方法論記事

新規シクロフィリンA阻害剤およびガノデリオールF誘導体の構造誘導設計と開発: シリコ 内アプローチ

DOI：

10.3791/67145

⸱

2026年6月23日

 , 
1College of Arts and Sciences, Qatar University, 2BBR Pty Ltd

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、新薬発見に不可欠なサングリフェリンAとシクロフィリンA/ガノデリオール-F間のタンパク質-リガンド結合相互作用の構造誘導設計プロトコルを提示します。配子-受容体複合体の安定性は分子動力学シミュレーションを用いて評価されました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

サイクリンDs-CDKs軸(シクロフィリンA(Cyp/ガノデリオールF))は、増殖の制御やがん細胞の阻害など、さまざまな過程を通じてがんにおいて重要な役割を果たします。ガノデリオールF誘導体は複数のがんタイプのがんのがん原標的として機能します。本研究は、新規Cyp A阻害剤およびガノデリオールF誘導体の構造誘導設計と開発を用いて、化学阻害剤および選択受容体との相互作用における効果を高める計算された位置を選択することができることを示しました。このアプローチのために、最適な分子相互作用を実現するために多くのソフトウェアアプリケーションが活用されました。全体として、Chemsketchソフトウェアを用いて117個の新規シクロフィリン阻害リガンド分子が構築されました。新規Cyp A阻害リガンドの変換されたPDBファイルは、サングリフェリンA酵素受容体への導入のために準備されました。リガンド-タンパク質のドッキング相互作用はAutoDock 4.2.6ソフトウェアを用いて実施され、最良の幾何学的相互作用が明らかになりました。ドッキング確認はPyMOL 2.5ソフトウェアを使用して行われました。最後に、キメラとマエストロのソフトウェアを用いて水素結合を検出しました。選定されたリガンド-受容体ドッキング複合体は分子動力学シミュレーションを受けました。MDシミュレーションプロセスにより、複合体の安定性が示され、選択したリガンドががん細胞の薬物阻害剤として利用可能であることが示されました。結果では、結合部位の活性アミノ酸がアルギニン55(運動中)、アスパラギン(Asn)、グリシン(Gly)、スレオニン(Thr)、リシン(Lys)、イソロイシン(Iso)、ヒスチジン(Hid)、フェニルアラニン(Phe)、システイン(Cys)と同定され、水素結合リガンドは45 hydroxymiferonicが最も多く含まれていました。それはグリッドボックス座標X38.86、Y座標10.987、Z座標40.734の1nmk受容体に接続されました。GromacsバージョンCHARMM 36力場における分子動力学(MD)シミュレーションにおける1nmk受容体-リガンド複合体の評価は最適度を持ちます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

シクロフィリンAはヒトのCyp Aの強力な阻害剤です。シクロフィリンは免疫系を損なわず、優れた薬理学的特性を持ち、トランスポーター阻害を軽減する強力な阻害剤です。予後不良は、ペプチジル-プロリルイソメラーゼ活性1を持つタンパク質ファミリーであるシクロフィリンの過剰発現と関連しています。シクロフィリンは肝細胞がんを含む多くのがんで過剰発現が報告されています。肝細胞がん(HCC)において、シクロフィリンはがん薬剤耐性と増殖の両方に不可欠です。この阻害法は、原子レベルの分子ドッキングとMDシミュレーションを用いて、DC838とCyp A3の正確な結合部位を特定することで、キノキサリン誘導体に基づく新たな免疫抑制剤を特定するための重要な情報を取得します。

さらに、in vivo研究ではシクロフィリンDC838がコンカナバリン誘発性マウス脾臓細胞増殖を抑制することが示されました。いくつかの研究で、天然物質であるサングリフリンA(SFA)を基に合成された一連のマクロ環性シクロフィリン阻害剤が報告されています。初期の化合物最適化により、m5チロシン残基のヒドロキシル基、C14およびC15の立体中心、およびサングリフェリン核のバリン5m5チロシン5ピペラジン酸三重疫が、化合物効能5に影響を与える重要な因子であることが明らかになりました。SFAのC185C21ジエン単位はスチリル基に置き換えられ、スチレン基がCyp Aのアルギニン(Arg)55-6と積層相互作用するという新しい結合モードを示す強力な化合物を作製できます。免疫抑制性でないシクロフィリン阻害薬はC型肝炎ウイルスの治療に効果的です。シクロスポリンA1、アリスポリビル、その他のほとんどのシクロスポリンはMRP2、MDR1、OATP1B1、その他の重要な薬物輸送体の強力な阻害剤です7,8。

