方法論記事

細胞外小胞からのMicroRNAの次世代シーケンシングのための超高感度cDNAライブラリー調製

DOI：

10.3791/67154

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2025年6月13日

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1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞外小胞(EV)には、レシピエント細胞を調節する細胞特異的なマイクロRNAが含まれており、その同定により、バイオマーカーとしての機能と役割が明らかになる可能性があります。当社の最適化されたcDNAライブラリ調製プロトコルは、Illuminaシーケンサーとの互換性のためにペアエンドデュアルインデックスバーコードを使用しながら、サンプルのマルチプレックス化と低入力EVの処理の強化を可能にする独自のバーコードを導入しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

最近の研究では、すべての生体液に見られる小さな細胞外小胞(sEV)が、タンパク質、DNA、およびRNAをチャネル化することにより、細胞間コミュニケーションに重要な役割を果たしていることが示されています。sEVにパッケージ化されたマイクロRNA(miRNA)は、レシピエント細胞における重要な送達可能な調節因子として浮上しています。正常細胞と疾患細胞から分泌されるsEVは異なるmiRNAカーゴを持っているため、最近のsEV-miRNAプロファイリング研究は、それらが新しい循環バイオマーカーの同定に役立つ可能性があることを示唆しています。しかし、多様な生体液中を循環する細胞/疾患特異的なsEVは、一度単離されると、従来の分光法では定量化が一般的に困難であるmiRNAの量が少なくて済みます。クローニングされたmiRNA配列の増幅を可能にするSmall Non-coding RNA Next Generation Sequencing(NGS)は、sEVのmiRNAカーゴを評価する貴重な機会を提供します。残念ながら、市販のcDNAライブラリ調製手順では、単離されたsEVから得られる定量化できない量をはるかに超えるRNAインプットが必要になることがよくあります。

したがって、既存のcDNAライブラリ調製手順(つまり、最初は低インプットで高度に分解されたホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)RNAの分析に最適化)の堅牢性とマルチプレックス機能を考慮して、sEV miRNAの分析への適用性を評価しようとしました。重要なことは、シーケンシングチップの最近の技術的なクラスタリングの改善を考慮に入れて、シーケンシングおよびマルチプレックス機能を強化するために、ペアエンドのデュアルインデックス互換cDNAライブラリ調製ワークフロー内で転写物バーコードアプローチを適応させようとしたことです。8.4 × 109 sEVを16回の複製で抽出したRNAと、10sEV の10 sEVから2.5 × 107 sEVまで減少させたsEVから抽出したRNAを使用して、この方法論の再現性と感度を評価しました。このデータは、16 個の 3' アデニル化 DNA バーコードにより、合計 3.15 pg の低分子ノンコーディング RNA または 1.35 pg の miRNA を使用して、リピート全体で sEV-miRNA プロファイルを高い再現性と感度で検出できることを示しています。

概要

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小さな細胞外小胞(sEV)は、ナノサイズ(直径30~200 nm)の細胞由来粒子で、リン脂質二重膜に包まれたもので、リン脂質二重膜は起源の細胞から受け継がれ、分子カーゴを強力に保護します1,2。事実上すべての細胞がsEVを産生し、細胞間コンパートメントに放出することは広く受け入れられており、これはほとんどの体液(すなわち、血液、尿、唾液など)で検出できます2,3,4。近年の研究では、安定して内包された分子カーゴ(DNA、RNA、タンパク質、脂質など)5,6,7 sEVは、一度接触したりレシピエント細胞に送達されたりすると、細胞間コミュニケーションを媒介することが実証されている8。現在の研究努力は、これらの分子カーゴを正確に同定し、監視するために、多様な生体流体からの細胞特異的sEVの単離を改善することに焦点を当てている9,10。sEVには、細胞送達時に調節機能を保持する小さなノンコーディングRNA、特にマイクロRNA(miRNA)が含まれていることを考慮すると、多くの研究は、その起源細胞の状態を明らかにすることができるバイオマーカーとしてのmiRNAの有用性を評価することに焦点を当ててきました11,12,13。

マイクロRNA(miRNA)は、19から25ヌクレオチド(nt)の範囲のサイズを持つ小さなノンコーディングRNAの大きなクラス(ヒトでは~2,000種類)を表し、mRNAターゲットの3'非翻訳領域の不完全な相補部位に結合し、それらの分解および/または転写後抑制を指示します14,15。機能的には、miRNAは多くの生物学的プロセスを制御することが説明されており、それらの発現の調節解除は、癌を含む疾患の発症および発症に寄与する分子、生化学的、および生理学的プロセスの変化と関連している16,17,18。重要なことに、疾患細胞、特にがん細胞は、正常細胞と比較してmiRNAの発現が異なるだけでなく18、sEVへのパッケージングも異なることが研究で示されています19,20。

いくつかの研究は、正常細胞および疾患細胞19,21,22におけるsEVのパッケージングを指示する分子プロセスおよび経路の確立に焦点を当てているが、バイオマーカー研究は現在、sEVを介して特定の疾患/がん細胞によってパッケージ化され分泌される、識別可能な小さなノンコーディングRNAおよび/またはmiRNAシグネチャーを特定することに焦点を当てている。したがって、多様なヒト体液からの疾患細胞特異的sEVの標的分離およびそれらのマルチオミクス分子カーゴの評価により、多様なヒト疾患および癌の非侵襲的検出のための診断および予後アッセイの開発が可能になる可能性がある23,24,25,26。sEV-miRNAは最も研究されているノンコーディング転写産物ですが、他の小さなノンコーディングRNA種(すなわち、miRNAアイソフォーム(isomiR)、piwiRNA、トランスファーRNAフラグメント(tRF)、rRNA、オーファンノンコーディングRNA(oncRNA)など)も、循環するsEV-バイオマーカーとしての潜在的な有用性について評価されており、特にさまざまながんの検出に重点が置かれています27,28,29,30,31,32.

