであり、触媒的HRDモチーフ²³において保存されたアスパラギン酸を欠いている。真核生物では、SelOはミトコンドリアに局在し、細胞を酸化ストレスから保護します^24,25。構造解析および生化学的解析により、SelOはAMP化として知られる翻訳後修飾において、ATPからタンパク質基質にアデノシン一リン酸(AMP)を移動させることが示されている²⁵。最近の研究では、AMP化を触媒する酵素がin vitroでUTPなどの代替ヌクレオチドに結合する可能性があることが示されています^26,27。特に、サルモネラ・チフス菌由来のSelOホモログが、マンガン依存的にタンパク質UMPylation、またはUMPの転移を触媒することが研究で実証されている²⁸。これらの興味深い観察結果を踏まえて、マグネシウムとマンガンの存在下でのSelOのATPおよびUTPへの結合を試験し、TSAのアプリケーションの代表例となります。以下のプロトコールは、他のタンパク質および目的の添加剤の相互作用を最適化し、調べるために容易に適合させることができます。

プロトコル

1. 実験セットアップ

1. RT-PCR装置などの蛍光を検出できるサーマルサイクラーを使用して、記載されているプロトコールを実行します。このプロトコルで説明されているように、SYPRO Orangeを使用する場合は、約470 nmの励起と約570 nmの発光検出を可能にするスキャンモードを使用します。サーモサイクラーをプログラムして、サンプルを20°Cで2分間保持し、その後、0.5°C/1分間の温度を95°Cまで上昇させます。1°Cごとに蛍光強度を測定します。
   注:サイクルの最後に、サンプルブロックを20°Cに戻すためのオプションのステップをお勧めします(図1)。
2. 各反応には、バッファー、目的タンパク質、添加剤、外因性蛍光色素の4つの成分が含まれています。タンパク質なし、色素なし、添加物なし、添加剤なし、添加剤のみなどのコントロールを含むように実験を設計し、結果の解釈に影響を与える可能性のあるバックグラウンド蛍光を決定します。利用可能な場合は、目的のタンパク質に結合して安定化することが知られている添加剤などのポジティブコントロールを含めます。
3. アッセイには精製タンパク質を使用してください。この例に従うために、前述の^25,29のように発現および精製された大腸菌SelOを使用する。簡単に説明すると、His-sumo タグ付き SelO (E. coli SelO ppSumo) を Rosetta DE3 細胞で発現させ、Ni²⁺-NTA 親和性を使用して精製します。Ulpプロテアーゼを用いてHis-sumoタグを切断し、ゲルろ過クロマトグラフィーによりSelOをさらに精製します。
4. SYPRO Orangeの蛍光は、目的のタンパク質との相互作用に依存します。これらの相互作用はタンパク質ごとに異なるため、蛍光シグナルのシグナル対ノイズを最大化するために、タンパク質と色素の濃度を最適化します。
   注:SYPRO Orangeは、洗剤^11,30などの一部のタンパク質や添加物とは互換性がありません。¹²に記載されている追加の外因性色素は、必要に応じてスクリーニングすることができます。

2. 最適な色素濃度の決定(図2A)

1. DMSOで5,000倍で提供されるストック溶液から、50倍、40倍、30倍、20倍、および10倍のSYPRO Orangeを20μL希釈して調製します。
2. TSAバッファーで希釈した6.25 μMタンパク質8 μLを384ウェルPCRプレートの6つの別々のウェルに分注します。
   注:この例では、希釈を行うためにTSAバッファー(10 mM Tris pH 8、150 mM NaCl、および1 mM DTT)を使用しました。結果の信頼性を向上させるために、サンプルを3回に分けて分析することができます。
3. 各ウェルに1 μLのTSAバッファーを添加します。
   注:この量のバッファーは、色素とタンパク質の濃度を最適化した後、低分子の添加に置き換えられます。
4. SYPRO Orange色素溶液の段階希釈液ごとに1 μLを各ウェルに加えます。染料を含まないバッファー1 μLを最終ウェルに加え、染料なしのコントロールを行います。
5. プレートを光学的に透明な粘着フィルムで覆います。
6. PCRプレートアダプターを装備した遠心分離機で、プレートを1,000 × g で1分間短時間スピンダウンします。
7. プレートをRT-PCR装置に置き、ステップ1.1で説明したサーモサイクリングプロトコルを開始します。