一方、ガノデリオールFはガノデルマ・レウココンセクセンタムから精製され、CDK4/CDK69サイクリンを阻害することで細胞周期の進行を遅らせ、サイクリン依存性キナーゼ(CDKs)は哺乳類細胞周期の制御において重要な役割を果たします。サイクリンD-CDK4/CDK6およびサイクリンE-CDK2は、ガノデリオールFによる細胞周期進行の制御において重要な役割を果たします。したがって、ガノデリオールFは乳がん治療におけるCDK4/CDK6阻害剤として用いられる可能性があります10,11。FAは細胞周期のG1期を阻害し、細胞の生存能力に影響を与えることなくM-CSF依存性のマクロファージ増殖を防ぎます12。免疫抑制剤はCDK2の活性を不活性化することで増殖を抑制します。がんの文脈では、サイクリンD-CDK4/6および他のサイクリンおよびCDKsの役割はよく確立されています。がんはサイクリン-CDK経路の異常な調節を特徴とします。具体的には、細胞がDNA合成を開始する準備ができたとき、CDK4はD型サイクリンと共にG1期を通過する過程を媒介します。この過程はがんの発症と進行に極めて関係しています。

Cyp Aの活性部位は不変触媒アルギニン(Arg55)と、Arg55、グルタミン(Gln)、グリシン(Gly)、スレオニン(Thr)1,13,14などの疎水性、芳香族、極性残基の高度に保存された混合物によって特徴付けられます。シクロフィリンファミリーの活性部位はアラニン(Ala)とアスパラギン(Asn)1も含まれます。一方、SFAの活性部位はArg5515、Gln、Gly、Thr、Ala、Asnのアミノ酸で構成され、SFAのピペラジン酸部分を包む疎水性ポケットを形成します。リガンドなしのCyp Aとは異なり、SFAのマクロサイクルとスピンバイクのリンカーは、Trp121に側鎖の再整列を強制します。

1nmkは、前述の研究17で述べたように、Sanglifehrin Aの特定のPDBコードとして選ばれています。免疫抑制性天然物質であるSFAは、ストレプトマイセス属A92-3081 5,18で初めて発見されました。SFAはCyp Aに高い親和性を示し、CsAと異なる構造を持ち、免疫系を抑制する独自の方法を用いています。SFAの複雑な分子構造は、22員からなるマクロサイクルで、位置23に9炭素のテザーがあり、高度に置換されたスピロ二環状部分で終わっています。線維化性ヒト肺線維芽細胞および特発性肺線維症患者のサンプルを用いたin vitro試験では、SFAがシクロフィリンBの産生を増加させ、コラーゲンタイプIの分泌を抑制することが示されました19,20。全体として、20種類の異なるサングリフェリンがSFA(C16)の分離に用いられました。細胞フリーの競合結合実験では、SFAグループの他のメンバーに比べて約60倍の親和性があります。例えば、SFAは樹状細胞から放出されるIL-12の主な供給源である生体活性IL-12p70の量を大幅に減少させ、樹状細胞の活性を抑制します。本研究は、SFAが強力な新しい免疫抑制薬であることを示唆しています。

このプロトコルでは、Chemsketchソフトウェアを用いたインシリコ法を用いてガノデリオールF/Cyp Aの新規リガンド構造を作成し、互換ソフトウェアでPDBファイルに変換しました。タンパク質-リガンド結合受胎は、創薬および設計プロセスにおいて重要な課題です21,22。リガンドと受容体の相互作用はAutoDock 4.2.6ソフトウェアでドッキングされました。計算ドッキングシステムは通常、複数のタンパク質-リガンド複合体の構成を生成する。1nmk受容体に最もエネルギーが低い候補者を1つまたは数個選ばれ、次の薬剤設計段階で選択し、シリコ薬剤設計試験の効果を確保します。キメラソフトウェアを用いて最適な水素結合配位子を特定しました。最後に、リガンド-受容体複合体に対して分子動力学(MD)シミュレーションを行い、その安定性を測定しました。この方法は以下のプロトコルで説明されています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ChemSketchソフトウェアにおけるリガンドおよびリガンドの 合成(インシリコ )