有利なことに、低分子ノンコーディングRNA転写産物(miRNAを含む)の次世代シーケンシング(NGS)解析は、バーコーディングおよびcDNAライブラリー調製に続いて、循環するsEVに含まれる既知および/または未知の低分子ノンコーディングRNA種の探索に理想的であり、これは疾患と関連している可能性がある27。実際、sEV small-RNA NGSは、ターゲット特異的技術(マルチプレックスPCR、マイクロアレイ、カスタマイズパネルなど)でグローバルに評価した場合、他の方法では未知のままである細胞特異的なsmall noncoding RNA転写産物の発見にハイスループットアプローチを提供します32、33、34。我々は、以前に、高度に分解された低濃度のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)RNAの分析のために開発した超高感度で再現性の高いcDNAライブラリー調製プロトコルを最適化したことを考慮し、37,38,39,40内にカプセル化された小さなノンコーディングRNAおよびmiRNAの分析に適合させようとした。

Illumina HiSeq2500装置が廃止されたことで、sEVカーゴ37,40の高品質なシングルエンドデュアルインデックスmiRNA解析を長年にわたって提供してきましたが、現在はペアエンドのデュアルインデックスケミストリーを使用して更新されたシーケンシング装置に適応した場合のプロトコルの再現性と感度を探求しようとしました。元のプロトコルのマルチプレックス機能を保持する目的で、small RNA cDNA転写産物の調製用に既存の16のバーコードを維持してから、それらをペアエンドデュアルインデックスケミストリーに統合しました。i5 と i7 のバーコードのペアのみを使用して、堅牢なラボベースの cDNA ライブラリの調製が可能になり、最大 16 個の個々のサンプルを同時に処理および分析することで、低インプット sEV RNA の分析再現性が向上します。そこで、ヒト血漿sEVから単離された超少量のmiRNAを用いて再現性の高いcDNAライブラリーを作製するために必要な生化学的プロセス、更新されたバーコード、PCRおよびサイズマーカープライマー、および単離ステップについて紹介します。

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プロトコル

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1. すべての試薬とオリゴヌクレオチドは、以下のように調製します。

注:このプロトコルで使用されるすべてのヌクレオチドは、このプロトコルの実施に使用される濃度で 図1 および 補足ファイル1 に詳述されています。プライマー配列については 、補足ファイル2 を参照してください。

  1. キャリブレーターカクテルのストック溶液を調製し、これは個々のライゲーションでさまざまな酵素反応のコントロールとして使用されます。
    1. キャリアオリゴヌクレオチド(0.5 μM)(Supplemental File 1)をRNaseフリー水で再懸濁します。
    2. 10 個のキャリブレーター (各 10 μL、 Supplemental File 1) を 1 本の 1.5 mL チューブに結合して 100 μM ストックに到達し、キャリアオリゴヌクレオチドを使用して希釈して 0.0052 nM 溶液に到達し、-20 °C で保存します。
  2. 17種類のアデニル化3'アダプター(16種類の実験的アダプターと1種類のテストバーコード付きアダプター)のそれぞれを、50 μMの濃度でヌクレアーゼフリー水で再懸濁します。
    注:各アダプターは、大きなストックの凍結融解サイクルを防ぐために、-80°Cで最大2年間保存するために、2.5μLを含む個々のチューブに分注されています。
  3. RNA抽出キャリア(補足ファイル1)、RNA 3'-ライゲーションキャリア(補足ファイル1)、RNAライゲーションテスト(補足ファイル1)、3'ライゲーション(補足ファイル1、19 nt-3'アダプターと24 nt-3'アダプター)、5'ライゲーション(補足ファイル1、5'アダプター-19 nt-3'アダプターと5'アダプター-24 nt-3'アダプター)など、さまざまな実験用RNAオリゴヌクレオチドを250 ng/μLに再懸濁します。
  4. HPLC精製した5'アダプターをヌクレアーゼフリー水で100μMに希釈します(図1A)。
  5. RTおよび最初のPCR 5'および3' RT/PCRプライマーをヌクレアーゼフリー水で100 μMに再懸濁します(図1B)。
  6. 2回目のPCR 5'および3' PCR i7およびi5オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼフリー水で100 μMに再懸濁します(図1B)。
    注:各DNAプライマーを最大10回の実験に分注し、-80°Cで保存してください。
  7. ポリアクリルアミド変性(PAA)ゲルローディング色素を調製し、1 mLをチューブに混合し、アリコートして-80°Cで保存します。
    1. ヌクレアーゼフリー水50 mLにNa2H2 EDTA18.6 gを加えて、0.5 M Na2H2 EDTAの溶液を調製します。調製したNa2H2 EDTA溶液にNaOHペレットをゆっくりと加え、pH 8.0にします。ddH2O を使用して 100 mL まで容量を補い、0.5 M Na2H2 EDTA(pH 8.0)ストック溶液を得ます
    2. ブロモフェノールブルー15 mgを15 mLチューブに秤量し、粉末を600 μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、14.25 mLの脱イオンホルムアミドを加えます。最後に、0.5 M Na2H2 EDTA、pH 8.0 溶液 150 μL を加えます。最終的なPAA溶液を1 mLチューブに分注し、-80°Cで保存します。
    3. 5倍アガロースゲルローディング色素を調製します。
      1. 1.86 gのNa2H 2-EDTAを50 mLのRNaseフリー水に秤量して溶解し、NaOHペレットを添加してpHを8.0に調整します。RNaseフリーの水を100 mLに加えて、50 mM Na2H2 EDTA溶液を得ます。
      2. 50 mM Na2H2 EDTA 5 mL に、ブロモフェノールブルー 20 mg、キシレンシアノール FF 20 mg、および Ficoll 400 型 2 g を添加します。3種類の色素を含むチューブをボルテックスで混合し、さらに50 mM Na2H2 EDTAを5 mL加えます。5x アガロースゲルローディング色素の個々の 1 mL チューブを分注し、-80°C で保存します。