3. 最適なタンパク質濃度の決定(図2B)

1. TSAバッファー(10 mM Tris pH 8、150 mM NaCl、および1 mM DTT)を使用して、25 μM、12.5 μM、6.25 μM、3.125 μM、および1.56 μMのタンパク質の20 μLの段階希釈液を調製します。
2. タンパク質の8 μLの段階希釈液を384ウェルプレートの5つの別々のウェルに分注します。
3. バッファーは6^番目の ウェルでのみ分注し、タンパク質コントロールはありません。
4. 各ウェルに1 μLのTSAバッファーを添加します。
   注:この量のバッファーは、色素とタンパク質の濃度を最適化した後、低分子の添加に置き換えられます。
5. 各ウェルに50x SYPRO Orange色素溶液各1 μLを添加します。
6. プレートを光学的に透明な粘着フィルムで覆います。
7. PCRプレートアダプターを装備した遠心分離機で、プレートを1,000 × g で1分間短時間スピンダウンします。
8. プレートをRT-PCR装置に置き、ステップ1.1で説明したサーモサイクリングプロトコルを開始します。

4. TSA 実験の設定(図 3A)

注:タンパク質とSYPRO Orange色素濃度を最適化した後、目的の低分子を添加してアッセイを行い、結合を解析することができます。

1. 反復と適切な制御を考慮して、条件の数を定義します。
   注:たとえば、SelOの8つの条件への結合をトリプリケートでテストします。コントロール(添加物なし、タンパク質なし、色素なし)を含めると、11反応×3(トリプリケート)=合計33反応となります。
2. SelOで観察されたタンパク質と色素の最適濃度に基づいて、各反応に8 μLの6.25 μMタンパク質、1 μLの添加剤、および1 μLの50x SYPRO Orange色素が含まれていることを確認し、合計10 μLの反応容量を確保します。したがって、使用される最終濃度は 5 μM タンパク質と 5x SYPRO Orange 色素です。
3. TSAバッファーを使用して、288 μLの6.25 μMタンパク質溶液を調製します。この量のタンパク質ワーキング溶液は、36回の反応(33回の反応で、ピペッティングの変動によりさらに10%)を占めています。
4. 8 μL の 6.25 μM タンパク質を 384 ウェルプレートの別々のウェルに分注します。バッファーは、タンパク質制御なしの場合にのみ分注してください。
5. 1 μLの低分子を10倍の濃度で添加すると、最終的に1倍になります。この例に従うには、1 μL の 20 mM MgCl₂ を添加して、最終濃度 2 mM を達成します。無添加制御の場合にのみバッファーを分注します。
6. 各ウェルに50x SYPRO Orange色素溶液各1 μLを添加します。
7. プレートを光学的に透明な粘着フィルムで覆います。
8. PCRプレートアダプターを装備した遠心分離機で、プレートを1,000 × g で1分間短時間スピンダウンします。
9. プレートをRT-PCR装置に置き、ステップ1.1で説明したサーモサイクリングプロトコルを開始します。