注意:このソフトウェアはリガンド/分子の構造図、すなわち分子編集に使用されます。

  1. ソフトウェアで示された描画手順に従って、 補足ファイル1 (スクリーンショット1)に示された配位子/構造を描画します。
  2. 完全な構造を描いた後、 f9 を押して構造をきれいにします。
  3. 「 ファイル 」をクリックして「 名前を付けて保存」を選びます。(フォルダに移動してください。例:分子1はフォルダ1に保存されます、という具合です)。
  4. 「名前を付けて保存」タイプをmdl molfilesに変更し、「保存」をクリックします(ファイル名を指定する必要はありません。ソフトウェアが提供するデフォルトのファイル名、例:nonameを使ってください)。
    注:フォルダ内に1つのファイルが作成され、それぞれのファイルは2D構造リガンドのmdl形式を持ちます。
  5. 上記の手順をすべての分子に対して繰り返します。

2. ファイル形式の変換(Open Babelソフトウェア)

注意:ソフトウェアはファイル形式を変換します。ここで、.molファイルは 補足ファイル1 (スクリーンショット2)に示されているように.pdb形式に変換されます。

  1. 左側の入力フォーマットで、ドロップダウンメニューから mol--mdl mol format を選択してください。同様に、右側の出力フォーマットで pdb(タンパク質データバンクフォーマット)を選択します。
  2. 入力フォーマット(左側)で...をクリックしてください。(ブラウズボタン)。
  3. フォルダ(例:フォルダ1)にアクセスし、描いたChemsketchファイルをクリックして 開 いてください。
  4. 出力フォーマットの下で、クリックしてください...
  5. デフォルトのウィンドウが開きます。ファイル名を付けるために ここに1.pdb と入力してください。構造1では 1.pdb と入力し、「 保存」をクリックします。分子/構造2についても同じ手順を繰り返し、 2.pdb と入力します。
  6. 最後に、ソフトウェアインターフェースの中央から 「変換」をクリックします。これにより、mdl mol形式からPDB形式に座標が変換されます。
    注意:これから、フォルダにもう1つファイルが追加されます。各ファイルには次のステップで使われる1つのリガンドpdbファイルがあります。
  7. 新しく作成したファイルを右クリックし、「 一緒に開く」を選択し、 次に メモ帳を選びます。
  8. すべての分子に対して同じ手順を繰り返します。
    注意:MGL 1.5.7ツールをインストールすると、AutoDock 4.2.6がデスクトップに表示されます。
  9. 以下に説明するように入力1nmk.pdbファイルを準備します。
  10. 1nmk.pdbファイルで、pdb.org のウェブサイトにアクセスして1nmk構造を選択して外部配位子をすべて除去します。補足ファイル1(スクリーンショット3)に示されているように、1nmk構造の小分子タイトルの下にある配位子を探してください。
  11. 補足ファイル1(スクリーンショット4)に示されているSFMと名付けられたリガンドを見つけ、1nmkファイルを開きます。PDBのウェブサイトから1nmkのPDBファイルをダウンロードしてください。補足ファイル1(スクリーンショット5)に示されている終了残留物(TER.)を特定してください。
  12. TERの後から終了までの残基から終了までの1nmk構造内の外部配位子(SFM)残基を削除します。修正した1nmkのPDBファイルをシステムに保存します。
    注:1nmk PDBファイルは準備完了し、 表1の受容体アクティブ座標サイトファイルの準備が進みます。
  13. 1nmkファイルを開き、アミノ酸番号55のArgを見つけてください。
  14. 補 足ファイル1 (スクリーンショット6)に示されているように、x、y、zの座標を見つけてください。