2. EV RNAサンプルの調製

  1. sEVの単離後、透過型電子顕微鏡(TEM; 図2)、ナノ粒子追跡分析(NTA; 図3)、超解像ナノイメージング(図4)を用いた表面タンパク質分布、または同等のsEV定量技術を用いた。
  2. 等量のsEVを異なるチューブに分注し、RNase-A(12.5 μg/mL)を添加し、37°Cで1時間インキュベートします。
  3. small RNA extraction kit を使用して、sEV から miRNA を含む低分子ノンコーディング RNA の抽出を開始し、RNA 相の単離を開始します。
  4. RNA 溶解バッファーの下層水相を分離し、新しいチューブに添加し、各 RNA サンプルに 4 ng の RNA キャリアオリゴヌクレオチド(Supplemental File 1)を添加してから、製造元の指示に従ってカラム単離を行います。
  5. 個々のRNAサンプルを9.5 μLまでスピードバキュームして、cDNAライブラリ調製プロトコルを開始します。

3. 3'バーコード付きアダプターのライゲーションを16個のRNAサンプルと1個のテストサンプルでセットアップします

  1. 16 個の個々の sEV-RNA 試料を同定し、9.5 μL のヌクレアーゼフリー水で 1.5 mL のシリコン処理マイクロ遠心チューブに分注し、実験開始の少なくとも 10 分前に氷上に置きます。
  2. 実験前に、10x RNA Ligase Buffer(ATPなし)を新鮮に調製してください。
    1. 1.5 mLのシリコン処理チューブに、ヌクレアーゼフリーの二重蒸留水343 μL(ddH2O)、1 M Tris pH 7.5 500 μL、1 M MgCl2 100 μL、20 mg/mL ウシ血清アルブミン50 μL、14 M 2-メルカプトエタノール7 μLを混ぜ合わせます。
    2. チューブをフリックして溶液を混合し、卓上遠心分離機で室温(RT)で2,000 × g で2秒間遠心分離し、氷上に置きます。
      注:「2秒間の遠心分離機」を説明するすべてのステップは、RTの速度が2,000 × g以下の微量遠心分離機を使用して行われます。
  3. 0.0052 nMキャリブレーターカクテルを氷の上に10分間置いて解凍します。
  4. 1.5 mLのシリコン処理チューブで、40 μLの10x RNA Ligase Buffer、10 μLの0.0052 nM Calibratorカクテル、および40 μLのヌクレアーゼフリーddH2Oを組み合わせて、18反応用のLigation Master Mixを調製します。
  5. 1.5 mLチューブをフリックして回転させ、氷の上に置きます。
  6. それぞれに分注した16種のsEV RNAサンプルに4.5 μLのLigation Master Mixを加え、100 ngのRNAライゲーション試験オリゴヌクレオチドを含む試験ライゲーション反応(Supplemental File 1)を9.5 μLの容量で加えます。フリックしてチューブを混ぜ合わせ、回転させてから、チューブを氷の上に戻します。
  7. 16個のサンプルとテスト反応を90°Cで1分間ヒートブロックに移し、氷に戻します。
  8. 4 μLの50% PEGを各チューブに個別に移し、フリックして混合し、チューブを回転させてから氷上に戻します。
  9. 17個の3フィートバーコードアダプター(16個の実験用(#1〜#16)およびテストアダプター(#17))のそれぞれから2.5μLのアリコートを解凍し、氷の上に置いて解凍します。
  10. 17個のアダプターをそれぞれ1μL、Ligation Master Mix(4.5 μL)と50% PEG(4 μL)を使用して、sEV-RNAを含む対応する16個のサンプルと1つのテストサンプルに移します。
    注:すべての溶液と反応は、材料の損失を防ぐために、溶液を上下にピペッティングするのではなく、チューブをフリックして回転させることによって混合されます。
  11. 希釈したT4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q ligation enzyme 10 μLと10 μLのヌクレアーゼフリーddH2Oを新しい1.5 mLシリコンチューブに添加して、希釈したT4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q Ligation enzymeを調製します。
  12. 希釈したT4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q ライゲーション酵素 1 μL を 17 本のチューブ (16 個の実験 RNA サンプルと 1 個の試験 RNA サンプル) のそれぞれに転写します。ピペットで上下させたり、各チューブ間でチップを交換したり、チューブを氷の上に置いたり、フリックミックスしたり、遠心分離したり、チューブを氷の上に置いたりしないでください。
  13. ライゲーションを、冷蔵室のアイスバケツのチューブホルダーに入れた新鮮な氷に、一晩で最大18時間セットします。