5. データ分析

1. RT-PCR装置からデータをエクスポートし、温度(°C)に対する相対蛍光単位(RFU)を測定します。
2. 選択したソフトウェアを使用して、各融解曲線で測定された最大強度までのデータポイントを抽出してプロットします。重要なことは、タンパク質なしおよび色素なしのコントロールが、温度依存的な蛍光の増加なしに低いバックグラウンド蛍光を示すことを確認することです(図3A、Bおよび補足表S1)。MoltenProt³¹やDSFWorld³²などの無料でアクセスできるソフトウェアを使用してデータ解析を行います。
3. データにボルツマンシグモイダルフィットを使用して融解温度を決定します。融解温度(Tm_)は、50%の変性または半値最大強度が観察される温度として定義されます(図3C)。
4. 融解曲線の熱シフトは、添加剤の安定化または不安定化を示唆している可能性があります。融解温度(Tm)の変化を計算する_には、式を使用します:T_m = T_m additive_- T m buffer。正の値は、安定化条件または相互作用する添加剤を表します。負の値は、不安定な状態を示します (図 3D)。

結果

真核生物のSelOは、N末端ミトコンドリアターゲティング配列、キナーゼ様ドメイン、およびタンパク質のC末端に高度に保存されたセレノシステインからなる²³。このミトコンドリア常在酵素は、細菌からヒトまで保存される偽キナーゼドメインをコードしている²³。Pseudomonas syringae由来のSelOホモログの構造解析により、正準キナーゼと比較して、ATPの逆配向での結合を促進する活性部位のアミノ酸変化が明らかになった²⁵。したがって、SelOは、酸化的損傷および細胞死から細胞を保護するために、抗酸化シグナル伝達に関与する複数のタンパク質のリン酸化ではなく、AMPylationを触媒する²⁵。AMPylationに加えて、いくつかの原核生物および真核生物のAMPylasesは、UMPylationを触媒することが示されています^27,28。

精製した組換え大腸菌SelOをTSAで使用して、二価カチオンの存在下でのATPおよびUTPヌクレオチドのSelOへの結合を調べました。標準的なキナーゼと同様に、SelOは、アスパラギン酸が金属イオンと結合して活性部位の配位ヌクレオチドを形成するDFGモチーフを秘めています。まず、TSAでの堅牢な蛍光測定のためにタンパク質と色素の濃度を最適化し、5 μMから10 μMの大腸菌SelOが5x SYPRO Orangeに最適であると判断しました(図2)。さらに、タンパク質を含まず、色素を使わないコントロールは、温度上昇に反応しない低蛍光シグナルを持つことを示しました。ATP-Mg²⁺およびATP-Mn²⁺の存在下で、大腸菌SelOの熱安定性がそれぞれ約+4°Cおよび+12°C増加することを検出しました(図3)。しかし、UTPとのインキュベーションによる熱安定性の変化は観察されず、大腸菌SelOはUTPに検出可能な結合を示さない可能性があることを示しています。