3. AutoDock 4.2.6ソフトウェアを用いてドッキングパラメータを準備すること。

  1. デスクトップからAutoDock 4.2.6のツールソフトを開いてください。
  2. 補足ファイル1(スクリーンショット7)に示されているように、AutoDock 4.2.6 4.0を選択して1nmの受容体を準備してください。
  3. ファイルメニューを開き、分子の読み取りを選択し、フォルダに移動して1nmkを選択し、「開く」ボタンを押してください。
  4. 編集ボタンを押して、水素を選択し、追加をクリックします。Polarのみを選択し、OKを押してください。(補足ファイル1、スクリーンショット8)
  5. 編集ボタンを押して「Charges」を選び、「Kollman Charges」を選択してください。
  6. 編集ボタンを押して「Atoms」を選択し、「Assign ad4 type」を選択します(どちらか一方を選んでください)。
  7. ファイルメニューを開き、保存を選択し、pdbqtと入力します。窓が開く。フォルダ1をブラウズし、ファイル名1nmk.pdbqtを入力し、「保存」をクリックします。
  8. Atomから選択し、補足ファイル1(スクリーンショット9)に示されたように追加してください。ソートノードのボックスにチェックを入れ、変換座標を保存し、すべてのレコードを書き込み、OKをクリックします。
  9. リガンドを開き、入力を選択し、次に開いてください。フォルダ1に移動し、ファイルタイプを「すべてのファイル」に変更し、1.pdbを選択して「開く」をクリックします。小さなウィンドウが表示され、選択されたリガンドに関する情報が表示されます。これは補足ファイル1(スクリーンショット10)に示されています。
  10. リガンドを開き、次にトーションツリーを開き、補足ファイル1(スクリーンショット11)に示すようにルート検出を行います。
  11. リガンドを開き、次に出力を開いて、pdbqtとして保存します。フォルダ1に移動し、ファイル名1. pdbqtを入力し、「保存」をクリックします。これは補足ファイル1(スクリーンショット12)に示されている通りです。
    注意:すべてのリガンドpdbqtファイルは準備されます。
  12. グリッドを開き、マクロモレキュールを選択し、1nmkを選択し、次に分子を選択します。警告が表示されます。補足ファイル1(スクリーンショット13)に示されているようにOKをクリックしてください。フォルダ1に移動し、ファイル名1nmk.pdbqtを入力し、「保存」をクリックし、置き換えウィンドウが開いたら「はい」をクリックします。これは補足ファイル1(スクリーンショット14)に示されています。
  13. グリッドを開き、マップタイプを設定し、Ligandを選択し、1をクリックし、Ligandを選択します。これは補足ファイル1(スクリーンショット15)に示されている通りです。
  14. 表1に示すようにGPF受容体の活性座標部位ファイルを準備します。
    注:ファイルGPFは受容体の活性座標部位を表しています(表1参照)。
  15. グリッドをクリックし、グリッドボックスに行き、センターを選択し、アトムを選んでセンターグリッドボックスを入力してください(補足ファイル1、スクリーンショット16)。
    1. ファイルを選択し、その後閉じて現在の設定を保存します。
    2. Gridを選択し、次にOutputを選択し、GPFとして保存します。フォルダ1にアクセスし、ファイル名1nmk.gpfと入力します。
    3. Macromolecule>ドッキング>設定リジッドファイル名を設定し、フォルダ1に移動して1nmk.pdbqtをクリックし、次に「Open」を選択してください。これは補足ファイル1(スクリーンショット17)に示されています。
    4. ドッキングを選択し、1を探し、リガンドを選択します(補足ファイル1、スクリーンショット18)。デフォルトのパラメータが表示されるウィンドウが開きます。補足ファイル1(スクリーンショット19)に示されているように、デフォルトのパラメータを受け入れてください。
    5. 次に 「ドッキング」を選択し、「 パラメータ検索」に行き、「 遺伝的アルゴリズム」を選択すると デフォルトのパラメータが表示され、「 承認」を選びます。これは 補足ファイル1 (スクリーンショット20)に示されている通りです。
    6. ドッキングを選択し、次にラマルク式GAで出力を選択してください。補足ファイル1(スクリーンショット21)に示されています。
    7. フォルダ1にアクセスし、「1nmk.dpf」とファイル名を入力し、「保存」をクリックします。補足ファイル1(スクリーンショット22)に示されています。
      注意:AutoDock 4.2.6のソフトウェアウィンドウを閉じて再度開き、次の分子の手順を繰り返してください。さらに、1nmk.pdbqt、1nmk.gpf、1nmk.dpfはドッキングプロセスの準備が整います。

4. サイグウィン-I(ドッキングプロセス)