4. 3'アダプターライゲーションされた低分子RNAのPAGE単離

  1. 17本のチューブを90°Cのヒートブロックに1分間置いてT4 RNAリガーゼ2を不活性化し、氷上に2分間置いて冷まします。
  2. 1 μL の GlycoBlue と 26 μL の 5 M ヌクレアーゼフリー NaCl を新しいチューブに混ぜ合わせ、この沈殿液 1.2 μL を 17 本のチューブのそれぞれに移します。
  3. 17本のチューブのそれぞれに63 μLの100%エタノールを加え、閉じてフリックし、2秒間スピンダウンしてから氷に戻します。
  4. 16本のsEV RNAチューブの内容物を1本の1.5 mLシリコン化チューブに結合し、試験用RNAライゲーションチューブを分離したままにします。
  5. 結合したサンプルを含むチューブを3回反転させて混合し、2秒間短時間遠心分離し、氷上に60分間置いて沈殿させます。
  6. 次のように、大きな(16 x 20 cm2)15%ポリアクリルアミド(PAGE)ゲルを準備します。
    1. シリコン化(すなわち、シリコンベースの溶液を使用)し、短いガラス板と長いガラス板を0.1cmのスペーサーで一緒に鋳造します。
    2. 50 mLコニカルチューブに、9 mLのシステム希釈液、18 mLのシステム濃縮液、3 mLのシステムバッファー、240 μLのAPS(9%)、および12 μLのTEMEDを組み合わせて、15% PAGEゲルミックスを調製します。
    3. 30 mLピペットを使用して、ガラスプレート間で溶液を迅速に移します。ゲルが重合する前に、14ウェルコーム(厚さ0.1 cm)を加え、ゲルをRTで30分間直立させます。
  7. 結合したRNAサンプルを氷からチューブで回収し、16,000 × g で4°Cで60分間遠心分離します。
  8. その間、櫛を静かに取り外し、シンクの上の噴出ボトルでヌクレアーゼフリーのH2Oでウェルを洗浄し、乾燥させてから、上部と下部の両方のリザーバーが0.5xトリスホウ酸EDTA(TBE)溶液で満たされているゲル装置に15% PAGEをセットアップし、450Vで30分間の事前実行を行います。
  9. 遠心分離機からチューブを取り外し(ステップ4.6)、ペレットを乱さずに、端に10 μLのノンフィルターチップを真空システムに接続されたパスツールピペットを使用して、RNAペレットを慎重に乾燥させます。
  10. 沈殿した16個のRNAライゲーションを含むRNAペレットを20 μLのヌクレアーゼフリーddH2Oに再懸濁し、20 μLのPAAゲルローディング溶液を添加します。チューブをフリックして混合し、2秒間遠心分離し、氷の上に置きます。
  11. ゲル装置の0.5x TBEを新しい0.5x TBEと交換します。
  12. 20 bpのRNAサイズのラダー、2つの3'-ライゲーション短鎖DNAサイズマーカーをそれぞれ入れたチューブ2本(補足ファイル1)、RNAライゲーション試験オリゴヌクレオチドを1本入れたチューブ(バーコード付きアダプター#17でライゲーション)をセットします。
  13. 各チューブ(ラダー、3'ライゲーションショートDNAオリゴ、RNAライゲーションテスト)に、20 μLのPAAゲルローディング溶液を加えます。
  14. ライゲーションされた RNA サンプルチューブ 16 本と RNA ライゲーション試験チューブ 1 本を 90 °C で 1 分間セットし、氷上に戻します。
  15. 下部と上部の両方のリザーバーから0.5x TBEバッファーを交換し(つまり、ローディング中にウェル間の相互汚染がないように、ウェルのレベルより下にバッファーを追加します)、ゲルの端にあるラダー、RNAテストライゲーション、ウェルの両側にある2つの短いDNAサイズマーカーに16個の結合された3'バーコード付きRNAライゲーションをロードします( 図5を参照)。
  16. 15% PAGEゲルをすべてのサンプルで450 V(~35 mA)で90分間、冷却条件(つまり、ファンがガラスプレートに空気を吹き付ける)で泳がせます。
  17. ガラスから15% PAGEを取り出し、SYBRゴールド溶液(0.5x TBE25 mLに10 μL SYBRゴールド)を軽くスプレーし、暗所で5分間傾けて放置します。
  18. ゲルを青色光トランスイルミネーター(図5)にセットし、19 nt-3'アダプターと24 nt-3'アダプターサイズマーカーの両方の短いDNAオリゴヌクレオチドを定規で整列させ、ライゲーションされたmiRNAコンストラクトを含むゲルの領域を切り取ります(図6 は3'ライゲーションと得られたコンストラクトを示しています)。これとは別に、RNAテストライゲーションの上部バンドを切除しますが、これは翌日の5'ライゲーションのテストにも使用されます。
  19. 2つの別々の切開ゲル片(すなわち、16個のRNAサンプル用およびテストライゲーション用)を、1.5 mLのシリコン処理チューブにセットされた異なる0.5 mLゲルブレーカーチューブに入れ、16,000 × g でRTで3分間遠心分離し、次に2つのセットの断片化されたゲルピースを300 μLの400 mM NaCl溶液で再懸濁し、チューブを閉じます。 パラフィルムで密封します。
  20. チューブをシェーカーにセットし、1,100rpm、4°Cで一晩(16〜17時間)攪拌します。