図1:サーモサイクラーのセットアップ。 FRETチャンネルを使用してSYPRO Orange蛍光を測定しながら、サンプル温度を+0.5°C/min上昇させるために使用されるサーモサイクラープログラムの例。この推奨事項には、プロトコールの開始時と終了時の周囲温度インキュベーションも含まれています。略語:FRET=フェルスター共鳴エネルギー伝達。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:タンパク質と色素の濃度の最適化。(A) 5 μM 大腸菌 SelOを使用してSYPRO Orange色素濃度を最適化した代表的な結果。 (B) 5x SYPRO Orange色素を用いて 大腸菌 のSelO濃度を最適化した代表的な結果。熱変性曲線は、温度(x軸)に対する相対的な蛍光単位(y軸)を示しています。結果は、三重ウェル(n = 3)からの平均±SDを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ヌクレオチドおよび二価カチオンの存在下でのSelOの熱変性曲線とΔTm分析。(A)サンプル(200 μM ATPまたはUTPの存在下で5 μM Escherichia coli SelO、および2 mMの二価カチオン、5x SYPRO Orange)の熱変性曲線の生データRT-PCR装置からエクスポートしてプロット。SelO ATP-MgはSelO、ATP、MgCl₂のサンプル、SelO ATP-MnはSelO、ATP、MnCl₂のサンプル、SelO UTP-MgはSelO、UTP、MgCl₂のサンプル、SelO UTP-MnはSelO、UTP、MnCl₂のサンプルを表します。色素なしおよびタンパク質なしのコントロールは、低い蛍光を示すことに注意してください。結果は、三重ウェル(n = 3)からの平均±SDを表します。(B)最高強度にプロットされ、ボルツマンシグモイド方程式に適合する熱変性曲線。SelOの熱変性はUTPの影響を受けませんでしたが、ATPの存在下では熱変性に顕著な変化が見られました(紫色の曲線)。結果は、三重ウェル(n = 3)からの平均±SDを表します。(C)図3Bで表されるデータのボルツマンシグモイドフィットから導出されたTm_値を示すヒストグラム。結果は、三重ウェル(n = 3)からの平均±SDを表します。SelO 39.2 °C ± 0.085、SelO ATP-MG 43.3 °C ± 0.133、SelO ATP-Mn 50.9 °C ± 0.085、SelO UTP-MG 39.1 °C ± 0.056、SelO UTP-Mn 39.9 °C ± 0.087。(D)融解温度ΔTm₍Tm_添加剤-TM_{バッファー)}の変化を示すヒストグラム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表S1:金属およびヌクレオチドの存在下でのSelOのTSAデータの例。 RT-PCR装置からエクスポートされた生データのスプレッドシート、およびプロトコルステップ5.1および5.2で説明されているように、最大RFU強度の後に値を削除するように処理されたデータ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

サーマルシフトアッセイ(TSA)は、補因子や阻害剤との相互作用を含むタンパク質-リガンド相互作用をスクリーニングするための効率的な方法として機能します。このプロトコルでは、TSAを使用して、シュードキナーゼSelOのヌクレオチドおよび二価カチオンへの結合を測定しました。私たちの調査結果は、SelOがATPおよびMg²⁺/Mn²⁺の存在下で増加した熱安定性を示すことを示しています。この観察結果は、大腸菌、S.cerevisiae、 およびH.sapiens由来のSelOホモログがATPからタンパク質基質のヒドロキシル側鎖へのAMPの移動を触媒することを示す以前の報告と一致しています^25,29。TSAはヌクレオチド結合に関する貴重な知見を提供しますが、in vivo基質を同定できない場合があります。基質だけでなく、他の分子もタンパク質の熱安定性に影響を与える可能性があります。基質を正確に同定するには、細胞濃度や結合親和性などの要素を考慮する必要があります。それにもかかわらず、TSAは、熱安定化を読み取り値として使用して、低分子の結合など、さまざまな条件をスクリーニングするための優れたツールです。

TSAの有用性は、タンパク質の活性部位または調節部位への低分子結合の解析におけるその用途にとどまりません。TSAは、タンパク質を結晶学実験により助長する安定化条件を提供することにより、タンパク質の生物物理学的特性評価に大きく貢献してきました。特に、TSAには、PCRプレートやRT-PCR装置などの一般的に入手可能なラボ材料を使用した簡単なセットアップやハイスループット機能など、いくつかの利点があります。これらの利点により、他の手法では実現不可能または簡単ではない可能性のある多数の条件のテストが可能になります。複数の研究がTSAを使用して、タンパク質の結晶化の最適な条件を決定するために、化合物のライブラリを持つ組換えタンパク質の熱安定性を測定しています^19,33。