注意: GLG および DLG ファイルを作成するには、アルゴリズムを実行してください。このアルゴリズム(AutoGrid)はこのCygwin端末で動作します。Cygwinでフォルダに移動してください。例えば、フォルダ1がCドライブにある場合、「project」というフォルダが1つ、その上に「molecules」というフォルダ、そしてその中のすべてのフォルダが入っているはずです。以下の手順に従ってください。

  1. サイグウィン端末を開けろ。
  2. cd c:/と入力してEnterを押します。次に「cd project」と入力し、Enterキーを押します。
  3. cd分子を入力してEnterを押し、次にcd 1を入力してEnterを押します。フォルダー1はCygwin端末にあります。
  4. ./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg & と入力し、Enterキーを押してください。補足ファイル1(スクリーンショット23)に示されています。
    注:「./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg &」では、-lはマイナス小lです。
  5. tail -f 1nmk.glg を入力して Enterキーを押します。補 足ファイル1 (スクリーンショット4)に示されています。
  6. AutoGridが正常に完了した場合、このCygwinウィンドウを閉じ、新しいCygwinウィンドウを開き、分子2について上記の手順を繰り返します。
  7. この手順をすべての分子で繰り返し、アルゴリズムを実行します(AutoDock 4.2.6)。
    注意:AutoDock 4.2.6の場合、フォルダに移動して同じ手順を繰り返し、フォルダにアクセスしたら入力してEnterキーを押してAutoDock 4.2.6を操作します。
  8. ./autodock4.exe -p 1nmk.dpf -l 1nmk.dlg & を入力してEnterを押します。補足ファイル1(スクリーンショット24)に示されています。
    注意:上記のステップでは「-l」は小文字の「L」で負の符号付きです。
  9. タイプ テイル -f 1nmk.dlg
    注意:AutoDock 4.2.6が完了したら、Cygwinウィンドウを閉じ、分子2の手順を繰り返してください。
  10. すべての分子に対してこのシグウィン手順に従ってください。
  11. 分子用のDLGファイルを作成したら、フォルダ1に行き、WordPadでDLGファイルを開いてください。Ctrl + Fを押して入力し、Enterを3回押すとRMSDテーブルにアクセスできます。これは補足ファイル1(スクリーンショット25)に示されています。
  12. Microsoft Excelのウィンドウを開くか、ページにメモを取って3つの列を作成します:No.、 Min.、Binding Energy、Run。
  13. ログファイルのRMSDテーブルに従ってデータを書き留めます。結合エネルギーはテーブルの上部にあり、観測されたランも同様に示されています。すべての分子に対してこれを行ってください。
    注:結合エネルギーが低い分子は他の分子よりも優れていると考えられています。
  14. 上位20分子の詳細(シリアル番号、最小結合エネルギー、走行数)を一覧にした別のスプレッドシートを作成しましょう。
    注意:以下の手順は上位20分子のみに対して実施されます。

5. シグウィンII

  1. Cygwin端末を開き、 cd c:/ と入力して Enterを押します。
  2. cdプロジェクトと入力してEnterを押し、cd moleculesを入力してEnterを押します。
  3. 選択した上位の分子のフォルダ番号cd と入力し 、 Enterキーを押してください。
    注意:番号はCygwin端末内のフォルダに対応しているはずです。
  4. grep '^docked' と入力し、1nmk.dlg |cut -c9- > 1nmk_run.pdbqtを入力してEnterを押します。AutoGridやAutoDockとは異なり、このモードでは成功した完了メッセージが表示されず、Enterを押すことはなく、補足ファイル1(スクリーンショット26)に示されています。
  5. Enterキーを押すとファイルが作成されます。
  6. cut -c-66 1nmk_run.pdbqt > 1nmk_run.pdbと入力してEnterキーを押してください。ファイルは補足ファイル1(スクリーンショット27)に示されているように作成されます。
  7. シグウィンのウィンドウを閉じろ。
    注:PyMOL 2.5ソフトウェアを使用してドッキング後の配位子と受容体の相互作用を可視化します
    1. PyMOL 2.5ソフトウェアを開き、ファイルを開いてからレセプターを選択します。
    2. ファイルを開いてから、補 足ファイル1 (スクリーンショット28)に示されたように選択したリガンド構成を選択します。
    3. PyMOL 2.5では、Hide MoleculeとHide Receptorを選択します。受容体メニューで図1Aに示すように「表面表示」を選択します。
      注:リガンド-1nmk受容体複合体の水素結合を可視化するために、UCSFのキメラソフトウェアは20の結合エネルギーの低い配位子に使用されます。