5. 5フィートアダプターの結紮

  1. 2つの別々の断片化ゲルとその溶液(16 x 3'バーコード付きサンプル(バーコード#1〜#16)および3'バーコード付きテストRNA(バーコード#17))を2つの別々の5 μmフィルターチューブに移し、それぞれを1.5 mLのシリコン処理チューブにセットし、パラフィルムで密封し 、RT で2,300 gで5分間遠心分離×。
  2. ろ過した各溶液に950 μLの100%エタノールを加え、チューブを閉じ、反転させて混合し、2秒間スピンダウンし、チューブをパラフィルムで密封し、氷上に1時間置きます。
  3. ヌクレアーゼフリー水1mLとDMSO1mLを組み合わせ、50%水性DMSOストックを新たに調製し、チューブをアルミホイルで包み、暗所でRTで保存します。
  4. 15% PAGEゲルを調製し、セクション4.6に記載されている手順に従って事前に実行します。
  5. 3' ライゲーションされた 16 個の RNA サンプルと試験 RNA ライゲーションを 16,000 × g で 4 °C で 60 分間遠心分離し、ライゲーションされた RNA を沈殿させます。
  6. RNAペレットに触れずに上清を慎重に取り除き、真空乾燥させます。
  7. 16個のRNAサンプルの3'ライゲーションペレットを再懸濁し、ピペッティングを行わずに、それぞれ8μLのヌクレアーゼフリーddH2OでRNAを試験します。チューブを軽くフリックして混合し、RTで2秒(2,000 × g)遠心分離し、チューブを氷上にセットします。
  8. 10x RNA Ligase Buffer (ATP入り)を調製するには、1 M Tris(pH 7.5)500 μL、1 M MgCl2 100 μL、20 mg/mL アセチル化BSA 50 μL、10 mM ATP 200 μL 200 μL、2-メルカプトエタノール 14 M 7 μL 、および RNase-フリー水 143 μL を 1.5 mL チューブに混合します。
  9. 2 μL の 10x RNA リガーゼバッファー (ATP を含む)、100 μM 5' アダプター 1 μL、および 50% 水性 DMSO 4 μL を各チューブに加えます。フリックして混合し、室温で2秒間遠心した後、チューブを90°Cで1分間セットしてRNAを変性させ、氷上に戻します。
  10. 50% DMSOを3 μL加え、フリックして混合し、遠心してペレットにし、各チューブに3 μLのT4 RNAリガーゼを加え、チューブをフリックし、RTで2秒間遠心分離し、チューブをシェーカーに37°Cで75分間セットします。
    注意: ピペットで上下させないでください。
  11. 20 nt DNAラダーと、5'ライゲーションサイズマーカー長DNAオリゴヌクレオチドを含む2本の別々のチューブ(補足ファイル1、5'adapter-19 nt-3'アダプター、および5'adapter-24 nt-3'アダプター)を準備し、各チューブに20 μLのPAAを加えます。
  12. 5'アダプターライゲーションが完了したら、2つのライゲーション(つまり、16個のRNAサンプルとテストRNA)のそれぞれに20μLのPAAを加え、フリックして混合し、スピンダウンして90°Cで1分間セットした後、チューブを氷の上に戻します。
  13. ゲル装置の上部と下部のリザーバーを空にし、上部リザーバーのウェルのレベルの下に新鮮な0.5x TBE溶液を追加します。
  14. ゲルの端にラダーをロードし、5'ライゲーションされた試験RNAサンプル、2つのサイズマーカー長DNAオリゴヌクレオチド(すなわち、5'アダプター-19 nt-3'アダプター、および5'アダプター-24 nt-3'アダプター)を、5'ライゲーションされた16 RNAサンプルがロードされるウェルを囲むウェルにロードします(図6 は5'ライゲーションと得られたコンストラクトを示しています)。ゲルを450ボルトで90分間泳がせます。
  15. 分析が完了したら、ゲルを装置とガラスから取り出し、SYBR Gold溶液(すなわち、0.5x TBEの25 mLに10 μLのSYBR Gold)をスプレーし、5分間暗所に置きます。
  16. 5'アダプター-19 nt-3'アダプターと両方の5'-アダプター-24 nt-3'アダプターサイズマーカーの長いDNAオリゴヌクレオチドをサイズガイドとして使用して、5'ライゲーションされた16個のRNAサンプルを含むゲルの切片を直接切り取ります(図7)。
    注:試験RNAライゲーションはゲル上で評価され、5'アダプターのライゲーションがサイズマーカーと同等のサイズのシフトを可能にすることを実証します。試験 RNA ライゲーションはゲルから切除されません。ライゲーションされた16個の結合RNAサンプルのみ。
  17. 16個のライゲーションされたRNAサンプルを含む切り出したゲル片を、1.5 mLチューブにセットした0.5 mLゲルブレーカーチューブに移し、16,000 × g で室温で3分間遠心した後、300 μLの300 mM NaClと1 μLの100 μM 3' RT/PCRプライマー(図1B)をチューブ内の破砕ゲル片に加えます。
  18. チューブをパラフィルムで密封し、1,100rpm、4°Cで攪拌するシェーカーに一晩(17-18時間)置く。

6. バーコード化された5'および3'ライゲーションされた低分子ノンコーディングRNAおよびmiRNAの逆転写

  1. 粉砕したゲルが入ったチューブから溶液を、1.5 mLのシリコン処理されたRNaseフリーチューブに挿入した5 μmのフィルターチューブにピペットで移し、短時間回転させて溶液がフィルターを通過するようにします。
  2. このろ過溶液に950 μLの100%エタノールを加え、チューブを反転させて混合し、2秒間遠心し、氷上に60分間置きます。
  3. チューブを16,000 × g 、4°Cで1時間遠心分離することにより、RNAペレットを沈殿させます。
  4. チューブを回収し、ペレットに触れずに上清を慎重に取り除き、ペレットを真空乾燥させてから、5.6 μLのヌクレアーゼフリーH2Oに再懸濁します。
  5. 3 μL の 5x ファーストストランドバッファー、4.2 μL の 10x dNTP(それぞれ 2 mM)、および 1.5 μL のジチオスレイトール (DTT) をチューブに追加して、RT 反応をセットアップします。フリックして混ぜ合わせ、2秒間回転させます。
  6. 反応を90°Cで30秒間正確にセットアップし、チューブを50°Cのブロックに2分間移します。
  7. 溶液に0.75 μLの逆転写酵素を加え、フリックして混合し、50°Cで35分間セットしてRT反応を開始します。
  8. チューブを95°Cで1分間移し、酵素とcDNA/RNA鎖を変性させた後、RNaseフリーのH2O95 μLを加え、チューブをフリックして混合し、氷上に2分間置きます。このチューブには、16個のRNAサンプルから生成されたcDNAが含まれており、それぞれが3'で個別にバーコード化されています。