融解曲線の誤解を避けるためには、プレートや添加剤からの自家蛍光が一般的な懸念事項であるため、適切なコントロールを含める必要があります。TSAは、自家蛍光を示す化合物やSYPROオレンジの蛍光を消光する化合物には適していない場合があります。考えられる解決策は、 ¹²に記載されている代替染料をスクリーニングすることです。ここで概説したTSAプロトコルは、関心のある他のタンパク質や添加物に容易に適合させることができます。添加剤は、ヌクレオチドと二価カチオンを使用した当社のプロトコルで示されているように、水溶性化合物のみに限定されません。代わりに、添加剤は、さまざまなpH、リガンド、または^DMSO8に可溶化された薬物など、幅広い条件を包含できます。さらに、リガンドをタンパク質とプレインキュベートすると、色素からの干渉やアーティファクトが減少するため、より再現性の高い結果が得られる可能性があります。脂質や界面活性剤などの添加物は、SYPRO Orangeとの相互作用により、高い蛍光性をもたらす可能性があります。変性曲線の例を 図3A に示します。これは、タンパク質の熱変性による蛍光の大幅な増加と組み合わせた低いバックグラウンド蛍光を示しています。色素とタンパク質の最適な濃度により、最大のS/N比が得られ、反復間で一貫した蛍光シグナルが維持されます。

TSA は、最小限のコンポーネントで単純であるという利点があるため、最適化のための変数の数を減らすことができます。重要なステップには、色素とタンパク質の両方の最適な濃度を決定することが含まれます。TSAは、精製された「行儀の良い」タンパク質を必要とすることに注意することが重要です。タンパク質と添加剤は、TSAで使用される濃度でバッファー内で安定している必要があります。凝集やオリゴマー化が起こりやすいタンパク質や条件では、誤った蛍光測定値が発生する可能性があります。凝集したタンパク質または折り畳まれていないタンパク質は、最初は高い蛍光を示し、変性時にわずかに増加するだけです。また、タンパク質のオリゴマー化は複数の遷移状態を引き起こす可能性があり、分析を複雑にします¹⁰。タンパク質の濃度は、凝集を防ぐために微調整することができます。

TSAは、広範囲のバッファーおよび塩と互換性があり、タンパク質および添加剤の安定化条件の最適化を可能にする¹¹。タンパク質および添加剤溶液の量は、タンパク質および添加剤濃度の制限を克服するために調整することができます。例えば、代表的な結果で使用された10x溶液の代わりに、5xなどの低濃度の添加剤を使用することができます。特に、384ウェルPCRプレートは総サンプルの10 μLという低い量に対応できるため、アッセイの実施に必要なタンパク質と添加剤の相対量は少なくなります。

TSAの強みを考えると、シュードキナーゼなどの研究が進んでいないタンパク質の研究に最適です。偽酵素は、活性酵素³⁴と構造的に相同な触媒的に不活性なタンパク質である。最近の構造的および生化学的研究は、いくつかの疑似酵素が活性酵素であり、ほとんどが非触媒機能を有することを示しました^35,36。触媒的には不活性であるが、偽酵素は様々な疾患に関与しており、足場やアロステリック調節³⁷などの重要な役割を果たしている。しかし、多くの偽酵素の作用機序や機能的意義は不明です。いくつかの偽酵素の活性は、リガンド結合によって調節され、その結果、タンパク質の立体構造変化に関連する熱安定性が増加する¹⁴。TSAは、リガンドの偽酵素への結合を調べて、機能活性に最適なリガンドを決定するための貴重なツールであると提案します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アデノシン 5′-三リン酸二ナトリウム塩水和物	Sigma Aldrich	A2383-10G	代表的な結果に使用されますが、
マイクロプレートキャリアアセンブリで TSA Avanti J-15R	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 リアルタイム PCR システム	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Plates、薄壁、スカート、クリア/ホワイト	バイオ・ラッド	HSP3805
塩化マグネシウム	Sigma Aldrich	M8266-100G	代表的な結果に使用されますが、TSA
塩化マンガン (II) 四水和物	Sigma Aldrich	M3634-500G	代表的な結果に使用されますが、TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film、接着剤、光学	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO オレンジ プロテイン ゲル染色	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma Aldrich	U6625-100MG	代表的な結果に使用されますが、TSA を実行する必要はありません