6. UCSFのキメラソフトウェアによるH結合の可視化および結果解析

  1. UCSF Chimeraを開き、 ファイルを選択し、開いてドライブのc:/、次にProject、Moleculesに移動し、1nmk.pdbを選択して開いてください。
  2. 分子が位置するドライブを選択し、UCSFのプログラムでタンパク質を開きます。
  3. 残留物を選択し 、 次に UNL Zoomを選択します。
  4. ゾーンを選択し、OKを押してからアクションを選択し、ラベルを選択し、残留物を選択し、名前+仕様子を選択します。
  5. ツールを選択し、次に構造解析を選択し、補足ファイル1(スクリーンショット29)に示された通り、H-ボンドを探す。
  6. デフォルトのウィンドウを開き、 正確な条件を満たさない色のH結合 のチェックボックスにチェックを入れ、 選択したH結合のみを見つけてください。
  7. 新しい調査を開始するには「クリアセレクション」を選択し、その後ズームインして図3に示すようにH結合を表す青/オレンジの色線を検索してください。
  8. 数える債券の数を確認してください。
    注:ズームではArg55、Asn149、Gly150、Lys151、Thr 152、Lys54、Lys155、イソロイシン156 23、ヒスチジン542、フェニルアラニン(Phe)53、システイン(Cys)52、Gly72、Asn71、HID70とのH結合相互作用を示し、 図3A - Dに示すようにタンパク質の活性部位内にあるかどうかを示します。
  9. 水素結合の数と分子数に注目してください。
  10. H結合を示す線の上にマウスを置き、Arg55やメチオニン、Gln、Gly、Thrとの相互作用を示します。
  11. 印刷画面キーを押してください。
  12. ペイントアプリケーションを開き、補足図を貼り付けて名前のフォルダに保存します。
    注:H結合と活性部位アミノ酸を明確に示すために、選ばれた配位子と受容体の2次元構造は以下の通りであるべきです。

7. ドッキング確認とH結合の表示のためのリガンド相互作用図の作成

  1. AutoDock 4.2.6のソフトウェアを開いてください。
    1. 分析を選択し、マクロモレキュールを開いてから1nmkを選択します。これは補足ファイル1(スクリーンショット30)に示されています。
    2. 分析を選択してドッキングを開き、次に「開く」を選択し、dlg.pdbファイルに移動して選択します。補足ファイル1(スクリーンショット31)に示されています。
    3. 分析を選択し、ドッキングを開き、補足ファイル1(スクリーンショット32)に示されたように、AutoDock仮想スクリーニングリガンドを書き込みPDBファイルとして保存するオプションを選択してください。
  2. 補足ファイル1(スクリーンショット33)に示されているPyMOL 2.5ソフトウェアを開いてください。
    1. 保存したdlg.pdbファイルを開き、次に1nmk.pdbファイルを開きます。
    2. ファイルを開き、「分子のエクスポート」を選択し、補足ファイル1(スクリーンショット34)に示された通り「保存」を選びます。
    3. Maestroソフトウェアを開き、ファイルを開いてから、補足ファイル1(スクリーンショット35)に示された「構造のインポート」を選択します。
    4. リガンド相互作用図をインポートし、補足ファイル2に示された2D構造を保存します。

8. MDシミュレーション

注意:LinuxでGROMACSを開くには以下の手順に従ってください

  1. Ubuntu 20.04.6をダウンロードしてください。
    1. PCでWindows機能アプリケーションを有効にしてください。そしてLinuxのWindows Subsystemを選択し、OKボタンを押してください。
    2. これらに従い、 Enter キーを押してGROMACSをインストールしてください:
      1. 「sudo apt-get update」と入力してEnterを押し、次に「sudo apt-get upgrade」と入力してEnterを押します。
      2. 「 sudo apt-get install gcc 」と入力して Enterキーを押し、 さらに「sudo apt-get install cmake 」と入力して Enterキーを押します。
      3. sudo apt-get install built-essentialと入力してEnterを押し、次にsudo apt-get install liDevfftw3-dと入力してEnterを押します。
      4. 「sudo apt-get install GROMACS」と入力し、Enterキーを押してからShift+Ctrl+Tを押します。
    3. パーソナルコンピュータPCでフォルダを開き、 補足ファイル1 (スクリーンショット36)に示す通り「GROMACS」と名付けます。
    4. GROMACSフォルダを開き、 Shift+Ctrl+右キー を押してLinuxに入ります。
      注:シミュレーションは水モデルおよびGROMACSバージョン4.0、Win64マルチコアバージョンを使用し、CHARMM 36フォースフィールドを組み込んでいました。タイムステップは2 fsに設定され、カットオフ距離は1.0から1.2 nmに設定されました。