7. PCR検査と大規模増幅の実施

  1. 304 μLのヌクレアーゼフリーH2O、125 μLの2 M KCl、50 μLの1 M Tris pH 8.0、1 μLの1 M MgCl2、1% Triton X-100 5 μL、および6 μLの1 M 2-メルカプトエタノールを氷上に保存できるチューブに組み合わせて、新鮮な10x PCRバッファーを調製します。
  2. 67 μL のヌクレアーゼフリー H2O と 10 μL の 10x PCR バッファー、10 μL の 10x dNTP、0.5 μL の 100 μM 5' PCR プライマー、0.5 μL の 100 μM 3' PCR プライマー、10 μL の cDNA ストックライブラリを組み合わせて、ステップ 6.8 (上記) で作製した cDNA のパイロット/テスト PCR 反応を組み立てます。 2 μL の 50x Taq ポリメラーゼを新鮮な PCR チューブに入れます。
    注:PCR増幅を行う前に、次のように2つの異なるファイルを設定して装置をセットアップします:ファイル#1の場合:94°Cで45秒、50°Cで85秒、72°Cで60秒で12サイクル、および4°C;File#2の場合:94°Cで45秒、50°Cで85秒、72°Cで60秒で2サイクル、および4°C。
  3. パイロット/テストPCR反応の場合は、100 μLのPCR反応液が入ったPCRチューブをThermocyclerに入れ、File#1を実行します。
  4. File#1が完成したら、PCRチューブを開き、反応液12 μLを3 μLの5倍ゲルローディング色素を含む1.5 mLの微量遠心分離機に移します。チューブを閉じ、キャップに「12サイクル」と書き込みます。
  5. PCRチューブをサーモサイクラーにセットし、File#2を開始します。
  6. File#2が完成したら、PCR反応液12 μLを5x gel Loading色素3 μLが入った1.5 mLチューブに移し、キャップに「14 cycles」と記入します。
  7. 各増幅の最後に12 μLのPCR産物を移しながら、PCR増幅をさらに4回連続して(つまり、各2回のPCRサイクル)繰り返し、16、18、20、および22サイクルとラベル付けされた4つの異なるチューブを取得します。
  8. 20 ntサイズのラダーと各PCR増幅産物を2.5%アガロースにロードし、ゲルを0.5x TBEで120 Vで30分間泳動します。
  9. プライマーダイマー(下側バンド)と増幅されたcDNA(上側バンド)の比率と存在に基づいて、最適なPCR増幅サイクルを特定します(図8A)。
    注:16サンプルの全RNAインプットが1 ng未満である可能性があることを考えると、プライマーダイマーは精製されたcDNAよりも迅速かつ大量に生成物を生成することが期待されます。したがって、適切なPCRサイクルは、一般に18〜22サイクルの間で選択されます。 図8Aでは、このライブラリの適切なPCRサイクルは20です。 図8Bでは、PCRコンストラクトのサイズが詳細に示されています。
  10. 適切なPCR増幅サイクルが特定されたら、陰性のPCR(cDNAなし)と4つの100μL陽性PCR反応(つまり、それぞれ12μLのcDNAを含む)を設定します。
    1. PCR反応の調製を簡素化するために、292.5 μLのヌクレアーゼフリーH2O、45 μLの10x PCRバッファー、45 μLの10x dNTP、3.25 μLの3' RT/PCRプライマー(図1B)、および2.25 μLの5' PCRプライマー(図1B)を組み合わせて、1.5 mLチューブにPCR Master Mix(すなわち、4.5反応用)をセットアップします。このチューブを反転させて混ぜ合わせ、回転させてチューブの底に集めます。
    2. PCR Master Mix86 μLを4本の0.5 mL PCRチューブのそれぞれに移します。
    3. 12 μLのcDNAライブラリー(氷上に保存)を加え、次に2 μLの50x Taqポリメラーゼを4本のPCRチューブのそれぞれに加え、ピペッティングで上下させて混合します。
    4. ヌクレアーゼフリーH2O77 μL、10x PCRバッファー10 μL、10x dNTPs10 μL、5' PCRプライマー0.5 μL、3' PCRプライマー0.5 μL、50x Taqポリメラーゼ2 μLを別々のPCRチューブに添加し、ピペッティングで上下させて混合し、テンプレート不要のPCR反応チューブを調製します。
    5. ステップ7.9で特定したPCRサイクルを使用してサーモサイクラーにPCRチューブをセットし、必要に応じて増幅するようにサーモサイクラーに新しいプログラムを設定します。
  11. 0.5x TBEとエチジウムブロマイドを含む2.5%アガロースゲルを調製し、各PCRチューブから12 μLを3 μLの5xゲルローディング色素を含む個々のチューブに移します。
  12. 3 μL のラダーを 9 μL のヌクレアーゼフリー H2O および 3 μL のゲルローディング色素と組み合わせて、20 nt ラダーを調製します。
  13. ゲルをロードし、120 Vで30分間分析し、4つの異なる反応間でPCR増幅が類似していること、およびテンプレートなしコントロールが空であることを確認します(図8C)。
  14. 4つのPCR反応を2本の1.5 mLシリコン化微量遠心チューブ(つまり、それぞれ90 μLの製品を含む2本のチューブ)で組み合わせ、2本のチューブそれぞれに18 μLの5 M NaClと800 μLの100%エタノールを加えます。
    1. チューブを反転させて混合し、-20°Cで保存して一晩沈殿させます。

8. PCR増幅ライブラリーの精製

  1. 混合陽性PCR反応を含む2本のチューブを16,000 × g で4°Cで60分間遠心分離します。
  2. 60分後、上清を取り除き、DNAペレットを真空乾燥させ、19.5 μLの1xバッファーに再懸濁した後、0.5 μLのPmeI酵素を加えます。
  3. PmeI消化物を37°Cで2時間セットアップし、隣接するウェル(19 nt-3'アダプター、24 nt-3'アダプター)またはRNAキャリア(RNA抽出キャリア、RNA post-3'ライゲーションキャリア)で実行されたDNAサイズマーカー、潜在的な汚染物質(つまり、補足ファイル1のRNAおよびDNAプライマーに含まれるPmeIサイトを参照)を除去します
  4. 2.5%アガロースゲルの3つの異なるウェルで0.5x TBEを使用して2つの消化物を泳動し、1つのウェルに過剰なプライマーダイマーが蓄積して塗抹標本が生じるのを防ぎます。
    1. 各消化物に3 μLの5倍ゲルローディング色素を加え、2つの消化物を結合し、16.5 μLを3つの隣接するウェルにロードします。
    2. ゲルの末端ウェルに20 nt DNAサイズのラダーをロードし、ゲルを150 Vで90分間泳動します(図8D)。
  5. DNAライブラリーを精製するには、ゲルの隣接する3つのレーンから上部PCRバンドを切り出し、それらを新鮮な1.5 mLチューブに移します。
  6. メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用してPCR増幅ライブラリーを精製し、メーカーの指示に従って蛍光光度計を使用して精製されたDNA産物を定量します。

9. シーケンサーに対応したバーコードを追加するための最終PCR増幅

  1. ステップ7.1で説明したような新鮮な10x PCRバッファーミックスを調製します。
  2. 1 つのネガティブコントロール(アンプリコンなし)と、最初の PCR 増幅から精製した 0.75 ng の PCR 産物を 3 本のチューブのそれぞれに含めて 3 つの PCR 反応を次のように設定します。
    1. 75 μL の ddH2O、10 μL の 10x PCR バッファー、10 μL の 10x dNTP、1 μL の 5'2nd PCR プライマー (プライマー i503 (図 1B)) 1 μL、3' PCR 2nd プライマー 1 μL (プライマー i702 (図 1B)) 1 μL を混合して、3 つの個別の PCR 反応をセットアップします。 ゲル精製した1st PCR産物から0.75 ng)、および2 μLのTitanium Taqポリメラーゼ。
    2. 76 μL の ddH2O、10 μL の 10x PCR バッファー、10 μL の 10x dNTP、10 μL の 5'2nd PCR プライマー (プライマー i503 (図 1B)) 1 μL、3' PCR 2nd プライマー 1 μL (プライマー i702 (図 1B)) を混合して、陰性 PCR コントロール (つまり、DNA テンプレートなし) を設定します。 2 μL の Taq ポリメラーゼ。
    3. 72 °C で 3 分間、95 °C で 30 秒間、95 °C で 10 秒間、55 °C で 30 秒間、72 °C で 30 秒間、72 °C で 5 分間、10 °C で最終ホールドするようにプログラムされたサーモサイクラーで 4 つの PCR 反応 (つまり、ネガティブ コントロール 1 つ、ポジティブ 3 つ) を設定します。
  3. PCRサイクルが完了したら、反応混合物10 μLを採取し、ローディング色素3 μLを添加し、 図9Aに示すように2.5%アガロースゲルで生成物を20 ntラダーとともに評価します。
  4. PCR産物のサイズ(すなわち、図9Bおよび図6に示されているように、164 bpで動作する上部PCRバンド、最終コンストラクトのサイズと詳細)およびバンド分布を検証したら、PCR産物を2本のチューブに組み合わせ、各135 μLのPCR産物(すなわち、90 μL+ 45 μL)、13.5 μLの5 M NaClを添加します。 100%エタノール650μLを-20°Cで一晩沈殿させます。
  5. 翌日、2本のPCRチューブを16,000 × g で4°Cで60分間スピンダウンします。
  6. 各ペレットを乾燥させ、19.5 μLの1x PmeIバッファーで再懸濁し、0.5 μLのPmeIを37°Cで2時間加えて、隣接するウェル(19 nt-3'アダプター、24 nt-3'アダプター)またはRNAキャリア(RNA抽出キャリア、RNA post-3'ライゲーションキャリア)の汚染物質をさらに除去します。
  7. 消化産物を2.5%アガロースゲルの3つのウェルにセットし、150 Vで90分間分離します。
  8. 164 bp(図9C)で動作する上部バンドを切除し、DNA単離キットを使用してDNA産物を精製し、蛍光光度計で定量します。
  9. DNAチップ上で最終PCR産物を解析し、ライブラリーのサイズ、濃度、純度を検証してから、希釈してシーケンサーを使用して解析します。
  10. FASTQデータファイルをRNAworldパイプラインに転送して、アダプターのトリミング、逆多重化、ヒトゲノムへのアライメントを、前述の通り、miRNA解析に先立って行う41。あるいは、 補足ファイル3に示されているスクリプトを使用して、FASTQファイルからリードを逆多重化し、選択したsmall-RNA分析パイプラインを使用してさらにプロセスを進めます。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上記のプロトコルで詳述されているように、最大16の個々の小さな細胞外小胞(sEV)RNAサンプルの同時処理(すなわち、小さなノンコーディングRNAおよびmiRNAの分析用)について説明し、これらは3'バーコード化を受けた後、単一のライブラリ内で一緒に分析されます。私たちの分析のために選択されたsEVは、前述の37,40のように、ジャージーショア大学医療センター(IRB#Pro2018-0425)でトリプルネガティブ乳がんと診断された女性から採取された45mLの血漿から超遠心分離によって分離されました。分離後、超遠心分離したsEVは、透過型電子顕微鏡、ナノ粒子追跡分析、および蛍光超解像ナノイメージングを使用して、希釈、分注、RNA抽出、およびcDNAライブラリ調製の前に、MISEV2023ガイドライン42に従って検証されました。TEM解析の結果、高濃度のsEV集団が得られ(図2)、その大きさはナノ粒子分析装置(