9. GROMACS pdb2gmxモジュールを用いたリガンドトポロジーの作成(補足ファイル1、スクリーンショット37)

  1. lig.groファイルを作成し、 lig.pdbにgrep UNL 135_clean.pdb > を入力して Enterキーを押してタンパク質構造からリガンドを抽出し、ファイル内で「UNL」を「LIG」にリネーム変更します。
  2. PyMOL 2.5でlig.pdbを開き、不要な原子を「選択」を押して「原子を削除」を押して削除します。保存をクリックすると、クリーンになったバージョンをlig_clean.pdbとして保存してください。
  3. Avogadroでクリーンになったファイルを開いてBuildツールで水素を追加し、lig.mol2として保存します。テキストエディタでファイルの上部を編集し、残留名がLIGに設定されていることを確認してください。
  4. perl sort_mol2_bonds.pl lig.mol2 lig_fix. mol2 を入力して Enterキーを押します。
  5. CGenFFを使ってリガンドトポロジーを生成します。lig_fix mol2をアップロードし、入力を処理し、lig_fix.pdbをダウンロードします。Python環境を起動し、Python cgenff_charmm2gmx_py3_nx1.py LIG lig_fix. mol2 lig.str charmm36-jul2022.ffを実行し、Enterキーを押してください。
    注意:このステップでは4つのリガンドファイル(lig.prm、lig.itp、lig.top、lig_ini.pdb)を生成します。
  6. ligand.groファイルを生成し、gmx editconf -f lig_ini.pdb -o lig.groと入力してEnterを押します。
  7. prot_clean.pdbに非リガンド原子だけを保存してタンパク質を分離し、UNL原子が複合体の上部に記載されるようにします。

10. GROMACS pdb2gmxモジュールにおけるタンパク質トポロジーの作成(補足ファイル1、スクリーンショット38)。

  1. タンパク質トポロジーを準備し、 入力 gmx pdb2gmx -f prot_clean.pdb -o pro.gro -ter を入力して Enterを押します。
  2. pro.groファイルの末尾にlig.groファイルを追加した後、タンパク質とリガンドの複合体を作成します。次に、gmx、editconf -f complex.gro、-o、box.gro、-c -d、1.0 -bt、立方体と入力し、Enterキーを押してください。
  3. 平衡を維持するために特定の点荷荷水モデルで溶媒を生成する。 gmx solvate -cp box.gro -cs spc216.gro -o solv.gro -p topol.top Enterを押してください。
  4. イオンファイルを作成し、gmx grompp -f ions.mdp -c solv.gro -p topol.top -o ions.tpr と入力し、Enterボタンを押してください。gmx geneon -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral を入力してEnterを押し、グループ15を選択してイオンを追加してください。
  5. エネルギー最小化を生成する em.gro。
  6. gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr と入力してEnterを押し、gmx mdrun -v -deffnm emと入力してEnterを押します。
    注:溶媒系は最大50,000ステップでエネルギー最小化され、力の収束基準は1,000.0 kJ/mol/nmです。
  7. インデックスファイルを作成し、 gmx make_ndx -f lig.gro -o index_lig.ndxと入力し、 Enterキーを押してください。
  8. 入力 :gmx genrestr -f lig.gro -n index_lig.ndx -o posre_lig.itp -fc 1000 1000 1000 そして Enter.
  9. index.ndxファイルを生成し、gmx make_ndx -f em.gro -o index.ndxと入力し、Enterキーを押してください。
  10. NVT平衡を生成し、 nvt.gro ファイルを入力してください。 gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr を押してEnterを押します。次に、 gmx mdrun -deffnm nvt と入力し、 Enterキーを押します。
    注:系の平衡は、系の原子数(N)、体積(V)、温度(V)(NVT)のアンサンブルに対して、27.35°C(300.5 K)の温度で100 psで実施されました。
  11. 位相ファイル topol.top を更新して、リガンド位相とパラメータを加えてNPTを作成します。
  12. NPT均衡を生成する。
  13. 第2相NPT平衡を作成し、 gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr を入力して Enterを押し、 gmx mdrun -deffnm npt と入力して Enterを押します。
    注:平衡NVTは粒子数、体積、温度を指し、平衡NPTは粒子数、圧力、温度の安定性を指します。MDシミュレーションの結果を生成するにはNVT.mdpおよびNPT.mdpファイルが必要です。