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、小さな細胞外小胞(sEV)から効率的に単離されたマイクロRNA(miRNA)を含むノンコーディングRNAの再現性と感度の次世代シーケンシング(NGS)のためのcDNAライブラリ調製プロトコルを開発しました。全球的に単離されたsEVまたは選択的に単離されたsEVから回収できる低分子のノンコーディングRNAおよびmiRNAは限られていることを考慮し、sEVのmiRNAカーゴの再現性と感度の高い解析を可能にするcDNAライブラリー調製手順の最適化を目指しました。

sEV-RNAを効率的かつ選択的に単離する前の最初のステップとして、非sEV RNA汚染物質を除去するためのRNAse-A処理ステップが必要です。タンパク質結合RNA配列の除去ができない可能性があることに注意することが重要ですが、sEVからRNAを消化する可能性もあり、構造的に損なわれる可能性があることに注意することが重要です。第2のステップとして、sEV-RNAの回収率を最大化するために、TRizol/Qiazol RNA溶解バッファーの下層相(すな...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O.L.は、EValuate Diagnostics, Inc.の無職の創設者であり、同社の株式の割合はわずかです。他の著者には、宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Thomas Tuschl博士の研究室には、彼らのサポートと、彼らの研究室で開発されたオリジナル技術へのアクセスを提供してくださったこと、そしてRNAworldパイプラインへのアクセスを許可してくださったことに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1% トリトン X-100 InvitrogenHFH10
10 mM ATP アンビオンAM8110G
10x dNTP アンビオンAM8110G
10x TBEサーモフィッシャー サイエンティフィ15581044
14 M メルカプトエタノールΣO3445I-100 
20 ntのはしご イエナバイオサイエンスM-232S
20 mg / mLウシ血清アルブミンシグマB8894-5ML 
50x チタンTaq クロンテック・ラボラトリーズ 
過硫酸アンモニウムフィッシャーサイエンティフィック 7727-54-0
ブルーライト トランスイルミネーター - セーフ イメージャー 2.0 サーモフィッシャーG6600
BRL垂直ゲル電気泳動システム、ガラスプレートと櫛付きGIBCOV16
ジメチルスルホキシド(DMSO)シグマD9170-5VL
エッペンドルフ微量遠心分離機5424R米国科学4054-4537Q
エッペンドルフサーモミキサー米国科学4053-8223Q
フィルターチューブ付き5mmフィルターISTエンジニアリング(株)5388-50
フィッシャーブランド シリコン化低保持マイクロ遠心チューブ 1.5 mLフィッシャー サイエンティフィック02-681-320
ゲル ブレーカー チューブ 0.5 mLIST Engineering Inc.3388-100
ゲル電気泳動装置 7 cm x 10 cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combsBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 シーケンサー Illumina20047256
Jersey-Cote(シリコンベースのソリューション)LabScientific, Inc. 1188
KCl 2 MAmbionAM9640G
MgCl2 1 MAmbionAM9530G
Minifuge デュアルローター 個人用遠心分離機USA scientific2641-0016
モデル V16 ポリアクリルアミドゲル電気泳動装置、ガラス、櫛、スペーサーCiore Life Science21070010
OligonucleotidesIDTは、ゲル
トレイと櫛付きOwl EasyCast B2ミニ電気泳動システム&
Qiagen28704
Qubit FluorometerThermofisher ScientificQ33238
制限酵素 PmeI および 10x Cut Smart BufferNEBR0560S
逆転写酵素 - SuperScript IIIThermoFisher12574026
RNase-free water アンビオンAM9932
シェーカー-エッペンドルフサーモミキサーッペンドルフ5385000024
SeaKem LEアガロース ロンザ50002
上付き文字 III 逆転写キット Invitrogen18080-044
SYBR GoldLife Technologies S11494
チタンTaqポリメラーゼタカラ639208
T4 RNAリガーゼ1 NEBM0204S
T4 RNA リガーゼ 2 切断 K227Q NEB0351L
TEMEDフィッシャーサイエンティフィック O3446I-100
加熱蓋付きテモサイクラーApplied Biosystem4359659
Tris 1 M pH 7.5 Invitrogen15567027
Tris 1 M pH 8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel システム濃縮液、希釈剤、およびバッファーNational DiagnosticsEC-833
ック 639208nbsp;注文中に定義されました。エ

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