11. 位置拘束具を解除し、生成分子動力学シミュレーションを実行してデータ収集

  1. gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -n index.ndx -o md_0_10.tpr を入力して Enterを押します。次に、gmx mdrun -deffnm md_0_10と入力してEnterを押します。
  2. 複体の安定性を検証するために、系を1 ns MDシミュレーションにかけます。
    注:二乗平均平方根偏差(RMSD)は、原子の平均構造偏差を基準構造と比較して定量化し、変動平均二乗偏差(FMSD)は原子の平均位置周辺の時間平均的な揺らぎを測定します。この2つの値はMDシミュレーション実行を最終決定するために必要です。
  3. RMSD、FMSD、H結合、自由エネルギーなどの構造解析を行います。
  4. qtgrace_v026_win7ソフトウェアとmd_0_10.groファイルを使って解析グラフを作成し、VMDソフトウェアで軌道ボックスを表示します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

序論で述べたように、in vivoおよびin vitroの研究は、シクロフィリン阻害剤がサングリフェリンの構造を簡素化し、マウスの細胞周期を妨げることで脾臓の増殖を減少させる上で重要であることを示しています。さらに、シクロフィリンAはガノデリオールF誘導体とともに、PPIASE活性を通じてタンパク質の折りたたみ、免疫応答、細胞シグナル伝達において重要な役割を果たしています。さまざまながんでのアップレギュレーションは、治療の標的としての可能性を示唆しています2,25。リガンドと受容体相互作用の知識は、特定の疾患を理解し、より効果的な薬剤を作るために不可欠です。このレベルの詳細を達成するには、迅速かつ高度な分子可視化が必要です26,27。計算分子ドッキングは、...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

新しい免疫抑制性天然物質であるSFA(1nmk分子受容体)がスト レプトマイセスから抽出されました。分子ドッキング解析を用いて、構築されたリガンドと標的タンパク質の結合エネルギーを決定しました。結果は、設計されたすべての配位子の中でSFAがCsAと構造的に異なり、CypA 16にかなりの親和性を示すことが示されました。ペプチジル-プロリルシストランス異性化酵素活性を持つCyp Aは、外部受容体CD14716に結合することでさまざまな細胞プロセスを制御します。本研究では、新規Cyp A阻害剤およびSFA 1nmk受容体のリガンドの親和性を計算しました。AutoDock 4.2.6の初期の応用は、タンパク質および核酸複合体の結合機構および触媒特性の解析にありました。

AutoDock 4.2.6ソフトウェアの精度は約68%37ですが、リガンドとタンパク質の結合...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者たちには利益相反はありません。

材料

```html

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Autodock Autodock v4.2.6http://autodock.scripps.edu/downloads/autodock-registration/autodock-4-2-download-page/
CGenFFCGenFFv2024https://cgenff.umaryland.edu
Chemsketch Chemsketch v2024http://www.acdlabs.com/resources/freeware/
Cygwin terminal Cygwin terminal v3.6.3http://www.cygwin.com/
Gromacs tutorialGromacs tutorialv25.04 (Plucky Puffin)http://www.mdtutorials.com/gmx/complex/index.html
MGL tools MGL tools v1.5.7mgl tools 1.5.6 rc3
Open babelOpen babelv3.1.1http://openbabel.org/wiki/main_page
PyMOLPyMOLv3.1.6.1PyMOL | pymol.org
UbuntuUbuntuv25.04lhttps://ubuntu.com/download/desktop
UCSF chimeraUCSF chimerav1.19chimera-1.17.3-win64.exe
```

参考文献

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